Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )

Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )

(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 2 0 0 2 - 2007)

Người hướng dẫn:

PGS TS Trần Đức Hậu Th.s Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa dược Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 8/2006 - 3/2007

HÀ NỘI - 2007

£ Ờ Z @ c  M Ơ Q l

OW/Vfe hỉí, ehfr tòi hày, tẢ Imtíị tuêí Ổ 4L &ău ếắa txà ehún thành nhâí tẩi những, MỊẨỈỈti thầy, đã tận tình ehl bả&f hưồềtụ dẫn, ạỉúfL ĩtđ tối haàễt thành Uhjổ€L luận nàự:

<£ &V4WL & h i ẨUíiỉ lỉôujổnjg,f íịiủ n q , oiềểL t ó I t í ổ n 3 K ế í f l iLưđn.

£7í5/ eủềiự, deiềi ạửi Lòi eúm ổn, chảtL thành lởi eổia tlĩầiẬ eàf eáễí hà eiĩa

hà niMi 'SôẩcL dưđ& đă giúp, đẵý động, úỉeti tồi ỉiíìitti thành khjẩ€L luận ễtàự

Obưt itư&a eảnt (Ui &ự ạúfL đẵ eủa eúa thầy, eA, eún eún bẠ ễễtâềi '3ŨOÚ phản tíefaf '3ôẩcL oA &đ.

Ulúeh lí tồi tvMUẶ thài ạiait qua

Sinh ữiỀết: (JJủ & h i ^dỉhănụ, j£f)nụ

1.2.1 Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh 4

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 13

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

2.3.3 Một số công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả 18

3.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin 20

bằng phương pháp HPLC

phương pháp mói xây dựng

: Dược điển Việt Nam III.

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High performance liquid chromatography) : Kiểm tra chất lượng

DANH MỤC CÁC BẢNG s ố LIỆU Trang

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 22Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun cách thủy 22Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng thuốc thử 23Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC 25

Bảng 3.6 Cách pha các dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính 29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.2 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 11Hình 3.1 Phổ hấp thụ của dẫn chất tạo bởi tobramycin vói thuốc thử X 21Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích 30

pic của dẫn chất tobramycin

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối 31

tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại

Hình 3.5 Sắc ký đồ của dẫn chất tạo bởi Tobramycin với thuốc thử X 33

ĐẶT VÂN ĐỂ •

Lịch sử ngành kháng sinh được hình thành từ khi Alexander Fleming tình cờ tìm ra Penicillin vào năm 1929 Qua một quá trình phát triển lâu dài cùng với những thành tựu lớn lao trong cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật, kháng sinh đã trở thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của y học hiện đại Tobramycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr(-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr(+) hiếu khí, hiện đang được sử dụng rộng rãi và có mặt trên thị trường dược phẩm với những dạng bào chế khác nhau: thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm Việc xác định hàm lượng của Tobramycin trong các chế phẩm là rất cần thiết

Cũng như những kháng sinh khác trong nhóm aminoglycosid,

Tobramycin không hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, vì vậy phương

pháp định lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật Phương pháp này mất nhiều thời gian và độ chính xác không cao Dược điển Anh áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ampe kế, thêm môi trường kiềm sau cột còn dược điển Mỹ cũng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhưng tạo dẫn xuất trước cột Nhìn chung cả hai phương pháp này đều rất phức tạp, dùng trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền Xuất phát từ yêu cầu thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu và xây dựng một quy trình định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn Trong khóa luận này, chúng tôi đã

tiến hành đề tài: " Nghiên cứu định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng

phương pháp HPLC M với mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Tobramycin nguyên liệu

2 Đánh giá phương pháp mới xây dựng với các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng.

cực nên khó đi vào các mô kể cả não Đạt nồng độ cao trong vỏ thận Dùng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con Đào thải chủ yếu qua thận, nên giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính Hiện nay dùng chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày cho thấy hiệu quả hơn và ít độc tính hơn dùng liều nhỏ và

nhiều lần trong ngày như trước đây Trừ các ca nặng (nhiễm Pseu aeruginosa

ò người giảm neutrophile và các ca suy thận (cần khoảng cách liều dài hơn 24

giờ) Thời gian bán thải của Tobramycin: 2 - 5 giờ [5]

1.1.5 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr(-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr(+) hiếu khí Thuốc không

có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí.

Tobramycin rất giống Gentamycin về tính chất vi sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với

protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận.

Điểm quan trọng nhất của Tobramycin là có hoạt tính đối vói phần lớn

các chủng Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn cả Gentamycin.

Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn

nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch vói các tiểu phân 30S của ribosom [2], [9]

1.1.6 Chỉ định

Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tói tính mạng đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr(-)

Trong điều tri các bệnh nhiễm khuẩn nặng, Tobramycin được phối hợp vói một kháng sinh nhóm beta-lactam Trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng

toàn thân do Pseudomonas spp gây ra, Tobramycin có thể dùng phối hợp vói một kháng sinh nhóm beta-lactam chống Pseudomonas.

Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha - Streptococcus gây ra có thể dùng Tobramycin phối hợp vói ampicilin hoặc

benzilpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ [2 ]

1.1.7 Chống chỉ định

Với người có tiền sử dị ứng vói các kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe kém và người có bệnh thận [2 ]

1.1.8 Dạng bào chế và liều lượng

Tobramycin sulphat: dung dịch tiêm 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em) IM, IV Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ

Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %

Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm

P aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa [9]

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN

1.2.1 Định lưọng Tobramycin bằng phương pháp vi sinh

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15]

- Môi trường định lượng:

pH sau khi tiệt trùng :8,2 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử

Cân chính xác khoảng 25,0 mg Tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ Tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20IU/ml và 40 IU/ml

- Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp hoạt lực kháng sinh-DĐVNIII

1.2.2 Định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Dung dịch tạo dẫn xuất sau cột: dungdịch-ữatrihyđroxyd 2% pha trong nước đã loại C 02 Tốc độ 0,3 ml/phút.

- Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tương tự

1.2.2.3 Phương pháp 3 [13]

- Cột Purospher® STARRP-18e (4 X 55 mm, 3 |nm, Merck)

- Pha động: acetonitril - nước (50:50)

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất vối dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 70°c.

- Pha động B: acetonitril

- Tiến hành sắc ký theo chương trình Gradient dung môi như sau:

1.3 TỔNG QUAN VỂ HPLC

1.3.1 Nguyên tắc

Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi

là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in [7]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ [7], [8 ]

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau:

1.3.3.1 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar)

1.33.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 |j.m ) và đuổi khí hòa tan

13.3.3 Hệ tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột

Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động

Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp qua màng lọc 0,45 n,m, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi thích hợp

1 3 3 4 Cột sắc kỷ lỏng HPLC

Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ vói hóa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar

- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp vói các tiểu phân pha tĩnh có

đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 Ịim).

- Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm

Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách Nếu sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm Ví dụ dung môi có tính chất acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm

1.3.3.5 Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay sử dụng là detector hấp thụ u v - VIS

Nguyên lý hoạt động của detector uv - VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ Ngoài ra còn có detector khúc

xạ, huỳnh quang, điện hóa

1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết quả

Có nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu

đo dưới dạng pic [7], [10]

Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 1.1

Hình 1.1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC

1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Hình 1.2: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại

và ghi thành sắc ký đồ với các thông số:

* tR (Thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất phân tích được bơm vào

cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cựu đại của nó

* to (Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ

thống sắc ký

* tR’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR -1 0

* w0 5 : Độ rộng của pic ở nửa chiều cao.

* Wb : Độ rộng ở đáy pic

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng

số đối vói một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

1.3.4.1 Hệ số dung lượng k

I I _ l R _ I r l o _ I r ị

to to to

Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém Trong thực tế k' nằm trong

khoảng 2 - 5 là tốt nhất Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá

trị khác nhau Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8

1.3.4.2 Độ chọn lọc a (selectivity - factor)

k '2 _ Í r 2 to

k ’l t u i - t o

(k2 > k,') [7], [10]

a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2

1.3.4.3 Độ phân giải (resolution)

Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:

W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1 / 2 0 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1 / 2 0 chiều cao của pic

Trong phép định lượng, yêu cầu: 0,9 ^ AF ^ 2 [1 ],[1 9 ],[1 7 ]

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.3.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh) [10], [19]

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Nó là một chất rắn xốp có kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 - 10 ịim, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m2/g

Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:

• Phải trơ và bền vững trong môi trường HPLC

* R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl được chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, Cg, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl)

Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion.

1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [10], [19]

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như độ chọn lọc a, thời gian lưu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải

Rs , độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

Yêu cầu của pha động:

• Phải trơ với pha tĩnh

• Hòa tan được chất cần phân tích

• Bền vững theo thời gian

• Có độ tinh khiết cao

• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

• Phù hợp vối detector

• Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform Các pha động này thường được bão nước

Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:

• Bản chất của dung môi để chạy pha động

• Thành phần của các chất trong pha động

• pH của pha động

• Tốc độ dòng của pha động

1.3.5.3 Chọn đệm pH

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base thường phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký

Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký [10], [19]

1.3.5.4 Tốc độ dòng

Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn

để quá trình tách tốt hơn là tốc độ dòng [10], [19]

1.3.6 Cách đánh giá pic

* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng

lượng chất đó Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn vói máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %) Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi Phương pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho và cho kết quả tốt với nồng

độ vừa, trung bình và cao

* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

(khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ vói diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k là hằng định

* Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic

Qua qúa trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất.

1.3.7.1 Định lượng:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:

> Phương pháp chuẩn ngoại (external Standard method)

Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử vói pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ

> Phương p h á p chuẩn nội (in te r n a l S ta n d a rd method)

Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội

> Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation)

+ Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so vói tổng diên tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện, và tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau

+ Áp dụng: ít dùng, chỉ dùng trong xác định hàm lượng tạp chất khi coi đáp ứng của các tạp là như nhau [1 0], [19]