- Phương pháp thực nghiệm để tìm điều kiện sắc ký cho phép phát hiện nevirapin trong chế phẩm và tách tốt pic của nevirapin với pic của dung môi, tá dược và các thành phần khác trong chế phẩm đơn thành phần và đa thành phần, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả.
- Phương pháp cụ thể: sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2.3.3. Các đặc trưng thông kê để xử lý kết quả phân tích
- Giá trị trung bình:
- Độ lệch chuẩn: ^ ~ \ ~ í
- Sai số chuẩn; s
- Sai số tương đối: g% =
lượng tìm thấy - lượng thêm
lượng thêm X 100
- Độ lệch chuẩn tưomg đối: RSD{%) = Ỉ^.ỈOO
X
2.3.4. Cách đánh giá kết quả
Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau, hàm lượng của nevirapine trong chế phẩm được tính theo công thức:
X (mg/viên)
s]m,
Trong đó:
S( và : Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn : Lượng chất chuẩn đã cân (mg)
c : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%) ĩĩìv : Khối lượng trung bình viên (g) m, : Khối lượng bột viên đem thử (g).
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
3.1. XÂY DỰNG ĐIỂU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG NEVIRAPIN TRONG CHẾ PHẨM
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sác ký
Qua tham khảo tài liệu và dựa trên điều kiện sẵn có của cơ sở nghiên cứu (Phòng Hoá lý II- Viện Kiểm nghiệm), do nevirapin có tính chất kém phân cực nên chúng tôi lựa chọn kiểu sắc kỷ pha đảo, sử dụng cột sắc ký Agilent Zorbax C18 (250 X 4,6mm, 5|im) trong quá trình khảo sát các điều kiện sắc ký như pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện cho phép tách pic của nevirapin ra khỏi pic của dung môi, tá dược và các chất khác trong chế phẩm đơn thành phần và đa thành phần.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử để tiến hành khảo sát: - Dung dịch thử:
Cân xác định khối lượng trung bình của 20 viên chế phẩm, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 20mg nevirapin, cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml methanol lắc siêu âm 15 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua màng 0,45Ịim thu được dung dịch thử.
- Dung dịch chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn nevirapin:
Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều (dung dịch 1). Hút chính xác
l,Oml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 10,0ml, lọc qua màng lọc 0,45 Ịim thu được dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích (dung dịch chất
chuẩn nevirapin này có nồng độ khoảng 2 0|j.g/ml). + Dung dịch chuẩn lamivudin:
Cân chính xác khoảng 15mg chất chuẩn lamivudin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều (dung dịch 2). Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 10,0ml, lọc qua màng lọc 0,45)Lim thu được dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích (dung dịch chuẩn lamivudin này có nồng độ khoảng 15|ig/ml).
+ Dung dịch chuẩn zidovudin:
Cân chính xác khoảng 15mg chất chuẩn zidovudin cho vào bình định mức dung tích 50ml, thêm khoảng 30ml MeOH, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều (dung dịch 3). Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 10,0ml, lọc qua màng lọc 0,45|Lim thu được dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích (dung dịch chuẩn zidovudin này có nồng độ khoảng 30}ig/ml).
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp:
Hút chính xác l,Oml dung dịch 1; l,Oml dung dịch 2 và l,Oml dung dịch 3 ở trên cho vào bình định mức dung tích lOml, thêm pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều (dung dịch chuẩn hỗn hợp này cũng có nồng độ nevirapin khoảng 20]Lig/ml, nồng độ lamivudin khoảng 15|j.g/ml, nồng độ zidovudin khoảng 30jig/ml).
* Lựa chọn pha động:
Qua nghiên cứu tính chất lỷ hoá của nevirapin và các thành phần khác có thể kết hợp với nevirapiĩi trong chế phẩm đa thành phần như zidovudin, lamivudin, cùng với việc tham khảo một số tài liệu, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, nước cất và một số dung dịch đệm. Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát để lựa chọn pH và tỷ lệ các thành phần trong pha động thích hợp. Khảo sát được tiến hành với hệ dung môi gồm dung
dịch đệm acetat 0,025M ở pH 3,0; 4,0; 5,0 và 5,8 (do nevirapin dễ tan trong mồi trưòfng acid) và MeOH (tỷ lệ 60:40). Sau khi tìm được pH thích hợp, cố định pH đó để khảo sát tỷ lệ giữa các thành phần trong pha động bằng cách phối hợp dung dịch đệm acetat và MeOH với các tỷ lệ thay đổi là 50:50; 60:40 và 70:30.
Kết quả khảo sát cho thấy hệ dung môi; dung dịch đệm acetat pH 4,0 - methanol (60:40) (trong đó dung dịch đệm acetat pH 4,0 là dung dịch amoni acetat 0,025M, chỉnh pH=4,0 ± 0,2 bằng acid acetic băng) là hệ dung môi có khả năng tách tốt pic của nevirapin ra khỏi pic của dung môi, tá dược và các thành phần khác trong chế phẩm, thời gian lưu vừa phải, đồng thời cho sắc ký đồ khá đẹp (hệ số bất đối xứng là 0,95). Vì vậy chúng tôi chọn hệ dung môi này trong quá trình nghiên cứu tiếp theo.
0JŨ §' t>Jũ C 3 -o ĩ/) 03
Hình 3.1: Ảnh hưỏng của pH pha động đến thừa sô dung lượng K’ * Lựa chọn tốc độ dòng:
Tốc độ dòng l,Oml/phút cho pic tương đối cân xứng, thời gian lưu vừa phải.
* Lựa chọn bước sóng phát hiện:
Dựa vào độ hấp thụ của nevirapin và các chất khác có trong chế phẩm đa thành phần, dựa vào nồng độ các chất đó, chúng tôi đã tiến hành thực
nghiệm và chọn ra bước sóng để định lượng nevirapin trong chế phẩm đofn thành phần cũng như đa thành phần là 270nm
Hình 3.2: Phổ hấp thụ tử ngoại của nevirapin chuẩn
Tóm lại, sau quá trình thực nghiệm chúng tôi đã lựa chọn các điều kiện sắc ký để định lượng nevirapin trong chế phẩm đơn thành phần cũng như đa thành phần là:
- Máy sắc ký lỏng Merck - Hitachi D-7000
- Cột Agilent Zorbax 300SB - C l 8 (250 X 4,6mm; 5|um), nhiệt độ phòng thí nghiệm
- Pha động: dung dịch đệm acetat pH 4,0: methanol (60; 40)
(Trong đó dung dịch đệm acetat pH 4,0: dung dịch amoni acetat
0,025M, chỉnh pH = 4,0 ± 0,2 bằng acid acetic băng)
- Detector UV: 270nm - Tốc độ dòng: l,Oml/phút - Thể tích tiếm: 20^1
- Dung dịch chuẩn và thử có nồng độ khoảng 20^g/ml trong pha động.
Với điều kiện sắc ký như trên, nevirapin được tách ra khỏi các pic dung môi và các chất có trong chế phẩm đa thành phần như lamivudin, zidovidin; pic cân đối và gọn, thời gian lưu của nevirapin là khoảng 7 phút, của lamivudin là khoảng 2,8 phút, của zidovudin là khoảng 3,7 phút
Hình 3.3: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nevirapin
:ì.m. -ị
5 . 3 L - Ị
5 . Í Đ
r ■ I ■ I * r I ■ I ■— T — r — T — I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■■
u> u.
Thời gian lưu (phút)
I I ■ ■ I— I ■ I - r ^ r n
^ Jii
3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ nevirapin khoảng 20|Lig/ml. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột, độ lặp lại về thời gian lưu (đại lượng có giá trị về định tính) và diện tích pic (đại lượng có giá trị về định lượng).
Cách pha dung dịch chuẩn;
Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng trong pha động vừa đủ 10,0ml và lọc qua màng lọc 0,45nm.
Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột.
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
STT Thời gian lưu (Ir) (phút) Diện tích pic (S) (m AU.min) 1 6,77 408630 2 6,80 405975 3 6,80 409571 4 6,77 405319 5 6,77 407032 6 6,75 406320 Trung bình 6,78 407141 RSD 0,295% 0,403% Số đĩa lý thuyết : N = 1642 Hệ số bất đối : AF = 0,95 29
Nhận xét:
RSD về thời gian lưu là 0,295%, RSD của diện tích pic là 0,403%, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký trên bảo đảm được tính thích hợp của hệ thống với việc phân tích định tính và định lượng thành phần hoạt chất trong các chế phẩm đơn thành phần và đa thành phần.
3.1.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng trên chất chuẩn nevirapin bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn nevirapin có nồng độ biến thiên trong khoảng từ 5|Lig/ml đến 50|ig/ml. Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình đã tìm được ở trên. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ nevirapin và diện tích pic bằng các phương pháp hồi quy tuyến tính.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của chất cần định lượng được trình bày ở bảng 3.2.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất cần định lượng được thể hiện ở hình 3.5.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
Dung dịch 1 2 3 4 5
Nồng độ
(Ịig/ml) 5,375 10,750 21,500 32,250 53,750
Diện tích pic
(mAU.min) 102853 210147 420017 625889 1041731
Phương trình hồi quy: y = 19359x + 1282,2 Hệ sô tương quan : r = 1,0000
o Sh ị-i <s* s 1200000 1000000 - 800000 - 600000 - 400000 - 200000 - 0 ĐỒ thị khảo sát độ tuyến tmh y = 1 9 3 5 9 X + 1 2 8 2 ,2 R^ = 1 ,0 0 0 0 0 10 20 30 40 N ồng độ 50 60
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của nevirapin
Nhận xét:
Từ kết quả thu được cho thấy trong một khoảng nồng độ khảo sát khá rộng, nồng độ nevirapin từ 5|Lig/ml đến 50|ig/ml, có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng với hệ số tương quan hồi quy rất gần 1, chứng tỏ sự tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic.
Trên cơ sở đó chúng tôi lựa chọn nồng độ để định lượng các chế phẩm có chứa nevirapin nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát là: nevirapin có nồng độ khoảng 2 0|j,g/ml.
3.1.4. Khảo sát độ lặp iại của phương pháp
Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên hai mẫu Mi và M2. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên việc khảo sát độ lặp lại của 6 thí nghiệm trên mỗi mẫu.
- Dung dịch thử:
Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH,
lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45|im. Với mỗi mẫu làm 6 lần như vậy (với 6 lần cân khác nhau). Khi đó các dung dịch thử của chế phẩm đơn thành phần hay đa thành phần đều có nồng độ nevirapin khoảng 2 0|ug/ml.
- Dung dịch chuẩn:
Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng trong pha động vừa đủ 10,0ml và lọc qua màng lọc 0,45fxm. Khi đó dung dịch chuẩn có nồng độ nevirapin khoảng 20|Lig/ml.
Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký đã nêu và tính hàm lượng hoạt chất theo công thức:
Trong đó;
và s^. ; Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn : Lượng chất chuẩn đã cân (mg)
c : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%)
ĩ ĩ i v : Khối lượng trung bình viên (g) rrit : Khối lượng bột viên đem thử (g)
: lượng chất ghi trên nhãn (g).
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu và M2 được trình bày trong bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu Mi (m,= 0,35 llg )
STT Lượng cân Diện tích pic Hàm lượng
mt (g) (mAU.min) (%) 1 0,0358 414572 101,4 2 0,0349 400434 100,5 3 0,0355 400513 98,8 4 0,0348 393351 99,0 5 0,0350 395379 98,9 6 0,0352 396303 98,6 TB 99,5
Sô liệu thống kê
Với p = 0,95 s = 1,1
n = 6 S(X) = 0,5
ta = 2,571 RSD = 1,1%
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu M2
( m v = 0,8 1 4 5g )
STT Lượng cân Diện tích pic Hàm lượng
mt (g) (mAU.min) (%) 1 0,0809 394423 99,1 2 0,0811 395791 99,2 3 0,0810 391369 98,2 4 0,0815 393596 98,1 5 0,0819 402144 99,8 6 0,0820 402880 99,8 TB 99,0
Sô liệu thống kê
Với p = 0,95 s = 0,7
n = 6 S(x) = 0,3
t„ = 2,571 RSD = 0,8%
Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy, với chương trình sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng nevirapin có độ chính xác cao với độ lệch chuẩn tương đối về phần trăm hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn là 1,1% trên mẫu và 0,8% trên mẫu M2. Với kết quả này chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao, sai số tương đối nhỏ.
3.1.5. Khảo sát độ đúng của phưong pháp
Độ đúng của phương pháp được khảo sát trên hai mẫu và M2 bằng phưoỉng pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào trong mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn. Dựa vào hàm lượng nevirapin đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, tính được lượng nevirapin tìm thấy lại trong mẫu thử và tỷ lệ thu hồi của lượng chất thêm vào.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thêm các lượng chất chuẩn bằng khoảng 10%, 20% và 30% so với lượng hoạt chất đã có sẩn trong mẫu thử. Tiến hành với 6 mẫu thử và một mẫu chuẩn, cụ thể như sau:
+ Dung dịch chuẩn:
Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng trong pha động vừa đủ 10,0ml và lọc qua màng lọc 0,45Ịj,m. Khi đó dung dịch chuẩn có nồng độ nevirapin khoảng 20|Lig/ml.
+ Dung dịch chuẩn dùng để thêm vào mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 0 ,lg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích 50ml, thêm khoảng 30ml MeOH, siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ 50,0ml. Lắc kỹ thu được dung dịch A.
Dung dịch cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm chính xác l,Oml dung dịch A, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45|im. Với mỗi mẫu làm 2 lần như vậy (với 2 lần cân khác nhau).
Dung dịch B2: cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm chính xác 2,0ml dung dịch A, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác