1.16.1. Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin D2 trong dung dịch
Khảo sát phổ hấp thụ UV-VIS của dung dịch vitamin D2, ở nồng độ 5, 10 ppm. Sử dụng cuvet thạch anh và quy trình quét phổ tự động trong vùng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm. Kết quả cho thấy vitamin D2 có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 265 nm (Hình 3.1). Các nghiên cứu tiếp theo sẽ được đo ở bước sóng 265 nm.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS của vitamin D2
1.16.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động
Khảo sát hệ pha động 1: MeOH:H2O theo các tỷ lệ thể tích 100/0; 90/10; 80/20; 70/30; 50/50; 40/60. Tốc độ dòng giữ cố định 1mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL. Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 265 nm, nhiệt độ cột 30 0C
Kết quả cho thấy khi chạy với pha động 100% metanol cho thời gian lưu ngắn, tín hiệu mạnh, Peak sắc gọn cân đối (hình 3.2; hình 3.3.) .
Hình 3.2 Sắc kí đồ của vitamin D2 (100%MeOH)
Hình 3.3 Sắc kí đồ vitamin D2 với pha động (MeOH:H2O)(95:5)
Kết quả khảo sát pha động cho thấy chạy pha động với 100% metanol cho kết quả tốt, được lựa chọn cài đặt cho khảo sát tiếp theo.
1.16.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ dòng.
Khảo sát pha động 100 % MeOH với các tốc độ dòng (ml/phút): 0,8; 1,0; 1,2.
Với tốc độ dòng 0,8 (hình 3.4) Peak có thời gian gian lưu lớn (9,671) hơn tốc độ dòng 1 ( hình 3.2) tốc độ dòng 1,2 (hình 3.5) áp suất của cột tăng cao không an toàn cho chạy máy. Với tốc độ dòng 1,0 có thời gian lưu, áp suất ổn định phù hợp cho việc chạy máy an toàn.
Hình 3.5 Sắc ký đồ của vitamin D2 với tốc độ dòng 1,2ml/phút
Kết quả chọn tốc độ dòng 1,0ml/phút cho khảo sát tiếp theo.
1.16.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ
Khảo sát với pha động 100% MeOH và tốc độ dòng 1ml/phút ở các nhiệt độ (0C): 20, 30, 40.
Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 20 0C Peak có thời gian lưu lớn hơn ở nhiệt độ 300C (Hình 3.2). Ở nhiệt độ 400C Peak ra sớm hơn không đáng kể nhưng nhiệt độ không ổn định, thời gian làm ấm cột lâu. Chọn nhiệt độ cột 300C để lập phương pháp khảo sát.
1.16.5. Kết quả khảo sát phương pháp đo
Lập phương pháp chạy chuẩn vitamin D2 Thể tích bơm: 10 μl
Thành phần pha động: 100% metanol. Tốc độ pha động: 1 ml/phút
Nhiệt độ cột: 300C
Bước sóng của đầu dò: 265 nm.
1.17. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin D2
Khoảng tuyến tính là khoảng cách giữa nồng độ trên và nồng độ dưới của chất phân tích mà quan hệ của chiều cao hay diện tích Peak với nồng độ là tuyến tính.
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc thành dung dịch làm việc tiến hành chạy sắc ký với điều kiện đã nêu để xây dựng đồ thị liên quan giữa nồng độ chất phất tích và diện tích Peak.
Cho các mẫu chạy sắc ký và xác định diện tích Peak. Thu được kết quả theo bảng 3.1 :
Bảng 3.1. Liên hệ giữa nồng độ và diện tích của Peak
STT Nồng độ
(ppm)
Diện tích Peak
Thời gian lưu (phút)
Thời gian lưu trung bình 1 1 30,601 7,632 tR = 7,655 2 5 106,68 7,633 3 10 259,41 7,658 4 20 505,54 7,653 5 40 1057,94 7,664 6 50 1297,23 7,672 7 100 2693,534 7,671
Hình 3.7. Đường chuẩn vitamin D2
Phương trình đường chuẩn Data_B:
Y= A*X + B
Thông số Giá trị Sai số chuẩn (SE) ∆A
A B 26,965 -20,313 0,246 11,226 0,603 27,504 R Sy N 0,9995 1,618 7
Vậy phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng: Ai = (26,965 ± 0,603 )* X - (20,313±27,504)
Trong đó:
Ai là diện tích píc của chất phân tích X là nồng độ của vitamin D (ppm)
Hình 3.9. Sắc ký đồ vitamin D2 5ppm
Hình 3.11 Sắc ký đồ vitamin D2 20ppm
Hình 3.13 Sắc ký đồ vitamin D2 50ppm
Hình 3.15 Peak của các nồng độ vitamin D2 trong đường chuẩn xếp chồng lên nhau
1.18. Khảo sát độ lặp lại của máy
Độ lặp lại được dùng để đánh giá định lượng độ phân tán của các kết quả phân tích. Đại lượng này đặc trưng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận được trong những điều kiện giống nhau.
Để xử lý thống kê và đánh giá kết quả thực nghiệm sai số và độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi áp dụng các theo công thức sau:
- Độ lệch chuẩn:
Trong đó:
n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i k là số bậc tự do (k= n-1)
xi là giá trị phân tích lần thứ i
- Độ lệch tương đối: RSD =
- Độ chính xác ε: t là chuẩn Student Ta suy ra khoảng tin cậy của giá trị phân tích
x − ≤ ≤ +ε µ x ε
Đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hoặc độ biến thiên. Để đánh giá độ lặp lại của máy HPLC thực hiện chạy lặp lại liên tục 6 lần với một nồng độ chất chuẩn là 40 ppm và 20 ppm (bảng 3.2). Tính toán độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối theo diện tích của Peak sau mỗi lần chạy theo công thức sau:
Bảng 3.2 Độ lặp lại của máy HPLC
Nồng độ chuẩn bị (ppm) 20 40
Diện tích Peak 505,54 998.47
507,68 1048.14
498,23 1028.28
509,27 1003.88
496,68 984.91
506,84 1036.93
Diện tích Peak trung bình 504,04 1016,77
Độ lệch chuẩn: SD 5,25 24,65
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) 1,05 2,42
Độ chính xác: ε 1,09 6,23
Từ kết quả ở các bảng 3.2 ta thấy các giá trị thu được có độ lặp tương đối tốt vì giá trị Stt và RSD bé.
Khoảng tin cậy của giá trị phân tích của các phép đo hoàn toàn có thể đánh giá thông qua các giá trị x và ε tương ứng.
Hình 3.16 Sáu Peak khác nhau của dung dịch vitamin D2 40ppm 1.19. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 1.19.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện được xác định bằng nồng độ của chất phân tích mà tại đó chiều cao của Peak bằng ba lần chiều cao của đường nhiễu nền.
Giới hạn phát hiện được xác định theo đường chuẩn của phép đo HPLC theo công thức: LOD=(3,3xSD)/a
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu a: Độ dốc của đường chuẩn
LOD = 3,3 x 1,618/26,695 = 0,2 ppm
1.19.2. Giới hạn định lượng(LOQ).
Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử mà có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp với độ tin cậy 95%.
Phương pháp xác định LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu nền, giới hạn định lượng đuợc xác định bằng nồng độ của vitamin D2 mà tại đó tín hiệu sắc ký đồ của nó có được chiều cao bằng khoảng 10 lần chiều cao của nhiễu 0C
Như vậy có thể tính LOQ = 3,33xLOD. Vậy giới hạn định lượng của vitamin D2 là 0,66 ppm.
1.20. Xác định độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) của phép phân tích vitamin D2 trên mẫu nấm
Độ lệch chuẩn diễn tả độ lặp lại của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm.
Xác định độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên bằng cách tiến hành phân tích 3 mẫu của cùng một đối tượng nấm Sò trong cùng điều kiện (Hình 3.17). Tính kết quả hàm lượng vitamin D2 trong mẫu và xác định SD, RSD (%).
Trong đó xi là giá trị đo mẫu thứ i, là gía trị trung bình các lần phân tích, n là số lần phân tích.
Bảng 3.3 Hàm lượng vitamin D2 trong mẫu nấm Sò tươi
Stt Khối lượng mẫu(g) Thể tích dung dịch cuối(ml) Kết quả (μg/g) Kết quả trung bình (μg/g) SD RSD(%) 1 10 5 1,53 1.48 0,06 3,9 2 10 5 1,42 3 10 5 1,48
Hình 3.17 Sắc ký đồ của nấm Sò tươi 1.21. Xác định hiệu xuất thu hồi
Hiệu suất thu hồi của một quy trình phân tích biểu diễn sai lệch giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.
Bảng 3.4 Kết quả xác định hiệu xuất thu hồi
Tt Tên mẫu Khối lượng mẫu (g) Thể tích vitamin D2 5ppm thêm chuẩn (ml) Kết quả mẫu không thêm chuẩn (ppm) Kết quả mẫu thêm chuẩn (ppm) Hiệu suất thu hồi(%) 2 Nấm đông cô 10 2 3,06 4,78 86 4 Nấm sò 10 2 1,54 3,16 83
Hiệu suất thu hồi được xác định bằng cách tiến hành phân tích trên mẫu thực và mẫu nạp thêm chuẩn được thực hiện thời trong cùng điều kiện (lượng chuẩn thêm vào sao cho nồng độ cuối sau khi chiết xong nằm trong khoảng tuyến tính và có nồng độ gần với hàm lượng có trong mẫu). Kết quả thu được trong hai mẫu nấm đông cô tươi và nấm sò tươi sau khi đã được chiếu xạ, có độ thu hồi trung bình là 84,5%.
Từ những kết quả nghiên cứu trên, các điều kiện phù hợp để đo vitamin D2 bằng phương pháp HPLC được chỉ ra trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Tổng hợp các điều kiện phân tích vitamin D2 bằng phương pháp HPLC
Chất phân tích
Các yếu tố Vitamin D
Điều kiện sắc ký Tỉ lệ pha động (%) Methanol Cột sắc ký LiChrospher®100 RP-18 Dedector UV(nm) 265 Thể tích tiêm mẫu (μl) 10 Tốc độ dòng (ml/phút) 1,0
Giới hạn phát hiện LOD (ppm) 0,2
Giới hạn định lượng LOQ (ppm) 0,66
1.22. Kết quả phân tích một số mẫu nấm
Tiến hành phân tích một số mẫu nấm khô một số mẫu nấm tươi trước và sau khi chiếu xạ bằng đèn UV cho kết quả phân tích hàm lượng vitamin D2 ở bảng 3.6.
Bảng 3.6 Kết quả phân tích một số mẫu nấm
Stt Mẫu nấm Kết quả phân tích
(μg/g nấm tươi)
1 Nấm sò KPH
2 Nấm Sò sau chiếu xạ 1,54
3 Nấm đông cô 1,25
4 Nấm đông cô sau chiếu xạ 3,47
5 Nấm kim châm KPH
6 Nấm kim châm sau chiếu xạ 1,93
7 Nấm thủy tiên nâu trước chiếu xạ KPH
8 Nấm thủy tiên nâu sau chiếu xạ 0,93
9 Nấm 08 KPH
Từ kết quả thu được cho thấy hàm các mẫu nấm sau khi chiếu xạ có hàm lượng vitamin D2 tăng lên đáng kể so với trước khi chiếu xạ. Điều này được giải thích bởi quá trình tổng hợp vitamin D2 trong nấm từ estogerol (có hàm lượng đáng kể trong nấm) [39] .
Sắc ký đồ HPLC của một số mẫu nấm sau chiếu xạ
Hình 3.19 Sắc ký đồ của nấm kim châm
Hình 3.21 Sắc ký đồ phân tích của nấm Sò