1.7.1. Hóa chất
+ Metanol ( loại dùng cho HPLC của Merk) + n-hexan (loại dùng cho HPLC)
+ Dietyl ete(PA của Trung Quốc )
+ Chất chuẩn vitamin D2, D3 100mg của Supelco + Axetonitril (Loại dùng cho HPLC)
+ Etanol 960( Trung Quốc) + Axit ascobic (Merk) + KOH, NaOH (82%) + Nước cất đề ion.
Tất cả các hóa chất còn lại đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
1.7.2. Thiết bị và dụng cụ
+ Hệ thống HPLC Agilent 1100 Series với đầu dò UV.
+ Cột dùng cho phân tích LiChrospher®100 RP-18(5μm) 250-4mm Agilent.
+ Máy quang phổ UV – Vis: Agilent 8453 + Máy cất quay chân không: IKA® RV10 digital + Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H
+ Máy nghiền thực phẩm, hệ thống đun hồi lưu + Máy Vortex IKA- made in USA
+ Đèn UVB Exo –Terra
Dụng cụ: bình chiết 250ml, bình định mức (ml) 5; 10; 100. Pipet (ml) 1; 2; 5; 10. Pipet tự động định mức(μl) 100, 1000. Bình đáy tròn (ml) 250, 500. Bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh khác.
1.8. Thu thập và bảo quản mẫu
Các mẫu nấm khô được thu thập từ rừng quốc gia Pù Mát. Nấm sò được mua tại chợ Vườn Ươm-tp Hà Tĩnh có nguồn gốc sản xuất tại xã Thạch Đài, huyện Thạch Hà - tỉnh Hà Tĩnh. Nấm Đông Cô được mua tại chợ tỉnh Hà Tĩnh có nguồn gốc sản xuất từ huyện Đông Anh ngoại thành Hà Nội. Nấm thủy tiên nâu, nấm kim châm được mua tại siêu thị Ocean mart Hà Tĩnh có xuất xứ Nhật Bản và Trung Quốc. Nấm sau khi thu hoạch được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Một số mẫu được chiếu xạ bằng đèn UVB.
Hình 2.2 Nấm khô được thu hoạch từ vườn quốc gia Pù Mát. 1.9. Xử lý mẫu.
Các mẫu nấm tươi được đem chiếu xạ bằng đèn UV tổng hợp Extra (225 µw/cm2) trong vòng 2 giờ sau đó đem bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
Các mẫu phân tích được nghiền nhỏ bằng máy xay chuyên dụng, sau đó xà phòng hóa mẫu theo phương pháp kiềm nóng bằng phương pháp [46] đã được chỉnh sửa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Hỗn hợp gồm 5 – 10 g mẫu nấm đông lạnh (đã được nghiền), 4ml natri ascobat (17,5 g ascobic+100 ml NaOH), 50 ml etanol, 3 g KOH, cho vào bình cầu đáy tròn và votex trong 30 phút. Tiến hành đun hồi lưu ở 70-800C trong vòng 1 giờ sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, thêm vào 50 ml nước và được chiết 3 lần với 50 ml hỗn hợp dietyl ete: n-Hexan (1:3 v/v). Dịch chiết thu được được chiết lại bằng dung dịch KOH 3% pha trong etanol 5% sau đó rửa bằng nước đề ion cho đến khi trung tính.
Dịch chiết đem vào cô quay chân không sau đó tái hòa tan trong dung môi pha động MeOH, phối hợp với siêu âm để quá trình hòa tan được triệt để. Dung dịch thu được được lọc qua đầu lọc cỡ 45μm sau đó đem đi phân tích.
1.10. Chuẩn bị dung dịch vitamin D2 cho phép đo HPLC
5-10g mẫu + 4ml natri ascobat+50ml etanol+3g KOH
Vortex 30 phút
Đun hồi lưu 70-80 0C, 1 giờ
Làm lạnh, +50ml nước
Chiết 3 lần với 50ml (hexan: diety ete)(3:1)
Cô quay chân không
Định mức trong 5ml MeOH
Chạy sắc ký
Dự kiến pha các dung dịch chuẩn nồng độ (ppm): 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 40; 50; 100; 200; 1000. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha chuẩn gốc: cân 10 mg trên cân phân tích có độ chính xác 10-5g pha trong bình định mức 100 ml thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 100 ppm, lưu giữ trong ngăn đá tủ lạnh.Các dung dịch làm việc được pha chế trong ngày bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc sử dụng các bình định mức khác nhau, pha thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20, 50) bằng metanol.
1.11. Lựa chọn và cài đặt, vận hành thiết bị HPLC
Lựa chọn cột LiChrospher 100 RP-18(5 μm) 250-4 mm Agilent dùng cho khảo sát tối ưu hóa pha động, nhiệt độ, tốc độ dòng.
- Giá trị trên của áp suất 400 bar: mục đích bảo vệ bơm, hệ thống khi xảy ra sự tăng áp suất đột ngột,
- Giới hạn dưới của áp suất 1bar (P.MIN) nhằm mục đích không cho không khí vào hệ thống khi có sự cố hở trên hệ thống và an toàn khi đo.
- Lưu lượng pha động (FLOW RATE): 1mL/phút - Thể tích tiêm mẫu tự động: 10 μl
1.12. Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích
Pha động trước khi bơm vào cột phải được loại khí bằng siêu âm. Khi đưa dung môi vào hệ thống pha động phải mở van áp suất chạy ở tốc độ dòng 5ml/phút trong khoảng thời gian 5 phút để đuổi hết khí trong hệ thống ống dẫn pha động tránh tắc nghẽn hệ thống ống, đảm bảo tốc độ pha động ổn định.
Bơm pha động qua cột 20 – 30 phút chờ đến khi đường đồ thị ổn định thì lấy cân bằng và điều chỉnh tín hiệu hiển thị trên màn hình thuận lợi cho giám sát tín hiệu thì sẵn sàng cho việc chạy mẫu. Nếu tín hiệu quan sát trên màn hình không ổn định, xuất hiện nhiều tín hiệu nhiễu do cột bẩn thì rửa cột
bằng dung dịch axetonitrin : nước = 90 : 10 (V/V) trong 15 – 20 phút trước khi cho pha động chạy qua.
1.13. Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin D2 trong dung dịch
Tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch vitamin D2 ở nồng độ 5 ppm; 10ppm. Sử dụng cuvet thạch anh và quy trình quét phổ tự động trong vùng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm.
1.13.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động
- Khảo sát thành phần pha động với các tỷ lệ khác nhau của MeOH với nước theo các tỷ lệ thể tích dự kiến 100/0; 90/10; 80/20; 70/30; 50/50; 40/60. Tốc độ dòng giữ cố định 1mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL. Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 265 nm.
- So sánh diện tích peak, thời gian lưu, hình dạng sắc ký đồ thu được ở các hệ pha động khác nhau từ đó lựa chọn tỷ lệ pha động tối ưu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ dòng.
Dự kiến khảo sát với pha động lựa chọn với các tốc độ dòng: 0,8; 1,0; 1,2 (ml/phút)
1.13.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ
Dự kiến khảo sát với pha động và tốc độ dòng đã lựa chọn ở các nhiệt độ (0C): 20, 30, 40.
1.14. Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin D trong dung dịch
Pha chuẩn gốc: cân 10mg trên cân phân tích có độ chính xác 10-5 g pha trong bình định mức 10 ml thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000ppm, lưu giữ trong ngăn đá tủ lạnh.
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc sử dụng các bình định mức khác nhau, pha thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20, 50, 100) bằng metanol.
1.15. Phương pháp khảo sát đánh giá.
1.15.1.1. Định tính
Dựa vào thời gian lưu tR của cấu tử phân tích và thời gian lưu của chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích sắc ký. Tuy nhiên thời gian lưu không đảm bảo hai chất trùng nhau hoàn toàn, để đảm bảo hơn cho việc định danh có thể so sánh thời gian lưu của chất phân tích và chất chuẩn trên hai pha tĩnh khác nhau.
1.15.1.2. Định lượng
Diện tích Peak trên sắc ký đồ tỉ lệ với nồng độ của chất từ đó có thể tính được chính xác nồng độ của mỗi thành phần trong hỗn hợp. Có hai phương pháp dùng để định lượng là phương pháp ngoại chuẩn và phương pháp nội chuẩn. Chúng tôi lựa chon phương pháp ngoại chuẩn để định lượng vitamin D2
Phương pháp ngoại chuẩn
So sánh trực tiếp diện tích Peak của mẫu theo diện tích Peak của chất chuẩn từ đó suy ra nồng độ mẫu.
Trong phương pháp này dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cần xác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo diện tích mũi trên sắc ký đồ và nồng độ chất phân tích. Dựa vào đường chuẩn và diện tích mũi của chất cần phân tích trên sắc ký đồ có thể suy ra nồng độ chất cần phân tích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương trình đường chuẩn cho phương pháp ngoại chuẩn: A = kC + b
A: diện tích Peak
C: nồng độ chất phân tích
1.15.2. Khảo sát độ lặp lại
Độ lặp lại được dùng để đánh giá định lượng độ phân tán của các kết quả phân tích. Đại lượng này đặc trưng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
Đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hoặc độ biến động.
1.15.3. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
Giới hạn phát hiện (LOD: limit of detection) được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền. (LOD – xác định theo quy tắc 3σ. Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp.
LOD = tín hiệu chiều cao Peak/nhiễu đường nền ≥ 3.
Giới hạn định lượng (LOQ: limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất đo được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được với một RSD% quy định, thường LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền.
1.15.4. Xác định hiệu suất thu hồi
Đây là một thông số không thể thiếu được trong khi đánh giá một phương pháp phân tích.
Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thử, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực không có thêm chuẩn
S mâu mâu SO C C %X 100 C + − = × Trong đó:
%X: hiệu suất thu hồi
Cs+mâu: nồng độ tổng chuẩn thêm vào và mẫu thực có đo được.
Cmâu: nồng độ thực đo được.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN