Nghiên cứu định lượng nevirapin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )

Phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng có kết quả nhiều hoạt chất trong các chế phẩm đơn thành phần cũng như đa thành phần.. Từ các cơ sở trên chúng tô

BỘ YTẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẨN THỊ THU HIỂN

NGHIÊN cúu ĐỊNH UrỢNG NEVIR(iPIN TRONG CHẾ PHẨM RỒN PHÂN LIỀa BẻNG PHtfơNG PHÁP

(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001-2006)

TS NGUYỄN HẢI NAM

Noi thực hiện'. Phòng Hóa lý II- Viện Kiểm nghiệm

Thời gian thực hiện: 9/2005 đến 5/2006

HÀ NỘI, 5-2006

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hóa lý II - Viện Kiểm nghiệm Bộ Y tế và Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các thầy hướng dẫn, các giảng viên của Bộ môn Hóa dược và các cán bộ của phòng Hóa lý II - Viện Kiểm nghiêm

Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:

- Tiến sỹ Đoàn Cao Sơn - Trưỏng phòng Hóa lý II - Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tê

- Tiến sỹ Nguyễn Hải Nam - Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

là những người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, chỉ bảo cho tôi những ý kiến quỷ báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, các cô, các kỹ thuật viên Bộ môn Hóa dược và các cán bộ phòng Hóa lý II - Viên Kiểm nghiêm đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin cảm ơn sự quan tâm của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường

Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè và những người luôn sát cánh bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Sinh viên

Trần Thị Thu Hiền

A1K56

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN 1- TỔNG Q UA N 3

1.1 Tổng quan về nevirapin 3

1.1.1 Công th ứ c 3

1.1.2 Tính c h ấ t 3

1.1.3 Tác dụng dược l ý 3

1.1.4 Tác dụng không mong m u ốn 4

1.1.5 Một số chế p h ẩ m 4

1.1.6 Chỉ đ ịn h 5

1.1.7 Các phương pháp định lượng 5

1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 6

1.2.1 Khái niệm về sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng c a o 6

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc k ý 7

1.2.3 Cơ sở lý thuyết sắc k ý 8

1.2.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống H PL C 8

1.2.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và yếu tố ảnh hưởng 10

1.2.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc k ý 13

1.2.7 ứng dụng của H P L C 17

PHẦN 2- ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U 20

2.1 Đối tượng nghiên c ứ u 20

2.2 Phương tiện, dụng cụ, hóa ch ấ t 20

2.2.1 Hóa c h ấ t 20

2.2.2 Thiết bị, dụng c ụ 21

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứ u 22

2.3.1 Nội dung nghiên c ứ u 22

2.3.2 Phương pháp nghiên c ứ u 22

2.3.3 Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tíc h 22

2.3.4 Cách đánh giá kết q u ả 23

PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 24

3.1 Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng nevirapin và đánh giá phương pháp 24

3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiên sắc k ý 24

3.1.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ th ố n g 29

3.1.3 Khảo sát độ tuyến tính của phương p h áp 30

3.1.4 Khảo sát độ lặp lại của phương p h áp 31

3.1.5 Khảo sát độ đúng của phương p h áp 34

3.1.6 Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 38

3.2 ứng dụng định lượng nevirapin trong một sô chế phẩm 38

3.2.1 Chế phẩm đơn thành p h ầ n 39

3.2.2 Chế phẩm đa thành p h ầ n 39

3.3 Bàn luận về kết q u ả 40

PHẦN 4- KẾT LU Ậ N 42 PHỤ LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CHỮ VIẾT TẮT

AIDS : Acquired Immuno-Deficiency Syndrome

(Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) DAD : Diode Array Detector

(Detector chuồi diod)DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

HIV : Human Immuno-deficiency Virus

(Virus gây suy giảm miễn dịch ở người) HPLC: High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)MeOH: methanol

ĐẬT VẤN ĐỂ

HIV/AIDS- căn bệnh thế kỷ không còn là vấn đề của từng quốc gia mà

là vấn đề toàn cầu, một căn bệnh nguy hiểm mang tính xã hội cao Đây là căn bệnh mới được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1981 nhưng từ đó đến nay sốlưọìig người mắc bệnh và số người tử vong do HIV/AIDS ngày càng tăng, ở Việt Nam phát hiện trường hợp nhiễm HIV/AIDS đầu tiên vào năm 1990, tính đến 30/11/2002, số người nhiễm HIV là 57.780; số bệnh nhân AIDS là 8.643

và số người tử vong là 4.780 [1]

AỈDS (Acquired ỉmmuno-Deficiency Sỵndrome) là hội chứng suy giảm

miễn dịch mắc phải gây ra bởi HỈV (Human Ịmmuno-deficiency Virus) Cấu

trúc của HIV bao gồm lớp vỏ và lófp nhân, trong đó lớp nhân có chứa enzym

RT (Reverse Transcriptase) là enzym có khả năng sao chép ngược Trong các thuốc kháng HIV, nhóm thuốc quan trọng nhất cũng chính là nhóm thuốc ức chế enzym RT, qua đó ức chế quá trình sao chép RNA Các thuốc như lamivudin, stavudin, zidovudin là các dẫn chất nucleosid có tác dụng ngăn chặn sự tăng trưởng của chuỗi DNA và ức chế enzym RT Nevirapin là dẫn chất không thuộc nhóm nucleosid, tác dụng bằng cách ức chế trực tiếp RT, có vai trò quan trọng đối với việc điều trị HIV/AIDS

Hiện nay việc đảm bảo chất lượng của các thuốc chống HIV, đặc biệt

là khi các thuốc này được sản xuất tại các nước có thu nhập thấp như Việt Nam là vấn đề rất cần được quan tâm Trong Dược điển hiện hành của một số nước [4, 7, 8, 9, 10] chưa có chuyên luận về kiểm tra chất lượng các chế phẩm

có chứa nevirapin Một số Dược điển [11, 20] đã có chuyên luận này nhưng việc áp dụng vào điều kiện kiểm nghiệm ở Việt Nam còn gặp phải những khó khăn nhất định

Trong lĩnh vực kiểm nghiêm thuốc, với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, đã có nhiều thành tựu mới được đưa vào ứng dụng và đã mang

lại cho chúng ta những phương pháp kiểm nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao Một trong những phương pháp đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng

có kết quả nhiều hoạt chất trong các chế phẩm đơn thành phần cũng như đa thành phần

Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng nevirapin trong chế phẩm rắn phân liêu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” với các mục tiêu cụ thể như sau:

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng nevirapin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành Dược một phương pháp kiểm nghiệm nevirapin có tính đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng cao

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm nghiệm nhanh và chính xác một số chế phẩm rắn phân liều có chứa nevirapin đang lưu hành trên thị trường Việt Nam như chế phẩm NEVIRAPINE STADA và LAMZITRIO củaCông ty STADA Việt Nam

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ NEVIRAPIN

1.1.1 Công thức

Công thức phân tử: Cj5Hi4N4 0

Khối lượng phân tử: 266,3

Tên khoa học:l l-Cyclopropyl-5,1 l-dihydro-4-methyl-6//-dipyrido[3,2- Z?:2^3’-ổ][l,4]diazepin-6-on

1.1.2 Tính chất [20]

Bột kết tinh màu trắng, không mùi, pKa = 2,8

Thân dầu, rất khó tan trong nước (~ 0,lm g/m l ở pH trung tính), hơi tan

trong dicloromethan, khó tan trong methanol, logP (octanol/nước) = 83, tan tốt trong môi trường acid với pH<3

Trong phân tử nevirapin có dây nối đôi liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại Phổ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của dung dịch 10ụ.g/ml trong methanol có cực đại hấp thụ tại 283nm với độ hấp thụ riêng 251- 285

1.1.3 Tác dụng dược lý [5, 12]

Đặc tính dược lực học

Nevirapin là chất ức chế enzym sao chép ngược RT không thuộc nhóm nucleosid Nevirapin tác dụng bằng cách ức chế trực tiếp RT, khác với các dẫn chất nucleosid như lamivudin, stavudin đều có tác dụng kháng retrovirus nhưng thông qua việc ngăn chặn sự tăng trưởng của chuỗi DNA và ức chế enzym RT

Đặc tính dược động học

Sau khi uống, thuốc được hấp thu nhanh, sinh khả dụng theo đường uống khoảng 93%, phân bố khắp cơ thể, liên kết với protein huyết tương thấp (khoảng 60%)

Nồng độ đỉnh huyết tương ổn định (17±7fiM/l) của nevirapin đạt được sau khoảng 4 giờ

Nevirapin chịu ảnh hưởng của hệ enzym chuyển hóa Cytochrom P450

1.1.4 Tác dụng không mong muốn [12]

Tác dụng phụ có ý nghĩa lâm sàng liên quan đến việc dùng nevirapin thường là phát ban và tăng các thông số chức năng gan, cũng có thể xảy ra phản ứng quá mẫn

Độc tính chủ yếu của nevirapin trên lâm sàng là phát ban, có đến 35% bệnh nhân điều trị với nevirapin bị phát ban so với 19% ở nhóm chứng điều trị với zidovidin + didanosin hoặc dùng riêng zidovudin Phát ban ở mức độ nhẹ đến trung bình, dạng hồng ban dát sần, có thể có ngứa hoặc không, xuất hiện

ở thân, mặt và tứ chi Phát ban nặng hoặc đe dọa tính mạng chiếm tỷ lệ 6,6%

bệnh nhân điều trị bằng nevirapin so với 1,3% bệnh nhân ở nhóm chứng.

Về những bất thường trong xét nghiệm cận lâm sàng, sự gia tăng men gan không có triệu chứng thường xảy ra Đã có các trường hợp viêm gan lâm sàng ở bệnh nhân sử dụng nevirapin nên cần theo dõi GPT và GOT, đặc biệt

là trong 6 tháng đầu điều trị

- Chế phẩm đa thành phán:

LAMZITRIO, viên bao film - Công ty STADA Việt Nam

Thành phần: Lamivudin 150mg

Nevirapin 200mg Zidovudin 300mg

Tá dược vđ IviênTRIOMUNE, viên nén - Công ty CIPLA LTD., Ấ i Độ

Thành phần: Stavudin 40mg

Lamivudin 150mg Nevirapin 200mg

- Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 5,0; acetonitril (4:1) (trong đó dung dịch đệm phosphat pH 5,0: dung dịch (NH4)ĨỈ2P04 0,025M, chỉnh pH = 5,0 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH IN)

- Detector u v : 280nm

- Tốc độ dòng: l,Oml/phút

- Chất chuẩn nội; BIRH-414 (11- Ethyl-5,ll-dihydro-4-methyl- 6//-dipyrido[3,2-ò;2’,3’-e][l,4]diazepin-6-on)

- Thời gian lưu của nevirapin: 5,5 phút, của BIRH-414: 7,5 phút

1.2 TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) [2, 3, 4, 6, 9, 11, 14, 16, 19]

1.2.1 Khái niệm về sác ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao

a Khái niêm về sác ky

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách và phân tích các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào việc sử dụng các quá trình sắc

và pha tĩnh Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ nền chất rắn Chất rắn được nhồi vào trong cột hay tráng trên bản mỏng hoặc dàn thành film Pha động là khí hay chất lỏng Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [2].

b Khái niêm vé sác ky lỏng hiẽu năng cao

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Sắc ký lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tưofng tác hóa học trên bề mặt [2

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sác ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký pha thường hay pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

Khi đặt chất cần phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục chạy qua chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký

Ví dụ: Nếu ta nạp một mẫu gồm 3 chất là A, B, c vào cột tách thì khi bơm pha động qua cột tách các quá trình sắc ký xảy ra, khi đó A, B, c tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc kỷ ở đây

- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động ( F 3 )

Theo sơ đồ sau:

Trong đó tương tác Fj và F2 đóng vai trò quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn [6

1.2.3 Cơ sở lý thuyết sác ký

Quá trình phân tách trong phương pháp HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra khỏi cột Tùy theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều thành phần

1.2.4 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

a Hê thống bơm

Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký Bơm có tác dụng đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ hằng định

Có hai loại bơm:

- Một là bơm đẳng dòng (Isocratic pump)

- Hai là bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump)

b Bình chứa dung mối và hê thống xử lý dung mối

đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) Trong phưofng pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi Trong phương pháp gradien có thể cần 2, 3, 4 bình chứa dung môi.

c Hê tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động

d c ỏ t sác ky lỏng hiẽu năng cao

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình tách các chất Cột có ảnh hưởng lớn tới khả năng tách các chất cần phân tích Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc

ký Một cột phân tích thông thường dài 10-25 cm, đường kính trong 2-5 mm

e Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động từ cột sắc ký đi ra liên tục Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các chất hay hợp chất của chúng dựa theo một tính chất hóa lý nào đó của chất cần phân tích Thường có các loại detector sau:

- Detector UV-VIS (UltravioletẠ/^isible spectrophotometric Detector)

- Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)

- Detector khối phổ (Mass Spectropho tome trie Detector)

- Detector điện hóa (Electrochemical Detector)

- Detector tán xạ bay hơi (Evaporative Light Scattering Detector)

- Detector đo độ dẫn điện (Electrical Conductivity Detector)

- Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector)

- Detector chuỗi diod (Diode Array Detector)

f Bố phân ghi tín hiẽu: Recorder

g Hẽ điéu khiển: Computer

1.2.5 Các thông sô đặc trưng của quá trình sác ký và yếu tô ảnh hưởng

a Thời gian lưu tp và thể tích lưu Vp

- Ir là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc

ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ

Nếu là thời gian lưu giữ của một chất thì

Ír = Ír ~ toTrong đó: tjị’là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

to là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)

- Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu

có thể thay thế bằng thể tích lưu Vj^ là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ

Vr = ÍR X(F^ là thể tích pha động trong một đơn vị thời gian)

- tjị và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai đại lượng này phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ,

Cg và là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ

số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột K chỉ phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

Nếu K lớn thì lớn (pic ra muộn)

Nếu K nhỏ thì tj^nho (pic ra sớm)

c Thừa số dung lương K ’

K ’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng:

y

Trong đó là thời gian lưu, là thời gian chết

- K ’ phụ thuộc: bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích của pha động và pha tĩnh

K ’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp

- Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho; 1< K ’< 8

Nếu K ’< 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với các pic tạp

Nếu K ’> 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài

d Tốc đỏ di chuyển tỷ đối của hai chất

Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity- factor)

^RB

Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0 Nếu a càng lớn thì hai chất tách nhau càng tốt, a nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài

e Đô phân giải (Resolution)

Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

Tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng.

Thay đổi pha động làm Rg thay đổi lớn

Thay đổi pha động hay pha tĩnh làm Rg thay đổi lớn

AF = 0.05

2 d

Wq05 là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic

g Số đĩa lý thuyết N

^ = " = 5 5 4 |

SỐ đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột

- Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào và w (độ rộng pic)

càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài

w (độ rộng pic ở đáy) hay (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càngnhỏ thì N càng lófn nhưng w và Wy2 sẽ nhỏ hơn nếu nhỏ.

Khi tjị cố định thì bản chất cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định trong đó cột đóng một vai trò hết sức quan trọng

- Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vịchiều dài cột:

Trong đó: H là chiều cao pic của thành phần cần quan tâm trong sắc ký

đồ từ dung dịch đối chiếu quy định (pic C)

\ là giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi

đưòfng nền trong khoảng sắc đồ thu được sau khi tiêm dung dịch mẫu trắng

Khoảng sắc đồ cần quan sát có độ dài bằng 20 lần độ rộng đáy ở 1/2 chiều cao của pic c và điểm giữa của nó là vị trí tương đương với vị trí của pic

c (vị trí của pic thành phần cần quan tâm)

1.2.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

a Lưa chon cỏt (pha tĩnh)

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích Đó là các chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính hạt từ 3-10|j.m, diện tích bề mặt hạt thường từ 50-500mVg- Vì phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là sắc ký hấp phụ nên các phân tích dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ Sắc ký hấp phụ có hai loại là:

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (Normal phase - HPLC)

13

- sắc ký hấp phụ pha đảo (Reverse phase - HPLC).

Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ lên bề mặt của pha tĩnh Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ

Trong sắc ký thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực

Trong sắc kỷ pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân cực, chất phân tích có thể phân cực hoặc ít phân cực

Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC;

- Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký

- Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc

ký nhất định

- Tính chất bề mặt ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

Vì silica gel là loại pha tĩnh hay dùng và ưu việt nên ở đây giới thiệu về

một số loại silica gel;

- Silica trung tính, silica cyanid hoá, amin hoá trên bề mặt có các nhóm

OH phân cực (ưa nước), nhóm CN hoặc nhóm NHj- Loại này hay được sử dụng làm pha tĩnh cho các sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hay không phân cực

- Silica đã alkyl hóa, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng Do các nhóm OH thân nước trên bề mặt được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion

- Silica sulfon hóa hay nitro hóa để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi cation Silica amin hóa dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion

Chất cần phân tích có khối lượng

phân tử < 2000

Tan trong dung môi hữu cơ

Tan trong dung mối

(CHCI3 đến CH3OH)

Sắc kỷ pha đảo

Tan trong CHCI3 Tan trong alcol, acetonitril hoặc

ethyl acetat 1

pha thuận

Tan trong nước

Không io tạo cặ

nic hoặc

p ion

Sắc ký pha thuận

cyano, amino

Sắc ký trao đổi ion

Hình 1.1: Cách chọn cột HPLC [14]

15

b Lưa chon pha đống cho HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tjỊ và hiệu quả tách Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỷ lệ nhất định, cũng có thể là dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức Mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải để

có hiệu quả phân tách tốt nhất

* Pha động có thể ảnh hưởng tới:

* Những yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:

- Bản chất của dung môi được lựa chọn

- Thành phần của các chất trong pha động

- Tốc độ dòng pha động

- pH pha động (đặc biệt chú ỷ ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)

* Yêu cầu của một pha động;

- Phải trơ đối với pha tĩnh

- Phải hòa tan được chất mẫu

- Phải bền vững theo thời gian

- Các thành phần phải có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt được cân bằng trong quá trình sắc kỷ

- Phù hợp với loại detector được sử dụng

- Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như; n-hexan, n-heptan, benzen, chloroform, Các pha động này thường được bão hòa nước.

Trong sắc ký pha đảo thì pha động thường là hệ dung môi phân cực

như: nước, methanol, acetonitril, hay hỗn họfp của chúng Các dung môi đó có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

pH acid nhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion thì

pH tùy từng trường hợp

d Tốc đổ dòng pha đống

Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn

để quá trình tách tốt hơn là tốc độ dòng pha động Tốc độ dòng pha động ảnh hưởng đến thừa số dung lượng và số đĩa lý thuyết của cột

b Sác ký điều chế

Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa

riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất / ^

c Đinh lương và xác đinh giới han tap chất

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lófn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất

Trong sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là:

- Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so sánh với diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn Kết quả có thể tính theo cách chuẩn hóa một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính

- Phương pháp chuẩn nội; Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai đáp ứng gần giống chất phân tích vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội Yêu cầu pic của chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn ra khỏi pic của chất cần phân tích Kết quả được tính dựa vào tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic đáp ứng của chất phân tích và chất chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn: Phương pháp này dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic;

Nguyên tắc; Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần

Yêu cầu:

+ Tất cả các thành phần đều được rửa giải và phát hiện + Tất cả các thành phần có đáp ứng như nhau với detector

Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:

o y -^,.1 0 0 _ 5 ,.1 0 0

s , + s,+s,+^ ,^ ỵ s,

Tuy vậy trong sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector là rất khó Khắc phục nhược điểm này, trong sắc ký lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần Để xây dựng hệ số đáp ứng người ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng là bằng 1 Các thành phần khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau;

' s - c ]

Trong đó: Sc và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chuẩn gốc

và thành phần cần tính hệ số đáp ứng

C q và Cx là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng

fc là hệ số hiệu chỉnh của chuẩn

Khi đó hàm lượng của thành phần X tính theo công thức:

p.-F.

j=lĐây là phương pháp hay áp dụng để định lượng và thử giới hạn tạp chất trong thuốc

19

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG

Số đăng ký

Số kiểm soát Hạn dùng

- Chế phẩm đa thành phần (mẫu Mj)

LAMZITRIO - viên bao film Công ty STADA Việt Nam Công thức: Lamivudin 150mg

Nevirapin 200mg Zidovudin 300mg

Tá dược vđ 1 viên

SỐ đăng ký : V N B - 2 8 6 7 - 0 5

Số kiểm soát : 200505 Hạn dùng : 05/2008

2.2 PHƯƠNG TIỆN, DỤNG c ụ , HÓA CHÂT

Hàm ẩm: 0,06%

+ Chuẩn lamivudin:

Nơi sản xuất: Ấn Độ

SỐ lô: AP/001Hàm lượng trên chế phẩm khô: 98,92%

Mất khối lượng do sấy khô: 0,36%

+ Chuẩn stavudin;

SỐ lô: 03602002Hàm lượng: 100,00% (Nguyên trạng)

- Amoni acetat C2ĨỈ7NO2 (PA)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Merck - Hitachi D-7000

Detector UV: Diode Array Detector L-7455

- Máy lắc siêu âm: Branson 5210

- Máy đo pH: 632pH- meter METROHM

- Bộ lọc chân không Millipore, màng 0,45 Ịxm Whatman

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 độ chính xác 0,lm g

Mettler Toledo AB 245 độ chính xác 0,01mg

- Bình định mức dung tích lOml, 20ml, 25ml, 50ml, lOOml, lOOOml

- Cốc đong lOOml

- Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh

- Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, bình pha động, bình cầu các loại

21

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.3.1 Nội dung

* Khảo sát các điều kiện sắc ký

Xây dựng chương trình sắc ký định lượng nevirapin trong chế phẩm đơn thành phần và chế phẩm đa thành phần bao gồm:

- Xác định độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic

- Xác định độ lặp lại của phương pháp

- Xác định độ đúng của phương pháp

- Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thực nghiệm để tìm điều kiện sắc ký cho phép phát hiện nevirapin trong chế phẩm và tách tốt pic của nevirapin với pic của dung môi,

tá dược và các thành phần khác trong chế phẩm đơn thành phần và đa thành phần, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả

- Phương pháp cụ thể: sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.3 Các đặc trưng thông kê để xử lý kết quả phân tích

- Giá trị trung bình:

- Độ lệch chuẩn: ^ ~ \ ~ í

- Sai số chuẩn; s

lượng tìm thấy - lượng thêm

S( và : Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn

: Lượng chất chuẩn đã cân (mg)

c : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%)

ĩĩìv : Khối lượng trung bình viên (g)

m, : Khối lượng bột viên đem thử (g)

23

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

3.1 XÂY DỰNG ĐIỂU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG NEVIRAPIN TRONG CHẾ PHẨM

3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sác ký

Qua tham khảo tài liệu và dựa trên điều kiện sẵn có của cơ sở nghiên cứu (Phòng Hoá lý II- Viện Kiểm nghiệm), do nevirapin có tính chất kém phân cực nên chúng tôi lựa chọn kiểu sắc kỷ pha đảo, sử dụng cột sắc ký Agilent Zorbax C18 (250 X 4,6mm, 5|im) trong quá trình khảo sát các điều kiện sắc ký như pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện cho phép tách pic của nevirapin ra khỏi pic của dung môi, tá dược và các chất khác trong chế phẩm đơn thành phần và đa thành phần

Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử để tiến hành khảo sát:

- Dung dịch thử:

Cân xác định khối lượng trung bình của 20 viên chế phẩm, nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 20mg nevirapin, cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml methanol lắc siêu âm 15 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều Lọc qua màng 0,45Ịim thu được dung dịch thử

- Dung dịch chuẩn:

+ Dung dịch chuẩn nevirapin:

Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều (dung dịch 1) Hút chính xácl,Oml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 10,0ml, lọc qua màng lọc 0,45 Ịim thu được dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích (dung dịch chất