Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này có thể áp dụng để xác định các hợp chất: tetracyline (TC), oxytetracyline (OTC) và chlortetracyline (CTC) Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 mgkg. 2. Nguyên tắc Các kháng sinh nói trên trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo SepPak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định bằng hệ thống HPLC với detector UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8349:2010 THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLINE ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Fish and fishery products − Determination of tetracyclines residues − Method using highperformance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 8349 : 2010 Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp áp dụng để xác định hợp chất: tetracyline (TC), oxytetracyline (OTC) chlortetracyline (CTC) Giới hạn phát phương pháp 10 µg/kg Nguyên tắc Các kháng sinh nói mẫu thủy sản chiết tách dung dịch đệm (pH 4) Dịch chiết làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) cột tách chiết pha đảo Sep-Pak Cartrige C18 Hàm lượng TC, OTC, CTC có dịch chiết xác định hệ thống HPLC với detector UV bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC nước có độ tinh khiết tương đương 3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC 3.2 Axetonitril, loại dùng cho HPLC 3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm phân tử nước metanol (3.1) bình định mức 000 ml (4.2) Định mức tới vạch Dung dịch axit oxalic-metanol không bền, pha trước sử dụng 3.4 Dung dịch đệm McIlvaine, pH 4,0 ± 0,05, chuẩn bị sau: Hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan nước bình định mức dung tích 000 ml (4.2), định mức tới vạch, thu dung dịch A Hoà tan 21,0 g axit xitric ngậm phân tử nước nước bình định mức (4.2), định mức tới vạch, thu dung dịch B Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 000 ml dung dịch B Chỉnh pH tới 4,0 ± 0,05 cách cho giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M dung dịch NaOH nồng độ 0,1 M (sử dụng máy đo pH) Dung dịch đệm McIlvaine bền vòng tuần nhiệt độ phòng 3.5 Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA Hoà tan 60,5 g dinatri etylendinitrilotetraaxetat (EDTA) ngậm phân tử nước vào 625 ml dung dịch đệm Mcllvaine (3.4) Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA bền vòng tuần nhiệt độ phòng 3.6 Pha động cho HPLC Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm phân tử nước nước bình định mức 000 ml (4.2) Định mức tới vạch Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (3.2) 166 ml metanol (3.1) Lọc đuổi khí Dung dịch pha động không bền, pha trước sử dụng 3.7 Các dung dịch chuẩn gốc tetracycline, 000 µg/ml Cân 108 mg ± 0,1 mg loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi giấy chứng nhận) vào bình định mức dung tích 100 ml (4.2) riêng biệt Hòa tan định mức tới vạch 100 ml metanol (3.1) Bảo quản dung dịch kháng sinh chuẩn gốc nhiệt độ −20 0C Các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc bền vòng tháng 3.8 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp tetracycline, 100 µg/ml Hút xác 10 ml dung dịch kháng sinh chuẩn gốc (3.7) vào bình định mức 100 ml (4.2) Định mức tới vạch metanol (3.1) 3.9 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp tetracycline, 25 µg/ml Hút xác 2,5 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (3.8) vào bình định mức 10 ml (4.2) Định mức tới vạch metanol (3.1) Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ 0C đến 0C Dung dịch bền vòng tuần 3.10 Dung dịch chuẩn hỗn hợp tetracycline, 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 1,00 µg/ml Hút xác 20; 40; 100; 200 400 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (3.9) vào bình định mức 10 ml (4.2) Thêm ml dung dịch axit oxalic-metanol (3.3) vào bình Định mức tới vạch nước Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ 0C đến 0C Dung dịch bền vòng tuần Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg 4.2 Bình định mức, dung tích 10; 100 000 ml 4.3 Pipet, tự động điều chỉnh từ ml đến10 ml 4.4 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 50 ml 4.5 Xơranh thủy tinh, dung tích 100 ml 4.6 Phễu Buchner, đường kính 5,5 cm 4.7 Giấy lọc 4.8 Dụng cụ đo pH 4.9 Máy ly tâm, tốc độ 000 r/min, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml 4.10 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min 4.11 Bể siêu âm 4.12 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml 4.13 Cột sắc ký pha đảo C8, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm 4.14 Cột sắc ký pha đảo C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm 4.15 Hệ thống HPLC, trang bị detector UV Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Cân 5,00 g ± 0,05 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.4) thứ Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống nghiền 30 s máy nghiền (4.10) Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm (4.9) 10 tốc độ 000 r/min 5.1.2 Gạn dịch ống thứ vào ống ly tâm thủy tinh (4.4) thứ Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn đều, ly tâm ống 10 tốc độ 000 r/min lại gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ 5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn ly tâm ống 10 tốc độ 000 r/min Tiếp tục gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ 5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 20 tốc độ 000 r/min Sau đó, lọc dịch qua giấy lọc (4.7) phễu Buchner (4.6) Rửa ống ly tâm lần, lần rửa sử dụng ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA (3.5) 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thủy sản xác định kháng sinh thuộc nhóm tetracycline Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (3.9) vào 5,00 g mẫu trắng Đồng mẫu máy nghiền (4.10) Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1 5.4 Làm dịch chiết 5.4.1 Chuẩn bị cột Nối cột Sep-Pak C18 (4.12) vào đầu xơranh thủy tinh dung tích 100 ml (4.5) Thêm 20 ml metanol (3.1), 20 ml nước vào xơranh thủy tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột 5.4.2 Làm dịch chiết 5.4.2.1 Cho dịch chiết ống ly tâm thu theo 5.1.4, 5.2 5.3 vào cột Sep-Pak chuẩn bị theo 5.4.1 Tráng rửa bình chứa 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) Trong giai đoạn này, kháng sinh nhóm tetracycline hấp phụ lên bề mặt hạt rắn chứa cột Chú ý không cột Sep-Pak khô hai giai đoạn chuẩn bị cột làm dịch chiết Điều chỉnh cho dịch chảy khỏi cột giọt 5.4.2.2 Cho 20 ml nước vào xơranh thủy tinh cho chảy qua cột Loại bỏ dịch chảy khỏi cột Làm khô cột dòng không khí 5.4.2.3 Giải hấp kháng sinh nhóm tetracycline cách cho 6,0 ml dung dịch axit oxalicmetanol (3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/min Thu dịch khỏi cột vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch (thể tích V) nước Tiến hành phân tích dịch thu HPLC theo 5.5 5.5 Tiến hành phân tích HPLC 5.5.1 Điều kiện phân tích – cột sắc ký: cột pha đảo C8 (4.13); – nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng; – pha động: hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitril (3.6); – tốc độ dòng: 1,2 ml/min; – bước sóng cài đặt cho detector UV: 350 nm; – thể tích tiêm: 60 µl 5.5.2 Ổn định cột sắc ký 30 pha động (3.6) 5.5.3 Tiêm dung dịch kháng sinh chuẩn (3.10) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính chiều cao pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ ( µg/ml) loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính (y = ax + b) Đường chuẩn kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,995 5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC theo qui định 5.5.3 Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình CHÚ THÍCH: Sau phân tích xong, làm hệ thống HPLC (bao gồm cột sắc ký) hỗn hợp: nước - metanol (3.1) - axetonitril (3.2) theo tỷ lệ 7:1:2 (thể tích) 30 5.5.5 Đối với mẫu chứa 0,5 µg/g kháng sinh nhóm tetracycline, phải kiểm tra xác nhận kết cách tiêm lại dịch chiết mẫu dung dịch kháng sinh chuẩn cột C18 (4.14) chạy chế độ cột C8 (4.13) so sánh thời gian lưu pic mẫu pic chuẩn Tính kết Hàm lượng kháng sinh nhóm tetracycline có mẫu thử, C, biểu thị microgam kilogam (µg/kg) tính theo công thức sau: Y hiệu số chiều cao pic dịch chiết chiều cao pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài; a, b hệ số đường chuẩn y = ax + b; V thể tích dịch chiết thu sau làm (xem 5.4.2.3), tính mililit (ml) m khối lượng mẫu sử dụng (xem 5.1.1), tính gam (g) Độ lặp lại độ thu hồi 7.1 Độ lặp lại Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo chiều cao pic sắc ký lần tiêm dung dịch kháng sinh chuẩn phải nhỏ 0,5 % 7.2 Độ thu hồi Độ thu hồi, R, xác định cho lần chạy mẫu phải lớn 80 % Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; d) thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] AOAC 995.09 Chlortetracycline, Oxytetracycline and Tetracycline in Edible Animal Tissues Liquid Chromatographic Method ... Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp tetracycline, 100 µg/ml Hút xác 10 ml dung dịch kháng sinh chuẩn gốc (3 .7) vào bình định mức 100 ml (4 .2) Định mức tới vạch metanol (3 .1) 3.9 Dung dịch chuẩn làm việc... gốc tetracycline, 000 µg/ml Cân 108 mg ± 0,1 mg loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi giấy chứng nhận) vào... chuẩn làm việc hỗn hợp tetracycline, 25 µg/ml Hút xác 2,5 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (3 .8) vào bình định mức 10 ml (4 .2) Định mức tới vạch metanol (3 .1) Bảo quản dung dịch