Nghiên cứu, xác định hàm lượng vitamin D trong nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH VÕ QUỐC OAI 1.1. NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Mai Thị Thanh Huyền 2 Vinh, 2014 Lêi c¶m ¬n Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên đề Hóa phân tích - Khoa Hóa học - trường Đại học Vinh. Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Trường Đại học Vinh, phòng đào tạo sau đại học, Trung Tâm Thực Hành thí nghiệm trường Đại học Vinh, trường THPT Mai Thúc Loan và các đồng nghiệp, nhóm cộng tác nghiên cứu - phân tích vitamin D trong nấm. Đặc biệt tác giả gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Mai Thị Thanh Huyền đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài. Tác giả rất mong nhận được sự đóng góp, phê bình của quý thầy cô, các nhà khoa học, đọc giả và các bạn đồng nghiệp. 3 MỤC LỤC VÕ QUỐC OAI 1 Vinh, 2014 2 Hệ thống các kí hiệu viết tắt 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 7 CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 4 Hệ thống các kí hiệu viết tắt 25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D 25(OH)D 2 : 25-hydroxyl vitamin D 2 25(OH)D 3 : 25-hydroxyl vitamin D 3 BHT : butylate hydroxytoluen. BSTFA :N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide DM : Chất khô (dry matter). ECLIA : Phân tích miễn dịch quang hóa (electro chemiluminescence immunoassay ) EtOH : Etanol FTIR : Phép phân tích Fourier hồng ngoại (Fourier transform infrared) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao IT : Bẫy ion ( Ion trap) IS :Chất nội chuẩn (internal standard) LC : Sắc kí lỏng (Liquid chromatography) MeOH : Metanol MS : Phổ khối (Mass spectrometry) MTBE : Methyl-tert-butyl ether. PFP : Pentafluorophenyl-propyl RIA : phân tích miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay) SPE : chiết pha rắn (Solid Phase Extraction) UPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao UV : Tia tử ngoại DAD : Đầu dò mảng diot RMSE : Độ lệch khởi động (root mean square error). 5 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài. Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt so với những loại khác. Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của con người, như nó đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sự ổn định của xương, răng, nó tham gia vào điều hòa chức năng của một số gen, ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiết của insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới. Một số nghiên cứu mới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăng trưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng [14],[22]. Tình trạng thiếu vitamin D trên thế giới cũng như các nước nhiệt đới rất nghiêm trọng [24]. Theo một số nghiên cứu tình hình thiếu vitamin D trên thế giới là 40-50%, ở Thái lan và Malayxia 50%, Nhật và Hàn Quốc 80-90%, nước bắc Âu và bắc Mỹ khoảng 50-70% và 63% ở phụ nữ châu Á. Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu mới nhất về tình trạng thiếu dinh dưỡng của học sinh tiểu học thì hơn 50% học sinh tiểu học thiếu hụt vitamin D. Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc với ánh nắng có lợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày. Nấm là là một trong những nguồn thực phẩm giàu vitamin D 2 và dinh dưỡng có vai trò quan trọng trong xây dựng khẩu phần vitamin D 2 hàng ngày. Tuy nhiên nguồn nấm trên thị trường rất đa dạng về chủng loại và nguồn gốc, nhiều loại nấm không rõ nguồn gốc, không đảm bảo chất lượng tràn lan trên thị trường. Hơn nữa những đánh giá về giá trị dinh dưỡng chung cũng như hàm lượng vitamin D của các loại nấm trên địa bàn Nghệ An, Hà Tĩnh đang còn hạn chế. 6 Vì vậy việc phân tích hàm lượng vitamin D 2 trong nấm là cần thiết, vừa để xây dựng một quy trình định lượng chúng trong nấm, vừa để góp phần đánh giá hàm lượng vitamin D 2 có trong nấm góp phần xây dựng bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm địa phương. Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D trong thực phẩm, trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép phân tích với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Từ những kết quả nghiên cứu về vitamin D nói chung và vitamin D 2 trong nấm nói riêng cũng như trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, với mong muốn xây dựng một phương pháp phân tích phù hợp và quy trình xử lý mẫu hiệu quả trên đối tượng nấm để phân tích vitamin D tôi đã chọn đề tài “ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)”. 2. Mục đích nghiên cứu. Xây dựng quy trình phân tích vitamin D 2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số mẫu nấm. 3. Mục tiêu nghiên cứu + Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ, độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp. + Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D 2 trong một số loại nấm trước và sau khi chiếu xạ bằng tia UV. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các mẫu nấm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh, Hà Tĩnh và một số loại nấm tự nhiên ở vườn quốc gia Pù Mát. 7 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.2. Vitamin D. 1.2.1. Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi Vitamin là nhóm chất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào và chúng có khả năng ở nồng độ thấp hoàn thành chức năng xúc tác ở cơ thể sinh vật. Vitamin D được xếp trong nhóm vitamin hòa tan trong dầu béo cùng với vitamin A, vitamin E, vitamin K. Vitamin D được phát hiện năm 1922 được phân lập năm 1932 tìm ra cấu trúc năm 1936 đến năm 1959 được tổng hợp nhân tạo [11]. Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm các hợp chất sterol có cấu trúc tương tự nhau, có hoạt tính phòng ngừa hoặc điều trị còi xương nhờ làm tăng khả năng hấp thu canxi và photphat ở đường ruột. Các hợp chất đó bao gồm: vitamin D 2 (ergocalciferol), vitamin D 3 (cholecalciferol), và các vitamin D 4 , D 5 , D 6 , D 7 . Cấu trúc của các dạng vitamin được trình bày trong hình 1.1. Đối với người các hợp chất quan trọng nhất trong nhóm vitamin D là vitamin D 3 và vitamin D 2 được đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa và các biện pháp y tế khác. Cơ thể cũng có thể tổng hợp vitamin D ở da từ cholesterol, khi da được tiếp xúc với tia UV (có trong ánh nắng mặt trời) vì thế nó còn được mệnh danh là "vitamin ánh nắng" [18]. Mặc dù vitamin D thường được gọi là một vitamin, nhưng theo nghĩa hẹp thì nó không phải là một vitamin thiết yếu trong chế độ ăn, bởi vì hầu hết động vật có vú trong tự nhiên đều có thể tự tổng hợp đủ cho cơ thể khi tiếp xúc hợp lý với tia nắng mặt trời. 8 Hình 1.1 Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D 1.2.2. Vai trò của vitamin D đối với cơ thể Vitamin D đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của xương. Vitamin D có vai trò quan trọng với sự hấp thụ canxi ở ruột mà canxi rất cần thiết cho hoạt động của tim, cơ bắp và thần kinh, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên xương và răng, đồng thời cũng không thể thiếu để tham gia vào quá trình đông máu. Trẻ em khi thiếu canxi sẽ chậm lớn, lùn, còi xương, xương biến dạng, răng không đều, răng dị hình, chất lượng răng kém và bị sâu [15], [21]. Người lớn thiếu vitamin D có thể dẫn đến bệnh loãng xương [21]. 9 Một lượng nhỏ vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp, vitamin D giúp làm tăng khả năng miễn dịch, ngừa một số bệnh ung thư phổ biến, làm chậm quá trình phát triển ung thư đặc biệt là ung thư gan, ung thư đại trực tràng [10], [12], [19]. Thiếu vitamin D trong thai kì có thể sinh con nhẹ cân, đặc biệt nếu thiếu vitamin D trong 3 tháng đầu thai kì, con sinh ra bị hạn chế tăng trưởng gấp đôi, sự thiếu vitamin D trong thai kì gây ra những tổn thương não không thể phục hồi [30]. Trẻ em nếu không được cung cấp đủ vitamin D sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của xương, do chất xương và sụn không được vôi hóa đầy đủ, sụn phát triển không bình thường, làm xương biến dạng [30]. Các triệu chứng cho biết trẻ thiếu vitamin D: Thần kinh bị kích thích (quấy khóc, ngủ không yên giấc, hay giật mình, nhất là trẻ dưới 3 tháng), hay đổ mồ hôi trộm cả lúc trời lạnh, co giật khi sốt cao, có thể có cơn khó thở với tiếng thở rít. Nặng hơn nữa, trẻ sẽ yếu cơ và có sự biến đổi ở xương đầu, lồng ngực, tay, chân, cơ - dây chằng và cột sống . Nếu thiếu vitamin D trẻ em sẽ bị còi xương; trẻ bị còi xương sẽ ảnh hưởng đến phát triển chiều cao và tầm vóc của trẻ sau này [10], [12], [15], [21]. Vitamin D cũng có ảnh hưởng đến nồng độ serotonin trong não, gây ảnh hưởng đến tâm trạng con người. Serotonin còn có tên gọi là hoóc môn hạnh phúc, suy giảm serotonin khiến tâm trạng buồn chán hoặc dễ cáu giận, không thể kiểm soát được cơn bốc đồng, do đó thiếu vitamin D kéo dài dễ dẫn tới trầm cảm[40]. Do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, chúng ta dễ bị thiếu hụt vitamin quan trọng này, dù có ăn chế độ lành mạnh và tập thể dục đều đặn [11] , [12]. 10 Thiếu vitamin D là bệnh đặc hữu dành cho người lớn. Một số lượng lớn các trẻ em và thanh thiếu niên khỏe mạnh cũng thiếu hụt vitamin D [20], [36]. Một nghiên cứu dựa trên dân số của 2.972 phụ nữ độ tuổi sinh đẻ Mỹ tìm thấy 42% phụ nữ Mỹ gốc Phi ở Mỹ có mức 25(OH)D < 15 ng/ml và 12% có mức <10ng/ml (1 ng/ml tương đương với 2,5 nmol/l) [30]. Theo các nghiên cứu cho thấy hàm lượng lý tưởng 25(OH)D trong máu cần thiết để ngăn ngừa bệnh còi xương và loãng xương là 15 ng/ml,mức cần thiết để tối ưu hóa sự hấp thu canxi ở ruột là 34 ng/ml. Gần đây đã phát hiện ra rằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể ảnh hưởng đến việc giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh ung thư nội tạng và trên 33ng/ml sẽ giảm 50% nguy cơ ung thư đại tràng và ở mức độ 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú [11], [12]. 1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể Cơ thể người có thể nhận được vitamin D trong 3 cách: qua da, chế độ ăn uống và bổ sung bằng thuốc. Có lẽ vì vitamin D mang nghĩa của từ 'vitamin', hầu hết mọi người hiểu sai về nó cũng giống như các vitamin khác, có nghĩa là, họ có thể có được lượng đầy đủ bằng cách ăn một chế độ ăn uống tốt. Tuy nhiên, hầu hết chế độ ăn uống tự nhiên con người có chứa ít vitamin D, trừ khi những chế độ ăn giàu nguồn gốc hoang dã, cá béo. Một lượng nhỏ vitamin D có trong thực phẩm tăng cường, bổ sung như sữa, nước cam và các loại ngũ cốc tại Mỹ, và bơ thực vật ở châu Âu, nhưng các nguồn cung như vậy thường là những nguồn đóng góp nhỏ cho nguồn vitamin D cơ thể. Theo truyền thống, nguồn vitamin D con người bắt đầu từ da, không phải bắt nguồn từ miệng [23], [30]. [...]... chuyển hóa hydroxyl vitamin D khác trong huyết thanh người [44] Trong bài báo này tác giả có đánh giá về các phương pháp thường d ng phổ biến nhất để định lượng vitamin D đó là phương pháp RIA, phương pháp LC-MS/MS và phương pháp HPLC Tác giả đã mô tả khá đầy đủ về quy trình thực hiện phương pháp xét nghiệm miễn d ch và nêu ra một số phương pháp xét nghiệm miễn d ch để định lượng vitamin D được FDA chấp... bởi FDA trong tháng 7/2012 Phương pháp miễn d ch enzyme cũng được sử dụng để phân tích vitamin D Vitamin D cho liên kết với protein đồng nhất, từ đó đo lường hàm lượng thực tổng cộng 25(OH )D Các tổ hợp liên kết protein - vitamin D có thể nhận diện vitamin D2 và D3 và cũng xác nhận hàm lượng tổng cộng 25-hydroxy D một cách chính xác Một phương pháp xét nghiệm miễn d ch có sẵn trên nền tảng ADVIA... định bằng sắc ký khí, phát hiện bằng phương pháp ion hóa ngọn lửa sau khi xà phòng hóa để thực hiện chiết lipid tổng, d ng sắc ký khí khối phổ (GC-MS) để kiểm tra định tính lại thành phần vitamin D 4 đã được định lượng bằng HPLC với đầu d UV sử dụng vitamin D 3 làm chất nội chuẩn Nấm portabella, nấm nút màu trắng, nấm crimini, nấm kim châm (Enoki), nấm Đông cô, nấm maitake, nấm hàu, nấm morel, nấm. .. các phương pháp hóa học sau để phân tích vitamin D trong thực phẩm Phương pháp AOAC 980.26: vitamin D trong các chế phẩm vitamin tổng hợp Phương pháp AOAC 981.17: vitamin D trong sữa tăng cường và sữa bột Phương pháp AOAC 982.29: vitamin D trong thực phẩm, các loại bột hỗn hợp và thức ăn chăn nuôi Phương pháp AOAC 992.26: vitamin D3 trong sữa công thức pha sẵn d nh cho trẻ em 19 Phương pháp. .. bú 13 1.3 Các phương pháp xác định vitamin D 1.3.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học [28], [34] Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương pháp thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được xác định bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu hụt vitamin D trong cơ thể Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, ví d như thử nghiệm... Phương pháp HPLC đầu tiên được giới thiệu để xác định vitamin D là phương pháp ngoại chuẩn [42], sau đó được giới thiệu phương pháp nội chuẩn [26] Tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ xác định được vitamin D3 và vitamin D2 mà không bao gồm d ng chuyển hóa 25(OH )D Một phương pháp HPLC để xác định 25(OH )D trong thịt được mô tả bởi Koshy and VanDerSlik (1977), tuy nhiên, không đồng thời xác định. .. ra trong quá trình định lượng vitamin D bằng cách sử d ng phổ dao động Lý do có thể là do giới hạn phát hiện của phương pháp này liên quan đến nồng độ vitamin D thường thấp trong thực phẩm Vitamin D có thể được định lượng bằng cách đo sự hấp thụ tia cực tím tối đa ở 264 nm Hạn chế của phương pháp này là các hợp chất hấp thụ tia cực tím khác trong mẫu đo sẽ can thiệp vào kết quả định lượng vitamin D. .. (d y khoảng 5 mm) sau khi chiếu xạ có hàm lượng vitamin D 2 cao hơn nấm thái lát thông thường Như vậy, sử dụng các xung cực tím cung cấp một phương pháp có hiệu quả cao để tăng nồng độ vitamin D2 trong nấm mỡ A Bisporus [41] 25 Katherine M Phillips và cộng sự đã xác định được vitamin D 4 trong quá trình phân tích vitamin D2 trong sắc ký đồ HPLC-UV của nấm ăn [32] Các sterol được xác định. .. nồng độ 25(OH )D Phòng thí nghiệm Abbott cung cấp một cách hoàn thiện phương pháp trên nền tảng phân tích miễn d ch tự động xác định hàm lượng 25(OH )D – phương pháp miễn d ch quang hoá học vi phân tử (CMIA) Phương pháp này được FDA chấp thuận năm 2011 Công ty Immuno Diagnostics cung cấp một phương pháp tự động phân tích miễn d ch CMIA, IDS-ISYS, để định lượng hàm lượng tổng 25(OH )D và d ng hydroxyl chuyển... của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu d i, độ tin cậy thấp so với các phương pháp khác 1.3.2 Phương pháp quang phổ Phổ hồng ngoại đã được sử d ng để phân tích định lượng của vitamin D Trong các pha rắn, vitamin D2 có thể được phân biệt với vitamin D 3 d a vào đỉnh phổ vitamin D2 tại 907 cm-1 [34] Phổ FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin D2 và D3 cũng đã được mô tả Không có phương pháp . ECLIA trong định lượng 25(OH )D [45]. 1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử d ng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong. hiệu quả trên đối tượng nấm để phân tích vitamin D tôi đã chọn đề tài “ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO( HPLC)”. 2. Mục đích nghiên. BỘ GIÁO D C VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH VÕ QUỐC OAI 1.1. NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Chuyên ngành: Hóa