Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng trên chất chuẩn nevirapin bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn nevirapin có nồng độ biến thiên trong khoảng từ 5|Lig/ml đến 50|ig/ml. Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình đã tìm được ở trên. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ nevirapin và diện tích pic bằng các phương pháp hồi quy tuyến tính.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của chất cần định lượng được trình bày ở bảng 3.2.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất cần định lượng được thể hiện ở hình 3.5.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
Dung dịch 1 2 3 4 5
Nồng độ
(Ịig/ml) 5,375 10,750 21,500 32,250 53,750
Diện tích pic
(mAU.min) 102853 210147 420017 625889 1041731
Phương trình hồi quy: y = 19359x + 1282,2 Hệ sô tương quan : r = 1,0000
o Sh ị-i <s* s 1200000 1000000 - 800000 - 600000 - 400000 - 200000 - 0 ĐỒ thị khảo sát độ tuyến tmh y = 1 9 3 5 9 X + 1 2 8 2 ,2 R^ = 1 ,0 0 0 0 0 10 20 30 40 N ồng độ 50 60
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của nevirapin
Nhận xét:
Từ kết quả thu được cho thấy trong một khoảng nồng độ khảo sát khá rộng, nồng độ nevirapin từ 5|Lig/ml đến 50|ig/ml, có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng với hệ số tương quan hồi quy rất gần 1, chứng tỏ sự tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic.
Trên cơ sở đó chúng tôi lựa chọn nồng độ để định lượng các chế phẩm có chứa nevirapin nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát là: nevirapin có nồng độ khoảng 2 0|j,g/ml.
3.1.4. Khảo sát độ lặp iại của phương pháp
Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên hai mẫu Mi và M2. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên việc khảo sát độ lặp lại của 6 thí nghiệm trên mỗi mẫu.
- Dung dịch thử:
Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH,
lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45|im. Với mỗi mẫu làm 6 lần như vậy (với 6 lần cân khác nhau). Khi đó các dung dịch thử của chế phẩm đơn thành phần hay đa thành phần đều có nồng độ nevirapin khoảng 2 0|ug/ml.
- Dung dịch chuẩn:
Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng trong pha động vừa đủ 10,0ml và lọc qua màng lọc 0,45fxm. Khi đó dung dịch chuẩn có nồng độ nevirapin khoảng 20|Lig/ml.
Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký đã nêu và tính hàm lượng hoạt chất theo công thức:
Trong đó;
và s^. ; Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn : Lượng chất chuẩn đã cân (mg)
c : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%)
ĩ ĩ i v : Khối lượng trung bình viên (g) rrit : Khối lượng bột viên đem thử (g)
: lượng chất ghi trên nhãn (g).
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu và M2 được trình bày trong bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu Mi (m,= 0,35 llg )
STT Lượng cân Diện tích pic Hàm lượng
mt (g) (mAU.min) (%) 1 0,0358 414572 101,4 2 0,0349 400434 100,5 3 0,0355 400513 98,8 4 0,0348 393351 99,0 5 0,0350 395379 98,9 6 0,0352 396303 98,6 TB 99,5
Sô liệu thống kê
Với p = 0,95 s = 1,1
n = 6 S(X) = 0,5
ta = 2,571 RSD = 1,1%
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu M2
( m v = 0,8 1 4 5g )
STT Lượng cân Diện tích pic Hàm lượng
mt (g) (mAU.min) (%) 1 0,0809 394423 99,1 2 0,0811 395791 99,2 3 0,0810 391369 98,2 4 0,0815 393596 98,1 5 0,0819 402144 99,8 6 0,0820 402880 99,8 TB 99,0
Sô liệu thống kê
Với p = 0,95 s = 0,7
n = 6 S(x) = 0,3
t„ = 2,571 RSD = 0,8%
Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy, với chương trình sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng nevirapin có độ chính xác cao với độ lệch chuẩn tương đối về phần trăm hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn là 1,1% trên mẫu và 0,8% trên mẫu M2. Với kết quả này chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao, sai số tương đối nhỏ.
3.1.5. Khảo sát độ đúng của phưong pháp
Độ đúng của phương pháp được khảo sát trên hai mẫu và M2 bằng phưoỉng pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào trong mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn. Dựa vào hàm lượng nevirapin đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, tính được lượng nevirapin tìm thấy lại trong mẫu thử và tỷ lệ thu hồi của lượng chất thêm vào.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thêm các lượng chất chuẩn bằng khoảng 10%, 20% và 30% so với lượng hoạt chất đã có sẩn trong mẫu thử. Tiến hành với 6 mẫu thử và một mẫu chuẩn, cụ thể như sau:
+ Dung dịch chuẩn:
Cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác l,Oml dung dịch này pha loãng trong pha động vừa đủ 10,0ml và lọc qua màng lọc 0,45Ịj,m. Khi đó dung dịch chuẩn có nồng độ nevirapin khoảng 20|Lig/ml.
+ Dung dịch chuẩn dùng để thêm vào mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 0 ,lg chất chuẩn nevirapin cho vào bình định mức dung tích 50ml, thêm khoảng 30ml MeOH, siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ 50,0ml. Lắc kỹ thu được dung dịch A.
Dung dịch cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm chính xác l,Oml dung dịch A, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45|im. Với mỗi mẫu làm 2 lần như vậy (với 2 lần cân khác nhau).
Dung dịch B2: cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm chính xác 2,0ml dung dịch A, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua
m àn g lọ c 0 ,4 5 Ịim . Với m ỗ i m ẫu làm 2 lần như v ậ y (với 2 lần cân khác nhau).
Dung dịch B3: cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 20mg nevirapin cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm chính xác 3,0ml dung dịch A, thêm khoảng 70ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, hút chính xác l,Oml dịch lọc sau pha loãng với pha động vừa đủ 10,0ml, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45|im. Với mỗi mẫu làm 2 lần như vậy (với 2 lần cân khác nhau).
Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình đã lựa chọn với các dung dịch Bj, B2, B 3 như trên. Lượng chất chuẩn đã được thêm vào mỗi bình thử đựơc tính theo công thức:
Lượng chất thêm = mj.ịjuẩa X X hệ số pha loãng
Thực tế tiến hành, dung dịch A được chuẩn bị từ 0,0997g chất chuẩn nevirapin.
Vì vậy lượng chuẩn đã được thêm vào mỗi bình thử cụ thể như sau: Bình B,: 0,0997 X 99,99% X (100% - 0,06%) X 1/50 = 1,993.10'^ (g/ml)
=1,993 (mg) Bình 0,0997 X 99,99% X (100% - 0,06%) X 2/50 = 3,986.10"3 (g)
= 3,986 (mg)
Bình B3: 0,0997 X 99,99% X (100% - 0,06%) X 3/50 = 5,979.10‘^ (g) = 5,979 (mg)
Kết quả khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm được trình bày ở bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu Mi
(m = 0,351 Ig) STT Lượng cân thử (g) Lượng chuẩn thêm vào (mg) Lượng chuẩn tìm lại (mg) Tỷ lệ tìm lại (%) Sai số tương đối (%) 1 0,0360 1,993 1,998 TB = 2,0005 100,2 0,2 2 0,0342 1,993 2,003 100,5 0,5 3 0,0360 3,986 3,977 TB = 3,973 99,8 0,2 4 0,0346 3,986 3,969 99,6 0,4 5 0,0357 5,979 5,919 TB = 5,925 99,0 1,0 6 0,0352 5,979 5,931 99,2 0,8 TB 99,7 0,5
Hình 3.6: Đồ thị đánh giá khả năng thu hồi của phương pháp trên mẫu Mi
Bảng 3.6; Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu M2 ( m v = 0 ,8 1 4 5 g ) STT Lượng cân thử (g) Lượng chuẩn thêm vào (mg) Lượng chuẩn tìm lại (mg) Tỷ lệ tìm lại (%) Sai số tương đối (%) 1 0,0810 1,993 1,999 TB = 1,992 100,3 0,3 2 0,0823 1,993 1,985 99,6 0,4 3 0,0809 3,986 3,954 TB = 3,948 99,2 0,8 4 0,0820 3,986 3,942 98,9 1,1 5 0,0811 5,979 5,979 TB = 5,961 100,0 0,0 6 0,0817 5,979 5,943 99,4 0,6 TB 99,6 0,5 trên mẫu M2 Nhận xét:
Trên cả hai mẫu và Mj, khảo sát tính đúng của phương pháp đều cho kết quả lượng chất chuẩn thu hồi lại được nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%, trong đó thấp nhất là 98,9% và cao nhất là 100,5%. Sai số tương đối của phép đánh giá độ đúng của phương pháp thu được khoảng 0,5% đối với cả hai mẫu. Chứng tỏ phương pháp được xây dựng ở trên có độ đúng cao.
3.1.6. Khảo sát giới hạn phát hiện và giói hạn định lượng
- Giới hạn phát hiện (LOD): bằng thực n g h iệm với việc pha loãng gấp đôi nhiều lần dung dịch chất chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong khoảng tuyến tính, dung dịch có nồng độ nhỏ nhất thoả mãn điều kiện tỷ lệ tín hiệu/ độ nhiễu xấp xỉ bằng 5 được chọn làm giới hạn phát hiện.
Kết quả thu được: giới hạn phát hiện LOD khoảng 0,05)j.g/ml.
- Giới hạn định lượng (LOQ): lựa chọn giới hạn định lượng là nồng độ nhỏ nhất trong khoảng tuyến tính thỏa mãn các điều kiện về tính thích hợp, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng như đã tiến hành ở trên.
Kết quả thu được: giới hạn định lượng LOQ khoảng 5)j,g/ml.
3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG NEVIRAPIN TRONG MỘT s ố CHẾ PHẨM
Trên cơ sở phương pháp đã được xây dựng, áp dụng để định lượng nevirapin trong các chế phẩm đơn thành phần và đa thành phần đã được sản xuất và đang lưu hành ở Việt Nam. Mỗi mẫu thử được lặp lại 3 lần. Tiêm sắc ký dung dịch mẫu chuẩn và các dung dịch mẫu thử trong cùng điều kiện.
Kết quả định lượng được tính toán bằng phương pháp ngoại chuẩn, nghĩa là so sánh diện tích pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng nevirapin trong chế phẩm so với hàm lượng ghi trên nhãn theo công thức:
X ( m g /V .ê n ) =
Trong đó:
S( và S^: Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn ĩĩic : Lượng chất chuẩn đã cân (mg)
c : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%) niv : Khối lượng trung bình viên (g) nit : Khối lượng bột viên đem thử (g).
3.2.1. Chế phẩm đơn thành phần (mẫu Ml)
NEVIRAPINE STADA - viên bao film 200mg Công ty STADA Việt Nam
Số đăng ký Số kiểm soát Hạn dùng V N B - 1 6 8 8 -0 4 051005 10/2008.
Hàm lượng (% so với hàm lượng ghi trên nhãn) = 99,5%
Bảng 3.7: Kết quả định lượng nevirapin trong chê phẩm đơn thành phần (mv = 0,35 llg ) STT Lượng cân mt (g) Diện tích pic (mAư.min) Hàm lượng (%) 1 0,0354 402979 99,7 2 0,0351 397961 99,3 3 0,0360 408576 99,4 TB 0,0355 403172 99,5
3.2.2. Chê phẩm đa thành phần (mẫu M2)
LAMZITRIO - viên bao film Công ty STADA Việt Nam Công thức: Lamivudin 150mg Nevirapin 200mg Zidovudin 300mg Tá dược vđ 1 viên VNB - 2867 - 05 200505 05/2008. Số đăng ký Số kiểm soát Hạn dùng
Hàm lượng (% so với hàm lượng ghi trên nhãn) = 99,0%.
Bảng 3.8: Kết quả định lượng nevirapin trong chê phẩm đa thành phần ( n i v = 0,8145g) STT Lượng cân mt (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) 1 0,0812 396853 99,3 2 0,0815 395910 98,7 3 0,0810 394282 98,9 TB 0,0812 395682 99,0 3.3. BÀN LUẬN VỂ KẾT QUẢ
Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại với những ưu điểm nổi bật là có độ chọn lọc cao, độ ổn định, độ lặp lại và độ đúng tốt, đồng thời lại có phương pháp xử lý mẫu tương đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh. Ngày nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích, vì vậy phương pháp này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các ngành phân tích. Trong ngành kiểm nghiệm thuốc hiện nay, HPLC được coi là phương pháp đầu tay để phân tích các thuốc đơn thành phần cũng như đa thành phần nhờ khả phân tích các chất với hiệu năng cao của cột và dung môi động, khả năng phát hiện rất nhạy để định tính và định lượng các chất của các loại detector.
Trong Dược điển Việt Nam III cũng như Dược điển một số nước khác chưa có chuyên luận về nevirapin. Một số nghiên cứu của các tác giả nước ngoài cũng sử dụng phương pháp HPLC để định lượng nevirapin nhưng trong pha động đều sử dụng các chất tạo cặp ion hiếm và đắt tiền như acid 1- butane sulfomic hay acid 1- hexane sulíomic hoặc dùng chất chuẩn nội BIRH-414 [15, 18]. Trong Dự thảo Dược điển Quốc tế [20] sử dụng phương pháp HPLC để định lượng nevirapin nhưng chất nhồi cột là hexadecylamidylsilyl silica gel, trong USP 28 [11] dùng chất nhồi cột là L60 đều tương đối hiếm gặp.
Chương trình sắc ký chúng tôi đưa ra dùng để định lượng nevirapin trong chế phẩm đơn thành phần cũng như đa thành phần là:
- Máy sắc ký lỏng Merck - Hitachi D-7000
- Cột Agilent Zorbax 300SB - C l8 (250 X 4,6mm; 5|Lim), nhiệt độ phòng thí nghiệm
- Pha động: dung dịch đệm acetat pH 4,0 - methanol (60:40)
(trong đó dung dịch đệm acetat pH 4,0: dung dịch amoni acetat 0,025M, chỉnh pH = 4,0 ± 0,2 bằng acid acetic băng)
- Detector u v : 270nm - Tốc độ dòng: l,Oml/phút - Thể tích tiêm: 20ịi\
- Dung dịch chuẩn và thử có nồng độ khoảng 20|ig/ml trong pha động. Với điều kiện sắc ký như trên nevirapin được tách ra khỏi pic của dung môi, tá dược và pic của các chất khác có trong chế phẩm đa thành phần. Các pic thu được tương đối cân xứng và gọn, thời gian lưu của các chất không quá dài: tjị của nevirapin là khoảng 7 phút, của lamivudin là 2,8 phút, của zidovudin là 3,7 phút. Các đại lượng đặc trưng như số đĩa lý thuyết, độ cân xứng của pic đều nằm trong giới hạn cho phép, chứng tỏ hệ thống có độ thích hợp tốt. Hệ số tương quan tuyến tính là 1,0000; độ lặp lại có sai số tương đối là 0,8% - 1,1%; độ đúng là 99,7% (với mẫu Mj) và 99,6% (với mẫu M2). Kết quả thực nghiệm cũng chứng tỏ chương trình chúng tôi xây dựng có độ tin cậy cao, độ lặp lại và độ đúng tốt, kỹ thuật tiến hành đơn giản, nhanh chóng và dễ thực hiện. Chúng tôi đã áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng nevirapin trong chế phẩm đơn thành phần NEVIRAPINE STADA (mẫu Mj) và chế phẩm đa thành phần LAMZITRIO (mẫu M2) của Công ty STADA Việt Nam. Kết quả thu được hàm lượng của nevirapin tương ứng là 99,5% (mẫu Mi) và 99,0% (mẫu M2) so với hàm lượng ghi trên nhãn.
KẾT LUẬN
Sau khi hoàn thành khoá luận này, tôi đã đạt được các kết quả sau; * Xây dựng được chương trình định lượng nevirapin trong chế phẩm rắn phân liều đơn thành phần và đa thành phần bằng phương pháp HPLC với các thông số và điều kiện như sau:
- Cột Agilent Zorbax 300SB - C18 (250 X 4,6mm; 5|Lim), nhiệt độ phòng thí nghiệm
- Pha động; dung dịch đệm acetat pH 4,0 - methanol (60:40) (trong đó dung dịch đệm acetat pH 4,0: dung dịch amoni acetat 0,025M, chỉnh pH = 4,0 ± 0 ,2 bằng acid acetic băng)
- Detector UV: 270nm