Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong thân rễ hoàng liên và trong chế phẩm hương liên hoàn bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Về các phương pháp đã được áp dụng để định lượng alcaloid trong Hoàng liên và trong các chế phẩm đông dược có chứa Hoàng liên, qua tham khảo các tài... Tuy nhiên, trong các tài liệu mà c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUỢC HÀ NỘI

N g u y ễ n T h ị P h ư ơ n g T h ả o

N G H IÊN c ú u Đ ỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Đ ồ N G THỜI

B ER B ER IN VÀ PA LM A TIN TRO N G TH Â N RỄ H O À N G LIÊN V À TR O N G C H Ế PH ẩ M h ư ơ n g l i ê n h o à n b ằ n gPHƯƠNG PH Á P SẮC KÝ LỎ N G H IỆU N Ă N G CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Dược phẩm - Độc chất học

Ma so: 030205

Luận văn Thạc sĩ dược học

Người hướng dẫn khoa học:

TS Trịnh Văn Lẩu

C ịs T S P h ạ m T h a n h K ỳ

Hà Nội 2002

L Ờ Ư c ả m Ơ R

(Dề t à i nàụ (tu'o’e th u a h iệu t a i íUìêtI Ddêtn ttạlùêtn - (Bà QJ- tê, d ư ổ i uX

lu íâ ttạ dẫtL c ủ a QcS Qftinh (JJăn J lẩ u - p h ó giám , (tốn <ĩ)ìên DCiểni m ịhiỀ m ũù eMS, rJ<$ r()lĩíitn ^Jliault DCij - c á n hỗ- (ịiảniỊ dạiẬ bô m ô n (Dươe Liêu, trú ò tiạ ('Đại h ạ c nDaỢd 'ãôà QLội.

<Dê h o à n th à n h đ ể t à i này., chúng, tô i (tã n h ậ n ĩtiioa su’ c h i (lẫn tâ n tìn h

c ủ a Qc£ vi n il (Z)ăn M ẩn lùi £ ịẴ ‘ £7c£ rp i t ạ i n Qfltanh DCìị.

'Ji'Ouq qxiẩ tr ìn h th ú c hiên (Tề t à i , elulntj tó i cũII(Ị n lu ịn ĩtiừỉe những, ý, líiê n đ ó n tp (ỊỎỊI q u í lư íu c ủ a rp ^ ậ ci rp i ư u n - ộ ia 'dùuê cùng, eáa títầ ụ c à (JÌá tì

k h ó a ồng th ò i ehúnạ tò i eủíiạ lu â n n h à n itu ’rie u i ạiúfL đ ĩí n ỉù ê t tĩn h của các b a n (tầng, n ạỉù êp t a i eác pítòtK Ị ty ô tK ị ^D àổe tíù p h ẻ n íỊ /ìlĨỊ, p h ẩ m của (Viên DCìểm n ạ h ỉím

Q ỉlià n tlifL n à ụ,, chúng, tô i xitv Ị)ừụ tả LờtUỊ hìêt ơn e h â n th à n h đ ỏ i DÓ’i u Ị (fiứp itõ q u tị lỉáti củ a eáa thầụ eầ ạ ìá tì oà cá (í han đồng, nụỉùèp

rí)(S QÍ ẩ ịxìịậ ỉh ^ ĩlù rỊ )lllì( itl( Ị ^7liả o

1.3 Một sô phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất

1.3.1 Phương pháp chiết lạnh theo Lu, p và Zeng, J H 06

1.4 Một sô phương pháp đã được áp dụng để định lượng

alcaloid toàn phần, berberin và palmatin trong Hoàng

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG, TH IÊT BỊ, NỘI DƯNG VÀ

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất berberin và palmatin

2.3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết theo Lu, p và cộng sự ,

DĐ Trung Quốc 1997, DĐ Nhật 1996 và phương pháp

chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên hai mẫu Mj và M2 182.3.1.2 Đề xuất phương pháp chiết berberin và palmatin từ dược

liệu Hoàng liên (mẫu Mị) và bột Hương liên hoàn tự tạo

2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để định tính và định lượng

đồng thời berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên

2.3.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời

berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong

3.1 Xây dựng phương pháp chiết berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong chê phẩm Hương liên hoàn 24

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết lạnh theo Lu, p và cộng sự 24

3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc 97 25

3.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng

3.2.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định tính và định lượng

đồng thời berberin và palmatin trong Hoàng liên và trong

3.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời

berberin và palmatin trong Hoàng liên và viên Hương liên

3.2.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của píc berberin và palmatin thu

3.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính palmatin và berbeim 373.2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng đổng thời palmatin

3.2.3 Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng

đồng thời berberin và palmatin trong chế phẩmHương liên

BẢNG CHỬ VIẾT TẮT:

DĐ: Dược điển

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

kl/tt: Khối lượng trên thể tích

UV-VIS: Tử ngoại - Khả kiến,

vđ: Vừa đủ

Trong viên Hương liên hoàn, thành phần chíi

alcaloid Trong đó berberin là thành phần chính, tiếp đến là palmatin [42], cả haialcaloid này đều có tác dụng điều trị bệnh đường tiêu hoá [19] Vì vậy, việc xác định hàm lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên cũng như trong chế phẩm Hương liên hoàn là vấn đề cần quan tâm trong công tác quản lý chất lượng thuốc nhằm đảm bảo thuốc có hiệu lực chữa bệnh và an toàn cho người sử dụng

Từ trước đến nay, mặc dù đã qua ba lần nghiên cứu cải tiến công thức, kèm theo ba lần xây dựng bổ xung tiêu chuẩn, song trong cả 3 tiêu chuẩn đã xây dựng của viên Hương liên hoàn đều chưa có phương pháp để định lượng berberin và palmatin Trong những năm gần đây, Công ty Dược Yên Bái đã nghiên cứu xây dựng phương pháp quang phổ tử ngoại để định lượng berberin Tuy nhiên, do trong Hoàng liên có chứa cả berberin và palmatin mà phổ hấp thụ UV-VIS của 2 alcaloid này tương tự nhau nên việc định lượng berberin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại thông thường cũng như bằng phương pháp quang phổ đạo hàm khó thực hiện Do đó, cho đến nay trong tiêu chuẩn chất lượng xin cấp số đăng ký sản xuất và lưu hành mặt hàng này, công ty vẫn chưa có phương pháp định lượng berberin và palmatin

Về các phương pháp đã được áp dụng để định lượng alcaloid trong Hoàng liên và trong các chế phẩm đông dược có chứa Hoàng liên, qua tham khảo các tài

96 dùng phương pháp HPLC Một số tài liệu khác, trong những năm gần đây, cũng đề cập đến việc định lượng berberin trong Hoàng liên và trong các chế phẩm đông dược có chứa Hoàng liên bằng phương pháp HPLC Tuy nhiên, trong các tài liệu mà chúng tôi đã tham khảo, chưa có tác giả nào nêu lên qui trình chiết xuất và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong chế phẩm Hương liên hoàn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Do đó chúng tôi tiến hành đề tài:

"Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong thân rễ Hoàng liên và trong chê phẩm Hương liên hoàn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)".

- Mục tiêu của công trình là:

Xây dựng phương pháp chiết và định tính, định lượng đồng thời berberin và palmatin trong vị Hoàng liên và chế phẩm Hương liên hoàn đủ tin cậy nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng vị Hoàng liên và giúp Công ty Dược Yên Bái nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng viên Hương liên hoàn

- Công trình thực hiện các nội dung sau:

+ Khảo sát, lựa chọn phương pháp chiết thích hợp để chiết kiệt berberin và palmatin từ dược liệu Hoàng liên và từ chế phẩm Hương liên hoàn

+ Xây dựng chương trình sắc ký để định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong các dịch chiết từ các mẫu nghiên cứu nói trên

đó chủ yếu là berberin, phần còn lại là palmatin, worenin, coptisin, jatrorizin, magnoflorin [3], [14] Ngoài ra trong Hoàng liên còn có tinh bột, acid hữu cơ như acid ferulic,

Thân rễ Hoàng liên sau khi thu hái thường được rửa sạch, phơi khô, thái lát rồi dùng ngay Trong một số tài liệu, Hoàng liên được chế biến bằng cách đem sao với rượu (chữa các bệnh nhiệt ở phần trên cơ thể), hoặc đem sao với nước gừng thành khương hoàng liên (chữa bệnh nhiệt ở dạ dày, điêù hoà chức năng dạ dày, chống nôn), hoặc sao với nước sắc ngô thù du thành du hoàng liên (tăng cường chức năng gan, điều hoà chức năng dạ dày, chống nôn) [3], [5], [11], [30], [31] Công ty Dược phẩm Yên Bái sử dụng loại Hoàng liên chưa qua chế biến [7]

Nước sắc Hoàng liên có nhiều tác dụng dược lý: tác dụng kháng khuẩn (trực khuẩn lị, trực khuẩn phó thương hàn, trưc khuẩn E.Coli, phẩy khuẩn tả, tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn, ), kháng virut, kháng nấm gây bệnh; tác dụng với ký sinh trùng đơn bào; tác dụng kiện vị giúp tiêu hoá, chống loét đường tiêu hoá; tác dụng hạ huyết áp, phòng ngừa vữa xơ động mạch; tác dụng chống viêm [19]

Hoàng liên có vị đắng tính hàn, qui vào các kinh tâm, can, vị và đại tràng

có tác dụng thanh nhiệt, táo thấp, tả hoả, giải độc Hoàng liên là một loại thuốc

bổ đắng, có tác dụng kiện vị dùng trong điều trị tiêu hoá kém, viêm dạ dày, lị, ỉa

chảy, nôn mửa Trong điều trị lị trực trùng, cao lỏng Hoàng liên có tác dụng rất tốt mà không có hiện tượng kích ứng dạ dày Với viêm màng tiếp hợp mắt, dùng dịch chiết Hoàng liên để nhỏ và rửa mắt cũng có tác dụng rất tốt Theo đông y, Hoàng liên còn được dùng để chữa sốt, mê sảng, nôn ra máu, chảy máu cam, can hoả ứ kết, đau dạ dày, nôn ra nước chua, tim đập hồi hộp mất ngủ, loét miệng, mụn nhọt đầu đinh, vết thương có mủ, bỏng, đau mắt đỏ, viêm tai giữa [19], [35]

Hoàng liên ít độc thường được dùng liều 2-6 g/ngày dạng thuốc sắc

1.2 Vài nét về một số alcaloid chính trong Hoàng liên.

1.2.1 Berberin.

Berberin là 5,6-dihydro-9,10-dimethoxybenzo[g]-l,3-benzodioxolo [5,6-ữ]quinolizinium hydroxyd: C^oHjgNOg [3], [14], [23], [39] Berberin có thể tổn tại ở dạng muối clorid, sulfat [23] Dạng muối clorid hay được dùng trong ngành Dược Berberin có công thức cấu tạo:

Độ tan:

Dạng base tan trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether Dạng muối sulfat khó tan trong nước, tan trong ethanol

Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:

Berberin có các đỉnh đặc trưng ở số sóng: 1505, 1271, 1234, 1030, 1587,

1098 cm '1 (đĩa KBr) [23]

Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:

Berberin thường được dùng ở dạng viên nén liều 0,2-0,4 g/ngày trong điều trị bệnh đường tiêu hoá [19].

1.2.2 Palmatin.

Palmatin là 5,6-dihydro-2,3,9,10-tetramethoxydibenzo [a,g\ quinolizinium

hydroxyd C^H^NOj Palmatin chỉ tồn tại ở dạng muối, thông thường là các dạng muối iodid, nitrat, clorid, sulfat [37] Palmatin có công thức cấu tạo:

Tác dụng và công dụng:

Palmatin clorid có tác dụng ức chế liên cầu khuẩn và tụ cầu khuẩn, tác dụng lên trung khu hô hấp, tác dụng hạ huyết áp, tác dụng chống nấm đặc biệt là nấm gây viêm âm đạo Palmatin clorid được dùng trong điều trị bệnh kiết lỵ, ỉa chảy dưới dạng viên với liều 0,08-0,2 g/ngày; bệnh đau mắt ở dạng dung dịch 3- 5%; bệnh nấm âm đạo dưới dạng viên trứng hàm lượng 0,2 g [19]

1.3 Một sô phương pháp đã được áp dụng đê chiết xuất berberin và palmatin từ Hoàng liên.

Muốn định lượng được hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu nói chung cũng như định lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên nói riêng, vấn đề đầu tiên cần quan tâm là chọn được phương pháp chiết thích hợp Phương pháp chiết được lựa chọn phải đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch chiết thu được phải đủ sạch để không làm sai lệch kết quả phân tích Muốn vậy cần có biện pháp xử lý mẫu và tinh chế dịch chiết thích hợp Việc tinh chế và làm sạch dịch chiết có nhiều phương pháp khác nhau nhưng nhìn chung có một số phương pháp sau:

- Dựa vào độ tan khác nhau của hoạt chất cần chiết và tạp chất từ đó lựa chọn, thay đổi dung môi, môi trường chiết để hoà tan tốt được chất cần phân tích nhưng lại loại được các tạp chất

- Loại tạp chất trước khi chiết ví dụ loại chất béo bằng ether dầu hoả, loại màu bằng than hoạt [1]

- Dùng sắc ký cột với các chất nhồi cột như nhôm oxyd, silicagel, dùng phương pháp chiết pha rắn (SPE) .[2]

Các phương pháp chiết berberin và palmatin trong Hoàng liên ở các tài liệu chúng tôi đã tham khảo có thể chia thành 3 phương pháp sau:

1.3.1 Phương pháp chiết lạnh theo L u ,p và Zheng J H [29].

Berberin trong Hoàng liên có thể chiết bằng phương pháp ngâm lạnh như sau:

Cân khoảng 0,4g dược liệu đã được tán mịn, cho vào một bình nón nút mài,thêm 50ml methanol, đậy kín bình, 6 giờ đầu thỉnh thoảng lắc, để yên 18 giờ Lọc thu được dịch chiết

1.3.2 Phương pháp chiết nóng

- Phương pháp chiết nóng theo DĐ Việt Nam I, tập 1 [9]

Cân khoảng 2,5g dược liệu đã được tán mịn, thêm 50ml ethanol 95% và chiết kiệt hoạt chất bằng bình Zaitchenko Dịch chiết thu được đem bốc hơi trên cách thuỷ tới khô Thêm vào cắn 30ml nước, 2-3g magnesi oxyd, lắc đều Lọc thu lấy dịch chiết, rửa cắn bằng nước nóng đến khi nước rửa không còn màu, thu được dịch chiết

- Phương pháp chiết theo Wu,P.E và Zhou, L [43]

Cân khoảng 0,4g dược liệu đã được tán mịn, thêm 50-60ml ethanol, đun hổi lưu trên cách thuỷ trong 2 giờ, lọc thu được dịch chiết

- Phương pháp chiết theo Rhee,J.S [24],

Cân khoảng 0,4 g dược liệu đã dược tán mịn, thêm 50-70ml methanol, đun hổi lưu trên cách thuỷ ở 60°c trong 2-3 giờ, lọc thu được dịch chiết

- Phương pháp chiết theo DĐ Nhật 96 [36]

Cân khoảng 0 ,lg dược liệu đã được tán mịn, thêm 30ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1), đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút, lọc lấy dịch chiết methanol Làm như vậy thêm 2 lần nữa với thể tích hỗn hợp dung môi tương ứng là 30ml và 20ml

1.3.3 Phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc 97 [32].

Cân khoảng 0 ,lg dược liệu đã được tán mịn, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm 95ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1), đun hổi lưu trên bếp cách thuỷ ở 60°c trong 15 phút, để yên qua đêm, lắc siêu âm trong

30 phút, thêm methanol vừa đủ 100ml, lọc thu được dịch chiết

1.4 Một sô phương pháp đã được áp dụng đê định lượng alcaloid toàn phần, berberin và palmatin trong Hoàng liên.

1.4.1 Phương pháp cân.

Dựa trên tính chất của berberin có phản ứng tạo tủa phức với aceton Do

đó, sau khi chiết kiệt berberin bằng cồn sẽ tạo tủa với kali iodid Tủa berberin- iodid được phân tán đều trong nước nóng sau đó thay đổi pH của môi trường để chuyển berberin về dạng base rồi cho phản ứng với aceton tạo ra tủa phức berberin-aceton Lọc lấy tủa, cân tủa berberin-aceton thu được và đo thể tích dịch lọc từ đó tính ra lượng berberin đã tham gia phản ứng [9]

Tuy nhiên, trên thực tế không chỉ có berberin cho kết tủa với kali iodid và aceton nên phương pháp định lượng này không hoàn toàn là định lượng berberin Hơn nữa, nếu áp dụng phương pháp này để định lượng berberin trong Hương liên hoàn thì cần một lượng mẫu thử lớn (khoảng 100 viên) mà lại có sai số lớn do phải qua nhiều lần kết tủa, lọc và rửa tủa

1.4.2 Phương pháp quang p h ổ tủ ngoại.

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại cũng đã được dùng để định lượng alcaloid toàn phần trong bột Hoàng liên Phương pháp này dựa trên định luật Lambert-Beer: Mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng xác định tỉ

lệ thuận với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem đo [13], [16], [46]

Trong đó: k là hệ số hấp thụ

c là nồng độ.

1 là bề dày của lớp dung dịch đem đo

Khi c = 1% (kl/tt), 1 = lcm thì D = k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là E (1%,1 cm) Như vậy khi c tính theo nồng độ phần trăm (kl/tt), l tính bằng cm thì: D = E (1%, 1 c m ) c 1 (2)

Theo DĐ Trung quốc 88 [30], dịch chiết alcaloid toàn phần sau khi được tinh chế qua cột nhôm oxyd sẽ được đo quang ở bước sóng 345 nm Hàm lượng alcaloid toàn phần sẽ được tính theo berberin lấy E(l% , 1 cm) = 728

Phương pháp này ít được áp dụng để định lượng alcaloid trong Hoàng liên

do trên thực tế rất khó rửa giải được toàn bộ alcaloid ra khỏi cột nhôm oxyd Hơn nữa, đây chỉ là phương pháp xác định một cách tương đối hàm lượng alcaloid toàn phần trong Hoàng liên dựa vào giá trị E(l% , 1 cm) Phương pháp này khó cho kết quả lặp lại, sai số lớn

Phương pháp sắc ký lóp mỏng kết hợp với phương pháp đo quang còn gọi

là phương pháp densitomet để định lượng berberin trong các chế phẩm đông dược cũng thường được sử dụng [28], [31], [43] Trong phương pháp này, sau khi triển khai sắc ký lóp mỏng, các vết trên sắc ký đồ sẽ được quét bằng một chùm sáng

có bước sóng xác định Ánh sáng khuếch tán phản xạ trở lại sẽ được đo bằng thiết bị cảm quang của máy quét Máy densitomet có thể đặt ở chế độ hấp thụ hoặc huỳnh quang tuỳ thuộc vết của chất cần phân tích có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy hay có khả năng phát quang khi bị kích thích Để định lượng berberin trong Hoàng liên, dung môi để triển khai sắc ký lớp mỏng thường là:

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích hoá lý dùng để tách, định tính và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn với nhau: pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải) Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tu ỳ theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các chất Sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp thụ hoặc trao đổi ion [15], [20]

Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector Tuỳ theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector uv (phát hiện chất cần phân tích dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy của chất cần phân tích ở một bước sóng xác định) Đường cong rửa giải sau một qúa trình sắc

ký được gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như hình 1

tignaỉ

Hình 1: Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.

tR (Thời gian lưu thực) = tR - 10.

§t (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng

Cũ0 5 (Độ rộng píc ở nửa chiều cao) = 2,354ôt

Trong thực tế: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.

R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%

Độ phân giải phụ thuộc hệ số k, (hệ số dung lượng của cấu tử ra sau), độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:

4 a 1 + k 2

Như vậy, để tăng độ phân giải R ta có thể tăng N (dùng cột dài hơn hoặc giảm tốc độ dòng pha động); tăng k’2 (bằng cách thay đổi thành phần pha động); tăng a (bằng cách thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động)

Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm thuốc đông dược nói riêng Một số tác giả đã dùng các dung môi hữu cơ như methanol [22], [32], [33], [36], [44], ethanol [3], [21] ở môi trường acid hoặc trung tính để chiết alcaloid từ bột Hoàng liên và các thuốc đông dược có chứa Hoàng liên rồi tiến hành định lượng berberin hoặc berberin và palmatin bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao Trong các tài liệu chúng tôi đã tham khảo, các tác giả đã nêu lên một số chương trình sắc ký sau đây để phân tích các alcaloid của bột Hoàng liên

*DĐ Nhật [36], Wang, c M và cộng sự [40] đã nêu qui trinh sắc ký gồm các điều kiện sau đây để định lượng berberin trong Hoàng liên:

- Detector ƯVỞ bước sóng 345 nm.

^Lin, S J và cộng sự [27] đã sử dụng chương trình sắc ký sau đây để xác định berberin và palmatin trong chế phẩm thuốc đông dược Sann-Joong-Kuey- Jian-Tang

- Cột sắc ký: cột Hypersil BDS C18 (5 ịim, 25 cm X 4,6 mm).

- Pha động: Acid phosphoric 40 mM-acetonitril (29:21)

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Detector u v 349 nm

* Chương trình sắc ký sau đây cũng được dùng để định lượng berberin

- Cột sắc ký: Hibar® RT 250-4 Lichrosorb® RP SelectB, 5 |_im (Cat

B: Natri hydroxyd 0,025 mol/1

- Gradient dung môi: 0 phút: 80% B; 0 - 5 phút: 40% B; 5 - 15 phút: 40% B; 15 - 18 phút: 80% B

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG, THIÊT BỊ, NỘI DƯNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1.ĐỐÌ tượng nghiên cún.

- Mẫu Mj là mẫu bột Hoàng liên đạt tiêu chuẩn chất lượng DĐ Việt Nam I

do Công ty Dược phẩm Yên Bái cung cấp Mẫu này được dùng để khảo sát xây dựng phương pháp định tính, định lượng đổng thời berberin và palmatin trong bột Hoàng liên trên máy HPLC

- Mẫu M, là bột Hương liên hoàn tự tạo, được chế theo công thức viên Hương liên hoàn của Công ty Dược phẩm Yên Bái từ các nguyên liệu đạt tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký do Công ty cung cấp Mẫu M7 có các thành phần sau:

Trong quá trình nghiên cứu, hai mẫu M[ và M2 được tiến hành song song

có so sánh kết quả để đánh giá sự ảnh hưởng của các thành phần khác tới quá trình định tính và định lượng berberin và palmatin trong viên Hương liên hoàn

- Mẫu M3 là mẫu có thành phần tương tự như mẫu Mt nhưng không chứa Hoàng liên Mẫu M3 dùng để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khác trong công thức đến quá trình sắc ký tại bước sóng phát hiện berberin và palmatin

- Ba mẫu Hương liên hoàn do Công ty Dược phẩm Yên Bái sản xuất hiệnđang lưu hành trên thị trường có số kiểm soát: + 010400

+ 040800

+101200Tiến hành định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong ba mẫu này bằng phương pháp HPLC đã xây dựng

2.2 Thiết bị và hoá chất

2.2.1 Thiết bị.

- Máy lắc siêu âm Transonic T700 (CHLB Đức)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Bio-tek Kontron - Detector u v hoặc diode array (Pháp)

- Cân phân tích Mettler AB204, độ chính xác 0,1 mg (Thuỵ sĩ)

- Máy quang phổ UV-VIS Hewlett Packard (Mỹ)

- Nồi cách thuỷ.

- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết khác

Tất cả các thiết bị trên đã được hiệu chuẩn và kiểm định theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025

2.2.2 Hoá chất.

- Chuẩn làm việc palmatin clorid.

- Chuẩn làm việc berberin clorid

- Methanel-P.A

/ £ " o \

- Acid hydrocloric P.A

xT;/Ch0 ftZr

- Kali dihydrophosphat p.A

- Natri laurylsulfat p A

- Acetonitril dùng cho HPLC

- Thuốc thử Mayer pha theo DĐ Việt Nam II, tập 3 [12]

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất berberin và palmatỉn từ dược liệu Hoảng liên và viên Hương liên hoàn.

2.3.1.1 Khảo sát các phương pháp chiết theo Lu, p và cộng sự [29], DĐ Trung Quốc 1997, DĐ Nhật 1996 và phương pháp chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên hai

2.3.1.2 Đ ề xuất phương pháp chiết berberin và palmatin từ dược liệu Hoàng liên

a Đối với dược liệu Hoàng liên (mẫu Mj)

Cân chính xác khoảng 0,07 g bột Hoàng liên đã được nghiền mịn và rây qua rây 0,25 mm vào một bình nón nút mài 100ml Chiết 3 lần, mỗi lần dùng 25

ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1) bằng cách đun hồi lưu trên cách thuỷ 30 phút Gộp các dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô Cắn được chiết tiếp bằng nước nóng 5 lần, mỗi lần dùng 15 ml Lọc và gộp các dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô cắn được hoà tan và chuyển vào bình định mức 50 ml bằng methanol , thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua giấy lọc cỡ 0,45 (am, thu được dung dịch thử

b Đối với mẫu Hương liên hoàn tự tạo (mẫu M,)

Cân chính xác một lượng bột mẫu Hương liên hoàn tự tạo có chứa khoảng 0,07 g Hoàng liên vào bình nón nút mài 100 ml Chiết 3 lần, mỗi lần dùng 25 ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1) bằng cách đun hồi lưu trên cách thuỷ 30 phút Gộp các dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô cắn

được chiết tiếp bằng nước nóng 5 lần, mỗi lần dùng 15 ml Lọc và gộp các dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô cắn được hoà tan và chuyển vào bình định mức 50 ml bằng methanol , thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua giấy lọc cỡ 0,45 |im, thu được dung dịch thử

Sơ đồ chiết xuất berberỉn và palmatin từ dược liệu Hoàng liên và bột Hương liên hoàn tự tạo.

berberín và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong viên Hương liên

hoàn.

2.3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc kỷ.

Trên cơ sở có sẵn cột Lichrosorb RP8 (10 Ịim; 250 X 4 mm), chúng tôi tiến

hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký thích hợp

a Khảo sát chọn pha động và tốc độ dòng thích hợp cho phép tách đồng

thời berberin và palmatin ra khỏi hỗn hợp phân tích

b Khảo sát chọn bước sóng xác định đổng thòi berberin và palmatin

c Xây dựng chương trình sắc ký

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách berberin và palmatin trong dịch chiết từ mẫu M[ và M2 như: pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện, chúng tôi đã chọn một chương trình sắc ký với các điều kiện sau đây cho phép tách được berberin và palmatin

* Cột Lichrosorb RP8 (10 ị-im; 250 X 4 mm)

* Detector uv, bước sóng phát hiện 345 nm

* Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydrophosphat, 1,7 g natri laurylsulfat trong 1000 ml hỗn hợp dung môi nước- acetonitril (1:1)

* Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút.

* Thể tích tiêm: 20 JJ.1.

* Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng (27 ± 3°C)

23.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong viên Hương liên hoàn.

a Kiểm tra độ tinh khiết của các píc berberin và palmatin thu được trên sắc

ký đồ của dịch chiết mẫu thử bằng máy HPLC kết nối detector diode array

b Xây dựng phương pháp định tính đồng thời berberin và palmatin

Sử dụng máy HPLC: Bio-tek Kontron - detector diode array để định tính đồng thời berberin và palmatin dựa vào việc so sánh các thông số: thời gian lưu tR

và phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến của mẫu chuẩn và mẫu thử thông qua hệ số match

@ c Xây dựng phương pháp đinh lượng đổng thời berberin và palmatin

Để định lượng đồng thời 2 thành phần berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong viên Hương liên hoàn bằng phương pháp HPLC, chúng tôi tiến hành:

+ Khảo sát độ ổn định của hệ thống sắc ký

+ Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ berberin và palmatin với diện tích píc trên sắc ký đổ

+ Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

+ Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm

Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát và tiến hành định lượng bằng cách so sánh diệntích píc mẫu chuẩn và mẫu thử được thực hiện trên cùng điêù kiện sắc ký, từ đótính ra hàm lượng berberin và palmatin trong chế phẩm cần phân tích theo công thức:

* Đối với dược liệu Hoàng liên

Trong đó: Sj-, sc là diện tích píc của mẫu thử và mẫu chuẩn

mc là lượng cân mẫu chuẩn (mg)

Cc là hàm lượng mẫu chuẩn (%)

mT là lượng cân mẫu thử (mg)

mv là khối lượng trung bình viên (mg)

b là độ ẩm nguyên liệu (g/lg nguyên liệu)

2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả.

23.3.1 Đánh giá hiệu quả chiết.

Để đánh giá hiệu quả chiết, chúng tôi dùng phản ứng tạo tủa với thuốc thử Mayer

x,y tương ứng là các độ hấp thụ đo được trong các phổ của mẫu thử

và mẫu chuẩn ở cùng bước sóng.

n là số điểm so sánh

Khi hệ số match = 1,000 có nghĩa là hai phổ giống nhau hoàn toàn

Khi hệ số match > 0,990 thì hai phổ tương tự nhau

3.1 Xây dựng phương pháp chiết berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong chê phẩm Hương liên hoàn.

3.1.1.Khảo sát phương pháp chiết lạnh theo Lu, p và cộng sự [29].

Cân chính xác khoảng 0,07 g bột mẫu Mj vào một bình nón nút mài 100

ml Cân chính xác một lượng bột mẫu M2 có chứa khoảng 0,07 g Hoàng liên vào một bình nón nút mài 100 ml khác Thêm vào mỗi mẫu 30 ml methanol, trong 6 giờ đầu thỉnh thoảng lắc, để yên 18 giờ, lọc lấy dịch chiết

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid trong hai mẫu Mj và M7 chưa chúng tôi tiến hành như sau: Bã còn lại thêm 20ml methanol, lắc trong 30 phút Dịch chiết methanol thu được cho bốc hơi đến khô trên cách thuỷ Hoà tan cắn trong 2ml nước, acid hoá bằng 2 giọt dung dịch acid sulfuric 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử Mayer Quan sát thấy cả hai mẫu M[ và M7 đều xuất hiện tủa màu vàng nhạt

Như vậy phương pháp chiết bằng cách ngâm lạnh nêu trên chưa chiết kiệt alcaloid trong mẫu bột Hoàng liên và bột Hương liên hoàn tự tạo

Cân chính xác khoảng 0,07 g bột mẫu M) vào một bình nón nút mài 100

mi Cân chính xác một lượng bột mẫu M2 có chứa khoảng 0,07 g Hoàng liên vào một bình nón nút mài 100 ml khác Song song tiến hành chiết trên hai mẫu này bằng cách lắc siêu âm ba lần, mỗi lần dùng 20 ml methanol, lắc siêu âm trong 30 phút Lọc lấy dịch chiết

Để kiểm tra xem phương pháp chiết lạnh dùng siêu âm như trên đã chiết kiệt alcaloid trong hai mẫu M, và M2 chưa chúng tôi tiến hành như sau: Bã còn lại chiết thêm lần thứ 4 cũng bằng cách lắc siêu âm với 20 ml methanol trong 30 phút Dịch chiết methanol cho bốc hơi đến cạn trên cách thuỷ Hoà tan cắn trong 2ml nước, acid hoá bằng 2 giọt dung dịch acid sulfuric 10%, thêm 1-2 giọt thuốc

thử Mayer Quan sát thấy cả hai mẫu Mị và M, đều xuất hiện tủa màu vàng nhạt Chứng tỏ phương pháp này chưa chiết kiệt alcaloid trong 2 mẫu nghiên cứu

3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc 97.

Cân chính xác khoảng 0,07 g bột mẫu Mị vào một bình nón nút mài 250

ml Cân chính xác một lượng bột mẫu M, có chứa khoảng 0,07 g Hoàng liên vào một bình nón nút mài 250 ml khác Thêm vào mỗi bình nón 70 ml hỗn hợp dung môi methnol - acid hydrocloric (100:1), đun nóng trên bếp cách thuỷ ở 60°c trong 15 phút, lắc siêu âm trong 30 phút, để qua đêm Lọc, thu được dung dịch thử

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid trong hai mẫu Mị và Mo chưa chúng tôi tiến hành như sau: Thêm vào bã dược liệu ở hai bình nón trên mỗi bình 30 ml hỗn hợp dung môi methanol - acid hydrocloric (100:1) rồi đun hổi lưu trên cách thuỷ 30 phút Lọc lấy dịch chiết, làm bay hơi trên bếp cách thuỷ tới khô Hoà tan cắn thu được trong 2ml nước, acid hoá bằng 2 giọt dung dịch acid sulfuric 10%, thêm 2 giọt thuốc thử Mayer Quan sát thấy cả hai mẫu Mj và M2 đều xuất hiện tủa màu vàng nhạt

Thực nghiệm đã chírng tỏ rằng phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc 97 chưa chiết kiệt alcaloid trong dược liệu Hoàng liên cũng như trong chế phẩm Hương liên hoàn Phương pháp chiết này chỉ phù hợp với việc bán định lượng berberin bằng sắc ký lớp mỏng theo DĐ Trung Quốc 97

3.1.4 Khảo sát phương pháp chiết theo DĐ N hật 96.

Cân chính xác khoảng 0,07 g bột mẫu Mị vào một bình nón nút mài 100

ml Cân chính xác một lượng bột mẫu M, có chứa khoảng 0,07 g Hoàng liên vào một bình nón nút mài 100 ml khác Chiết cả hai mẫu trên bằng hỗn hợp dung môi methanol- acid hydrocloric (100:1) Chiết 3 lần với thể tích dung môi dùng

là 30 ml-30 ml-20 ml, mỗi lần đun hổi lưu cách thuỷ với ống sinh hàn ngược trong 30 phút Gộp các dịch chiết, bốc hơi hết dung môi trên cách thuỷ

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid chưa, chúng tôi chiết tiếp lần thứ 4 với 30 ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1), đun hồi lưu cách thuỷ 30 phút Dịch chiết được cô cạn trên cách thuỷ Hoà tan cắn trong 2 ml nước, acid hoá bằng 2 giọt dung dịch acid sulfuric 10%, thêm 2 giọt thuốc thử Mayer Quan sát thấy cả hai mẫu đều không xuất hiện tủa

Như vậy, thực nghiệm đã chứng tỏ phương pháp chiết theo DĐ Nhật 96 đã chiết kiệt alcaloid trong dược liệu Hoàng liên cũng như trong chế phẩm Hương liên hoàn

Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy rằng: Với cả hai mẫu M] và M2 cắn thu được sau khi bay hơi dung môi còn chứa nhiều tạp chất, đặc biệt ở mẫu M, có một lượng cắn lớn, màu xanh đen , nên chưa thể dùng ngay cắn này hoà tan trong methanol làm dung dịch thử cho phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Do đó cắn của dịch chiết mẫu Mị và M, cần phải qua giai đoạn tinh chế

3.1.5 Khảo sát điều kiện chiết thích hợp.

3.1.5.1 Khảo sát dung môi chiết.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên một số dung môi mà Dược điển các nước và các tài liệu thường sử dụng để chiết alcaloid trong Hoàng liên Các dung môi đó là: - Dung môi 1: ethanol 95%

- Dung môi 2: methanol

- Dung môi 3: methanol-acid hydrocloric (100:1)

Quá trình khảo sát được tiến hành trên 2 mẫu Mị và M2 theo qui trình sau: Cân chính xác 3 mẫu thử Mj, mỗi mẫu khoảng 0,07 g vào 3 bình nón nút mài dung tích 100 ml đã được đánh số thứ tự từ 1 đến 3 Tiến hành chiết theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.1.2.a nhưng thay dung môi chiết bằng các dung môi sau:

Tiến hành chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao các dung dịch thử vói chương trình sắc ký như đã nêu ở mục 2.3.2.l.c, so sánh vói dung dịch chuẩn chứa khoảng 0,060 mg berberin clorid và 0,015 mg palmatin clorid trong 1 ml methanol Kết quả cho thấy rằng sử dụng 3 dung môi trên để chiết đều thu được sắc ký đồ có 4 píc trong đó có 2 píc có thòi gian lưu và hình dạng giống với các píc berberin và palmatin chuẩn (hình 2b) Tuy nhiên thông qua kết quả về diện tích píc thu được có thể thấy rằng trong cùng điều kiện chiết, dung môi 3 cho phép chiết được lượng hoạt chất nhiểu nhất Từ kết quả trên, chúng tôi sử dụng dung môi 3 tiến hành chiết trên mẫu M3 (mẫu Hương liên hoàn tự tạo không chứa

Hoàng liên) Kết quả sắc ký đồ của mẫu M3 được ghi ở hình 2c cho thấy sử dụng

dung môi 3, vói các điều kiện chiết và điều kiện sắc ký đã chọn các thành phần khác trong viến Hương liên hoàn không ảnh hưởng đến việc định tính và định lượng đồng thcri berberin và palmatin trong viên Hương liên hoàn.

Channel 5

KromaSystem 2000 Version 1.83 RESULT REPORT: INTEGRATION

FREE - HOANGL.SMP (modified): Dinh luong Berberin va Palmatin.

No 95: Acquired : 26.03.02 13:34:58

Channel 5: CHANNEL 5 Processed: 24.07.02 14:08

No Text: Chuan hon hop Palmatin va Berberin

Program F i l e

Worksheet HOANGL

Peak T a b l e HOANGL Can't open file

Parameter Table HOANGL

Report F i l e

Document File

Hình 2a: sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp Palmatin (tK=12,96), Berberin (tH=14,ỉ9).

KromaSystem 2000 Version 1.83 RESULT REPORT: INTEGRATION

Dinh luong Berberin va Palmatin.

Channel 5

FREE - HOANGL.SM P :

Channel 5: CHANNEL 5 Processed:

No Text: Mau thu M2 (Mau Huong lien hoan tu t a o )

Program File

HOANGL HOANGL HOANGL

10:33:45 14:08

Hình 2b: sắc kỷ đồ của mẫu M2.

Channel 5

KromaSystem 2000 Version 1.83 RESULT REPORT: INTEGRATION

FREE - PTHAO.SMP: Dinh luong Berberin va Palmatin.

No 44 Acquired : 11.04.02 13:49:42

Channel 5: CHANNEL 5 Processed: 24.07.02 10:36

No Text: Mau M 3 (Mau Huong lien hoan tu tao khong chua Hoang lien)

Program File

Worksheet PTHAO

Peak Table PTHAO Can't open file

Parameter Table PTHAO

Report File

Document File

Bảng 1: Khảo sát chọn dung môi chiết.

tương ứng với số gam Hoàng liên

Diện tích pícPalmatin Berberin

xử lý như sau: bốc hơi các dịch chiết trên cách thuỷ tới cạn, cắn thu được hoà tan trong 2 ml nước, acid hoá bằng 2 giọt dung dịch acid sulfuric 10%, chuyển sang ống nghiệm Cho vào mỗi ống nghiệm đựng dịch chiết đã được xử lý như trên 2 giọt thuốc thử Mayer Kết quả thu được cho thấy, các dịch chiết lần 1 , 2 , 3 đều còn xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt, nhưng với dịch chiết lần 4 không còn thấy xuất hiện kết tủa nữa Bên cạnh đó chúng tôi cũng đã khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun hổi lưu cách thuỷ tới quá trình chiết Kết quả cho thấy thời gian chiết 30 phút, với lượng dung môi mỗi lần chiết là 25 ml là phù hợp Nếu thời gian chiết rút ngắn đi thì số lần chiết sẽ tăng lên do đó thời gian tổng cộng không giảm đi, ngược lại nếu tăng thời gian chiết thì số lần chiết cũng không giảm đi, vì vậy thời gian chiết tổng cộng sẽ tăng lên Hơn nữa nếu thời gian chiết kéo dài sẽ

có nhiều tạp chất có thể gây ảnh hưởng đến qúa trình định tính và định lượng

3.1.6 N hận xét.

Qua kết quả khảo sát các phương pháp chiết xuất berberin và palmatin trong bột dược liệu Hoàng liên và viên Hương liên hoàn, chúng tôi có thể rút ra môt số nhân xét sau:

- Đã có nhiều phương pháp chiết xuất berberin và palmatin từ dược liệu Hoàng liên, song hầu hết các phương pháp đưa ra đều chỉ phù hợp với việc chiết xuất dược liệu Hoàng liên đơn lẻ mà chưa phù hợp với việc chiết xuất chế phẩm đông dược đa thành phần có chứa Hoàng liên

- Phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu cách thuỷ với hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1) nêu ở DĐ Nhật 96 có thể chiết kiệt alcaloid trong Hoàng liên và cho dịch chiết tương đối sạch Nhưng khi áp dụng phương pháp này vào chế phẩm Hương liên hoàn thì dịch chiết thu được chứa nhiều tạp chất, do đó cần qua giai đoạn tinh chế để có thể áp dụng phương pháp định tính, định lượng bằng sắc ký lỏng

-Chiết xuất alcaloid bằng phương pháp lắc siêu âm với dung môi methanol hoặc phương pháp kết hợp cả đun hồi lưu cách thuỷ, lắc siêu âm và ngâm lạnh theo DĐ Trung Quốc 97 đều chưa chiết kiệt được alcaloid trong viên Hương liên hoàn

\J- Trong cùng điều kiện chiết hồi lưu cách thuỷ nhưng sử dụng 3 dung môi

khác nhau là ethanol, methanol, methanol-acid hydrocloric (100:1) thì dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1) chiết được nhiều hoạt chất cần nghiên cứu nhất

- Qua tham khảo tài liệu, kết hợp với các kết quả thực nghiệm thu được chúng tôi đã xây dựng phương pháp chiết berberin và palmatin từ dược liệu Hoàng liên như mô tả ở mục 2.3.1.2a và từ chế phẩm Hương liên hoàn như mô tả

ở mục 2.3.1.2.b Phương pháp này có một số ưu điểm sau:

+ Việc đưa thêm acid hydrocloric vào dung môi chiết xuất đã chuyển toàn

bộ lượng berberin và palmatin ở dạng base và các dạng muối khác trong mẫu nghiên cứu thành dạng muối clorid dễ tan trong methanol do đó có thể chiết kiệt được berberin và palmatin trong mẫu nghiên cứu

+ Do tính chất đặc biệt của berberin và palmatin ở dạng muối clorid hay ở dạng base đều dễ tan trong nước nóng, chúng tôi đã lợi dụng tính chất này để tinh chế dịch chiết, đảm bảo thu được dịch chiết đủ sạch để có thể tiến hành định tính

và định lượng bằng HPLC Như vậy, sử dụng phương pháp chiết xuất này chúng tôi đã giải quyết được một trong những vấn đề khó khăn trong việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại để định tính và định lượng các chế phẩm đông dược đó là làm thế nào để chiết kiệt được hoạt chất cần nghiên cứu trong chế phẩm đông dược với dịch chiết thu được đủ sạch

+ Thời gian và phương pháp chiết xuất đã sử dụng đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần nghiên cứu, mặt khác hạn chế được các tạp chất ảnh hưởng đến định tính và định lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên và đặc biệt là trong chế phẩm Hương liên hoàn Điều này đã được chứng minh qua việc áp dụng qui trình chiết xuất đã đề xuất đối với mẫu M3 không chứa Hoàng liên (hình 2c) Trên hình này, chúng ta có thể thấy sắc ký đổ thu được từ dịch chiết của mẫu M3 không chứa các píc có thời gian lưu gần hoặc trùng với thời gian lưu của berberin và palmatin

3.2 Xây dựng phương pháp định tính định lượng đồng thời berberin và palmatỉn bằng HPLC.

3.2.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký đ ể định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong Hoàng liên và viên Hương liên hoàn.

Trên cơ sở cột Lichrosorb RP8 (10 ịim, 250x4,0 mm) sẵn có, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như pha động, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện cho phép tách được berberin và palmatin trong dung dịch chuẩn hỗn hơp cũng như trong dịch chiết từ dược liệu Hoàng liên và trong chế phẩm Hương liên hoàn

3.2.1.1 Chọn pha động và tốc độ dòng thích hợp.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp berberin và palmatin: Cân và pha một dung dịch chuẩn hỗn hợp có chứa khoảng 0,060 mg berberin clorid và 0,015 mg palmatin clorid trong 1 ml methanol Lọc qua giấy lọc có đường kính lỗ xốp 0,45 jj,m (dung dịch chuẩn)

- Dung dịch mẫu thử: Chuẩn bị một m ẫu M) như đã chỉ dẫn ở mục2.3.1.2.a và một mẫu Mo như đã chỉ dẫn ở mục 2.2.1.2.b

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn và các dung dịch thử với các pha độngsau:

- Pha động ghi trong tạp chí Yaowo Fenxi Zazhi 18 (2) [29]

A ceto n itril: đệm phosphat pH=5,2 (11:9)

Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng

- Pha động ghi trong DĐ Nhật 96

Hoà tan 3,4 g kali dihydrophosphat, 1,7 g natri laurylsulfat trong 1000 ml hỗn hợp dung môi acetonitril: nước (1:1)

Nhiệt độ cột: 45°c

Bằng thực nghiệm, chúng tôi thấy sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và thử triển khai vói pha động là hỗn hợp acetonitril - đệm phosphat pH = 5,2 (11:9) 2 píc berberin và palmatin không tách khỏi nhau Trong khi đó, trên sắc ký đồ của các dung dịch phân tích triển khai theo các điều kiện ghi trong DĐ Nhật 96, 2 píc berberin và palmatin tách khỏi nhau chưa tốt Chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng tách berberin và palmatin từ hỗn hơp với pha động như đã ghi trong

DĐ Nhật 96, nhiệt độ cột ở 45°c và nhiệt độ phòng (27 ± 3°C), tốc độ dòng ở 0,5;

0,7 và 1 ml/phút nhằm chọn được điều kiện nhiệt độ cũng như tốc độ dòng thích hợp vừa đảm bảo tách được berberin và palmatin vừa rút ngắn được tối đa thời gian phân tích (Phụ lục 1)

Qua kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy, với cột Lichrosorb RP8 (10 ịim, 250x4 mm), tốc đô dòng 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng(27 ± 3°C) cho kết quả tách tốt, các píc nhọn và đối xứng, thời gian lưu ngắn (tR của palmatin khoảng 12 phút, tR của berberin khoảng 14 phút), do đó thời gian phân tích một mẫu chỉ mất khoảng 18 phút Kết quả của quá trình tách được trình bày

ở hình 3a, 3b, 3c