1. Lý do chọn đề tài. Trong cuộc sống hiện đại cơ thể chúng ta luôn cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp các chất này có nhiều trong thực phẩm ăn hàng ngày. Các chất dinh dưỡng chính là các nhóm cung cấp năng lượng cho cơ thể như glucid, protein, lipid, nhóm cung cấp muối khoáng, nhóm cung cấp vitamin và nước. Một trong số các loại vi chất quan trọng đã được bổ sung vào thực phẩm đó là các loại vitamin. Vitamin là một nhóm các hợp chất hóa học khác nhau nhưng có một điểm chung duy nhất là một lượng nhỏ chúng cần thiết cho các hoạt động bình thường và duy trì sự trao đổi chất của cơ thể 24. Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt so với những loại khác. Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của con người, như nó đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sự ổn định của xương, răng, nó tham gia vào điều hòa chức năng của một số gen, ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiết của insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới. Một số nghiên cứu mới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăng trưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng. Tình trạng thiếu vitamin D trên thế giới cũng như các nước nhiệt đới rất nghiêm trọng.Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc với ánh nắng có lợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày. Trong đó trứng và các loại sữa là các sản phẩm chứa hàm lượng vitamin D3 dồi dào. Vitamin B2 có nhiều vai trò quan trọng đối với cơ thể. Nó là thành phần quan trọng của các men oxidase, trực tiếp tham gia vào các phản ứng oxy hóa hoàn nguyên, khống chế các phản ứng hô hấp chuyển hoá của tế bào, chuyển hoá các chất đường, đạm, béo ra năng lượng để cung cấp cho các tế bào hoạt động, tác động đến việc hấp thu, tồn trữ và sử dụng sắt trong cơ thể (rất quan trọng trong việc phòng chống thiếu máu do thiếu sắt). Có thể bổ sung vitamin B2 từngũ cốc, rau xanh, đậu các loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách, nấm, cá...Tuy nhiên nấm là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng lớn nhất thế giới chưa được khai thác đầy đủ. Nấm rất giàu protein, khoáng chất, vitamin, chất xơ và các axit amin thiết yếu và là một trong những nguồn giàu vitamin đặc biệt là vitamin B. Nấm có chứa một lượng lớn các vitamin như Thiamin 1,42,2mg (%), Riboflavin 6,79,0mg (%), Niacin 60,673,3mg (%), Biotin, axit ascorbic 92144mg (%), axit plantothenic 21,1 – 33,3mg (%) và axit folic 1,2 – 1,4mg 100g trọng lượng khô26. Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D3, B2 trong thực phẩm, trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho phép phân tích với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu “Xác định hàm lượng vitamin D3 trong một số sản phẩm thực phẩm và vitamin B2 trong nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)”. 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích vitamin D3, B2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số đối tượng: trứng, sữa, nấm. 3. Mục tiêu nghiên cứu + Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ, độ nhạy cao. + Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D3, B2 trong một số loại trứng, sữa, nấm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các mẫu thực phẩm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh. Mẫu sau khi thu thập được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C (đối với mẫu trứng, sữa). Các mẫu nấm ở vùng Bắc Trung Bộ và được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm vi sinh của trường Đại học Vinh.
MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong sống đại thể cần cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp chất có nhiều thực phẩm ăn hàng ngày Các chất dinh dưỡng nhóm cung cấp lượng cho thể glucid, protein, lipid, nhóm cung cấp muối khống, nhóm cung cấp vitamin nước Một số loại vi chất quan trọng bổ sung vào thực phẩm loại vitamin Vitamin nhóm hợp chất hóa học khác có điểm chung lượng nhỏ chúng cần thiết cho hoạt động bình thường trì trao đổi chất thể [24] Vitamin D hay gọi vitamin mặt trời loại vitamin đặc biệt so với loại khác Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống người, đóng vai trò quan trọng phát triển, hồn thiện, trì ổn định xương, răng, tham gia vào điều hòa chức số gen, ngồi tham gia số chức như: tiết insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản da nữ giới Một số nghiên cứu cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ sinh nhẹ cân, tăng trưởng chậm trẻ chào đời đủ tháng Tình trạng thiếu vitamin D giới nước nhiệt đới nghiêm trọng.Để nhận đủ vitamin D ngồi việc cho thể tiếp xúc với ánh nắng có lợi cho thể thường xuyên cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày Trong trứng loại sữa sản phẩm chứa hàm lượng vitamin D3 dồi Vitamin B2 có nhiều vai trò quan trọng thể Nó thành phần quan trọng men oxidase, trực tiếp tham gia vào phản ứng oxy hóa hồn ngun, khống chế phản ứng hơ hấp chuyển hố tế bào, chuyển hoá chất đường, đạm, béo lượng để cung cấp cho tế bào hoạt động, tác động đến việc hấp thu, tồn trữ sử dụng sắt thể (rất quan trọng việc phòng chống thiếu máu thiếu sắt) Có thể bổ sung vitamin B2 từngũ cốc, rau xanh, đậu loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách, nấm, cá Tuy nhiên nấm nguồn thực phẩm dinh dưỡng lớn giới chưa khai thác đầy đủ Nấm giàu protein, khoáng chất, vitamin, chất xơ axit amin thiết yếu nguồn giàu vitamin đặc biệt vitamin B Nấm có chứa lượng lớn vitamin Thiamin 1,4-2,2mg (%), Riboflavin 6,7-9,0mg (%), Niacin 60,6-73,3mg (%), Biotin, axit ascorbic 92-144mg (%), axit plantothenic 21,1 – 33,3mg (%) axit folic 1,2 – 1,4mg /100g trọng lượng khơ[26] Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D 3, B2 thực phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cho phép phân tích với độ nhạy độ chọn lọc cao Vì lựa chọn đề tài nghiên cứu “Xác định hàm lượng vitamin D3 số sản phẩm thực phẩm vitamin B nấm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC)” Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích vitamin D3, B2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, từ xác định hàm lượng chúng số đối tượng: trứng, sữa, nấm Mục tiêu nghiên cứu + Thiết lập phương pháp phân tích đảm bảo độ xác, độ hội tụ, độ nhạy cao + Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D 3, B2 số loại trứng, sữa, nấm Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các mẫu thực phẩm thu thập chợ địa bàn thành phố Vinh Mẫu sau thu thập bảo quản tủ lạnh 40C (đối với mẫu trứng, sữa) Các mẫu nấm vùng Bắc Trung Bộ ni cấy phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Vinh Hình 1.1 Hình ảnh số mẫu sữa bột 2 Hình 1.2 Sữa đậu nành fami Hình Sữa tươi vinamilk Hình 1.4 Sữa chua probi Hình 1.5 Trứng gà 3 Hình 1.6 Nấm 01(Ganoderma lucidum) Hình 1.8 Nấm lỗ (Hexagonia apiaria) Hình 1.7 Nấm TH 04 (Ganoderma nigrolucidum) Hình Nấm HKG 401(Ganoderma pfleifferi) 4 Hình 1.10 Nấm HKG 406 (Amauroderma schmburgkii) Chương 1: TỔNG QUAN Tổng quan về vitamin 1.1 Giới thiệu về vitamin 1.1.1 Khái niệm Vitamin nhóm hợp chất hữu cơ, với lượng nhỏ, cần thiết cho hoạt động bình thường thể người Chúng thay đổi chức hóa học, sinh lý phân bố rộng rãi nguồn thức ăn tự nhiên [19] 1.1.2 Phân loại 5 Mười ba vitamin ghi nhận chế độ dinh dưỡng người chúng xếp thành hai nhóm theo độ tan chúng Các vitamin tan chất béo đại diện vitamin A, D, E K; bao gồm khoảng 50 carotenoid mà có mức độ hoạt động khác vitamin A Các vitamin tan nước bao gồm vitamin C thành viên nhóm vitamin B, cụ thể thiamin (vitamin B 1), riboflavin (vitamin B2), niacin, vitamin B6, axit pantothenic, folate vitamin B12 Đây cách phân loại đơn giản phản ánh hoạt tính sinh học vitamin, độ hòa tan ảnh hưởng đến phương thức hấp thu đường ruột chúng hấp thu tế bào Các đặc tính độ tan liên quan đến việc phân bố vitamin nhóm thực phẩm khác ảnh hưởng trực tiếp đến sử dụng phương pháp phân tích [19] 1.1.3 Hoạt tính vitamin Thuật ngữ “hoạt tính sinh học” áp dụng cho thực phẩm có loại vitamin chế độ dinh dưỡng người, dùng để tỷ lệ số lượng vitamin trải qua hấp thụ đường ruột vào thể Bao gồm vận chuyển vitamin hấp thu đến mô tế bào Cuối vitamin chuyển hóa thành dạng thực số chức sinh hóa sinh lý, chuyển hóa sang dạng khơng có chức cho tiết giự trữ Thành phần hoạt tính sinh học yếu tố tỷ lệ giới hạn hấp thụ Hoạt tính sinh học tương đối thường thể dạng tỷ lệ phần trăm phản ứng thu với chất chuẩn có hoạt tính sinh học cao [19] Trong hấp thu đường ruột, hoạt tính sinh học vitamin phụ thuộc vào dạng hóa học trạng thái vật lý vitamin tồn thực phẩm Các tính chất bị ảnh hưởng tác động chế biến thực phẩm nấu ăn, đặc biệt trường hợp tiền vitamin A carotenoid, niacin, vitamin B6 folate Thành phần chế độ ăn làm chậm tăng cường hấp thụ vitamin, thành phần chế độ ăn uống yếu tố quan trọng hoạt tính sinh học 1.1.4 Các yếu tớ ảnh hưởng đến vitamin 6 Các yếu tố làm giảm lượng vitamin q trình oxi hóa, nhiệt (nhiệt độ thời gian), bị ảnh hưởng xúc tác kim loại, độ pH, ảnh hưởng enzym, độ ẩm, xạ (ánh sáng xạ ion hóa) kết hợp đa dạng yếu tố Các vitamin tan nước dễ bị mát trình rửa, nhúng nấu nước Vitamin C dễ bị oxi hóa hóa chất q trình xử lý, bảo quản nấu ăn.Thiamin nhạy với thực phẩm có tính trung hòa tính kiềm khơng bền khơng khí Riboflavin dễ bị phân hủy ánh sáng Niacin vitamin B6 ổn định với nhiều môi trường xử lý Vitamin A vitamin E bị phá hủy điều kiện đẩy nhanh trình oxi hóa chất béo chưa bão hòa, ví dụ như: khơng khí, nhiệt độ, ánh sáng, ion kim loại vết thời gian bảo quản Vitamin K ổn định với nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng huỳnh quang ánh sáng mặt trời Vitamin D bị ảnh hưởng xử lý bảo quản [19] 1.2 Vitamin D 1.2.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi Vitamin D chất tinh thể hình kim khơng màu, khơng mùi, khơng tan nước, hòa tan dầu mỡ, dung mơi hữu etanol, metanol Tên gọi khác vitamin D calciferol Vitamin D nhóm gồm từ D đến D7 song có hai hoạt tính mạnh vitamin D2 gọi Ergocalciferol vitamin D3 gọi Cholecalciferol Đối với người hợp chất quan trọng nhóm vitamin D vitamin D vitamin D2 đưa vào thể qua đường tiêu hóa biện pháp y tế khác Cơ thể tổng hợp vitamin D da từ cholesterol, da tiếp xúc với tia UV (có ánh nắng mặt trời) mệnh danh "vitamin ánh nắng" [18] Mặc dù vitamin D thường gọi vitamin, theo nghĩa hẹp khơng phải vitamin thiết yếu chế độ ăn, hầu hết động vật có vú tự nhiên tự tổng hợp đủ cho thể tiếp xúc hợp lý với tia nắng mặt trời 7 Hình 1.11 Khái quát cấu trúc chuyển hóa dạng vitamin D 1.2.2 Vai trò vitamin D đới với thể Vitamin D đóng vai trò quan trọng phát triển xương Vitamin D có vai trò quan trọng với hấp thụ canxi ruột mà canxi cần thiết cho hoạt động tim, bắp thần kinh, thành phần chủ yếu cấu tạo nên xương răng, đồng thời thiếu để tham gia vào q trình đơng máu Trẻ em thiếu canxi chậm lớn, lùn, còi xương, xương biến dạng, khơng đều, dị hình, chất lượng bị sâu[20] [17] Người lớn thiếu vitamin D dẫn đến bệnh lỗng xương[17] Vitamin D tham gia vào q trình điều hòa calci máu, ức chế tế bào ung thư Một lượng nhỏ vitamin D ngày làm giảm nguy mắc bệnh cao huyết áp, giúp làm tăng khả miễn dịch, ngừa số bệnh ung thư phổ biến, làm chậm trình phát triển ung thư đặc biệt ung thư gan, ung thư đại trực tràng[30] Thiếu vitamin D thai kì sinh nhẹ cân, đặc biệt thiếuvitamin D tháng đầu thai kì, sinh bị hạn chế tăng trưởng gấp đơi, thiếu vitamin D thai kì gây tổn thương não phục hồi[30] Trẻ em không cung cấp đủ vitamin D ảnh hưởng đến phát triển xương, chất xương sụn khơng vơi hóa đầy đủ, sụn phát triển khơng bình thường, làm xương biến dạng[17][20][30] 8 Vitamin D có ảnh hưởng đến nồng độ serotonin não, gây ảnh hưởng đến tâm trạng người Serotonin có tên gọi hc mơn hạnh phúc, suy giảm serotonin khiến tâm trạng buồn chán dễ cáu giận, khơng thể kiểm sốt bốc đồng, thiếu vitamin D kéo dài dễ dẫn tới trầm cảm[17] Do tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, dễ bị thiếu hụt vitamin quan trọng này, dù có ăn chế độ lành mạnh tập thể dục đặn Tuy nhiên dung vitamin D liều gây chứng tăng calci máu, tăng calci niệu, đau nhức xương khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, gây suy nhược mệt mỏi… Năm 1989 theo khuyến cáo ủy ban dinh dưỡng Hoa Kỳ (RDA) vitamin D cần bổ sung 10mcg/ ngày tuổi từ 51-70 15mcg/ ngày tuổi cao 1.2.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho thể Cơ thể người nhận vitamin D cách: qua da, chế độ ăn uống bổ sung bằng thuốc Hầu hết chế độ ăn uống tự nhiên người có chứa vitamin D, trừ chế độ ăn giàu nguồn gốc hoang dã, cá béo Một lượng nhỏ vitamin D có thực phẩm tăng cường, bổ sung sữa, nước cam loại ngũ cốc Mỹ, bơ thực vật châu Âu, nguồn cung thường nguồn đóng góp nhỏ cho nguồn vitamin D thể Theo truyền thống, nguồn vitamin D người da, bắt nguồn từ miệng Sự tổng hợp vitamin D da xảy nhanh chóng mạnh mẽ, trình tổng hợp diễn dễ dàng sau vài phút tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chế độ ăn uống nguồn cung cấp vitamin D cho thểcho dự trữ tuần hồn, xem chức phần bề mặt da hở Nguồn cung cấp vitamin D qua da giúp cung cấp 80-85% nhu cầu vitamin D thể Dưới tác dụng tia cực tím tiền chất vitamin D có tuyến bã lớp Malpighi biểu bì chuyển thành vitamin D Nếu phơi nắng đầy đủ, sau giờ, 1cm da sản xuất 18IU vitamin D3[21] Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác qua thức ăn Vitamin D có nguồn thực phẩm từ động vật (D3 )và thực vật (D2), có nhiều thực phẩm dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật 1.2.4 Tình hình nghiên cứu nước và giới Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật tiên tiến, với bùng nổ ngành công nghệ thông tin, hàng loạt hệ thống máy phân tích hóa học cải tiến nâng cấp nhằm xác định nhiều loại chất hóa học Trên giới nhiều nhà phân tích hóa học có nhiều cơng trình nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D thực phẩm thịt, cá,sữa máu Một số nghiên cứu đưa hàm lượng vitamin D cá thu 15mcg/100g, trứng gà 2mcg/100g 9 Còn Việt Nam chúng tơi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D thực phẩm chưa làm nhiều 1.3 Vitamin B2 1.3.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi Vitamin B2 tinh thể nhỏ, hình kim, có màu vàng da cam, nhiệt độ nóng chảy 292 C, phát huỳnh quang xanh chiếu tia tử ngoại vào Vitamin B2 có vị đắng, hòa tan tốt nước rượu, khơng hòa tan dung mơi hữu cơ: benzen, ete… Bền với nhiệt, dung dịch axit, chất chống oxy hóa không bền với ánh sáng Khi tiếp xúc với ánh sáng vitamin B2 thường bị hoạt tính Do người ta thường dùng lọ màu nâu để bảo quản vitamin B2 Tên thông thường: vitamin B2, riboflavin, lactoflavin,ovoflavin - Công thức phân tử: C17H20N4O6 - Khối lượng phân tử: 376,36 g/mol - Công thức cấu tạo Dưới tác dụng tia cực tím mơi trường kiềm Riboflavin chuyển hóa thành lumiflavin, mơi trường axit chuyển thành lumichrome Lumiflavin (mơi trường kiềm) Lumichrome (môi trường axit) Trong thể người riboflavin dễ bị phosphoryl hóa tạo nên nhóm hoạt động enzim xúc tác cho q trình oxy hóa-khử Các coenzim thường gặp: Riboflavin mononucleotit (FMN) riboflavin- adenin- dinucleotit (FAD) 1.3.2 Vai trò vitamin B2 đới với thể - Cân dinh dưỡng: Vitamin B2 tham gia vào chuyển hoá thức ăn thành lượng thơng qua việc tham gia chuyển hố glucid, lipid protein bằng enzyme để cung cấp cho tế bào hoạt động 10 10 Hình 3.14 Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 10ppm Hình 3.15 Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 50ppm Sử dụng phần mềm xây dựng đường chuẩn hệ thống HPLC, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin B2 sau: Y = 118,37x + -10,963 45 45 x nồng độ, y diện tích pic Hình 3.16 Đường chuẩn vitamin B2 3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp phân tích 3.2.3.1 Giới hạn phát LOD Giới hạn phát LOD nồng độ mà giá trị xác định lớn độ không đảm bảo đo phương pháp.Đây nồng độ thấp chất phân tích mẫu phát hiên chưa thể định lượng LOD xác định dựa vào độ dốc đường chuẩn độ lệch chuẩn tính hiệu đo Trong đó: SD độ lệch chuẩn tín hiệu a độ dốc đường chuẩn Giá trị LOD phương pháp qua lần đo nồng độ khác 0,5ppm; 10ppm; 50ppm ta LOD chuẩn vitamin B2 bằng 0,0054 ppm 3.2.3.2 Giới hạn định lượng LOQ LOQ nồng độ tối thiểu chất có mẫu thử mà ta định lượng bằng phương pháp khảo sát cho kết qủa có độ chụm mong muốn Do đó, giới hạn định lượng chuẩn vitamin B qua lần đo với nồng độ khác 0,5ppm; 10ppm 50ppm 0,018 ppm 3.2.4 Xác định hàm lượng vitamin B2 nấm Qua số liệu LOD LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát khoảng giới hạn định lượng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát hàm lượng vitamin B2 dạng vết có mẫu phân tích Hàm lượng vitamin B2 (mg/kg) có mẫu nấm tính theo cơng thức sau: Trong đó: C hàm lượng vitamin B2 có mẫu, tính theo mg/kg Co hàm lượng vitamin B2 có dịch chiết thơng qua đường chuẩn, mg/l f hệ số pha lỗng (nếu có) m khối lượng mẫu thử (g) Vdm thể tích bình định mức mẫu (ml) Ta có bảng kết phân tích hàm lượng vitamin B2 mẫu nấm 46 46 Hình 3.17 Sắc đồ mẫu nấm HKG 406 Hình 3.18 Sắc đồ mẫu nấm HKG 401 47 47 Hình 3.19 Sắc đồ mẫu nấm TH04 Bảng 3.6 Kết phân tích hàm lượng vitamin B2 nấm Mẫu Co (ppm) HKG 406 Nấm lỗ HKG 401 TH 04 01 0,22743 0,21174 0,51756 0,10458 0,15005 Khối lượng Thể tích mẫu mẫu (ml) 10 50 10 50 10 50 10 50 10 50 48 48 Diện tích pic C ( ppm) 20,21801 18,28830 55,89994 5,10844 10,70119 1,1371 1,0587 1,2939 0,5229 0,7502 3.2.5 Đánh giá phương pháp 3.2.5.1 Đánh giá độ lặp lại phương pháp Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo cơng thức sau: Trong đó: • • • • SD độ lệch chuẩn n số lần thí nghiệm Xi giá trị tính trị trung bình lần thực thứ i giá lần thực Thực phân tích 10g nấm, tiến hành phân tích lặp lại lần điều kiện Kết phân tích lặp lại lần độ lặp lại phương pháp nêu bảng Bảng 3.7 Kết trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu nấm TT SD CV HKG 406 Thể Nồng tích độ 10 1,1371 10 1,1242 10 1,1058 1,1223 0,015 1,33% Nấm lỗ Thể Nồng tích độ 10 1,0587 10 1,0413 10 1,0625 1,0541 0,011 1,04% HKG 401 Thể Nồng tích độ 10 1,2939 10 1,3082 10 1,2715 1,2912 0,018 1,39% 49 49 TH 04 Thể Nồng tích độ 10 0,5229 10 0,5073 10 0,5486 0,5262 0,02 3,80% 01 Thể tích 10 10 10 Nồng độ 0,7502 0,7721 0,7306 0,7509 0,02 2,66% - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 mẫu nấm HKG 406 = 1,1223 Độ lệch chuẩn: = 0,015 Hệ số biến thiên: - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 mẫu nấm lỗ = 1,0541 Độ lệch chuẩn: = 0,011 Hệ số biến thiên: - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 mẫu nấm HKG 401 = 1,12912 Độ lệch chuẩn: = 0,018 Hệ số biến thiên: - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 mẫu nấm TH 04 = 0,5262 Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên: - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin B2 mẫu nấm 01 = 0,7509 Độ lệch chuẩn: = 0,02 Hệ số biến thiên: Nhận xét: Theo AOAC hệ số biến thiên CV phép đo nằm khoảng ±10,5% Kết cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao đáp ứng yêu cầu định lượng 3.2.5.2 Xác định hiệu suất thu hồi Độ thu hồi tính theo cơng thức sau: Trong đó: • • • • H% độ thu hồi, % Cm+c nồng độ chất phân tích mẫu thêm chuẩn Cm nồng độ chất phân tích mẫu thử Cc nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ta có bảng kết độ thu hồi mẫu nấm lỗ Bảng 3.8 Kết độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ TT Nồng độ (ppm) Cm+c Cm 2,0372 1,0587 2,0125 1,0413 2,0361 1,0625 Cm+c - Cm 0,9785 0,9712 0,9736 50 50 Cc (ppm) 1 %R 97,85% 97,12% 97,36% Từ bảng kết ta có giá trị trung bình %R mẫu nấm lỗ là: = 97,44% Độ lệch chuẩn = 0,372 Hệ số biến thiên: = 0,381% Nhận xét: Dựa vào kết tính ta thấy độ thu hồi phép đo lặp lại lớn khoảng 97% nằm giới hạn cho phép AOAC (90 ± 8%) Điều chứng tỏ rằng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin B nấm có độ xác cao.Đáp ứng nhu cầu phân tích KẾT LUẬN 51 51 Trên sở kết thực nghiệm xác định vitamin D mẫu thực phẩm (trứng, sữa) vitamin B2 mẫu nấm nuôi trồng phòng thí nghiệm trường Đại học Vinh, tơi đạt kết sau: - Đánh giá khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng vitamin D3, B2 Độ lặp lại độ thu hồi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao + Vitamin D3 có: LOD 0,0037 LOQ 0,0111 + Hàm lượng vitamin D3 : • • • • • • • Sữa chua probi 709,19050ppm Trứng gà 44,18800ppm Sữa bột dielac alpha gold 22,13575ppm Sữa bột dielac mama 33,31925ppm Sữa bột dielac optimum 51,22275ppm Sữa tươi vinamilk 24,67150ppm Sữa đậu nành 15,76250ppm + Vitamin B2 có LOD 0,0504 LOQ 0,018 + Hàm lượng vitamin B2 xác định nấm : • • • • • Nấm HKG 406 1,1371ppm Nấm lỗ 1,0587ppm Nấm HKG 401 1,2939ppm Nấm TH 04 0,5229ppm Nấm 01 0,7502ppm - Xác định quy trình phân tích vitamin D3, B2 số loại thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Từ kết thu chúng tơi thấy áp dụng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin D3 mẫu thực phẩm, vitamin B2 mẫu nấm với độ tin cậy cao tiếp tục nghiên cứu đa dạng vitamin, mẫu thực phẩm Đây phương pháp có nhiều ưu điểm phân tích vitamin D 3, B2.Nếu có thể, tơi mong tiếp tục nghiên cứu nhiều loại vitamin nhiều loại thực phẩm 52 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Quốc gia, Trung tâm khuyến nông Quốc gia (2008), Nấm ăn sở khoa học công nghệ nuôi trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [2] Lâm Xuân Thanh, Công nghệ sản phẩm sữa, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật [3] Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Khoa hóa học, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội [4] Nguyễn Khắc Nghĩa (2000), Các phương pháp phân tích sắc ký, ĐHSP Vinh [5] Hồng Kim Anh, Hóa học thực phẩm (2006), Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật [6] Lê Ngọc Tú, Hóa sinh cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật [7] Hoàng Minh Châu, Từ Vọng Nghi, Từ Văn Mặc Cơ sở hóa học phân tích Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật [8] Lê Lý Thùy Trâm (2007), Bài giảng Nấm ăn vi nấm, ĐHBK Đà Nẵng [9] Nguyễn Tinh Dung (2000), Hóa học phân tích, phương pháp phân tích định lượng hóa học, NXB Giáo dục [10] PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa Xử lí số liệu thống kê DHVinh [11] Hồ Viết Quý (1994), Xử lý số liệu thực nghiệm, phương pháp toán học thống kê, ĐHSP Quy Nhơn [12] Viện kiểm nghiệm Định lượng Vitamin NXB Y học [13] Trần Tứ Hiếu, Đặng Ứng Vận, Mai Xuân Trường (2007) Phương pháp trắc quang định lượng đồng thời vitamin B1, B2, B3, B6, B12 vitamin PP hỗn hợp theo phương pháp lọc KALMAN Tạp chí phân tích hóa lý sinh học [14] PGS.TS Trần Thị Xơ Hóa sinh I Trường ĐH Bách khoa Khoa hóa ĐH Đà Nẵng [15] Nguyễn Hữu Nhân Dinh dưỡng học NXB Nông nghiệp Tiếng anh: [16] Angelika Gratzfeld-Huesgen (1997) HPLC analysis of viatmins in tables using HPLC Agilent technologies, publication number 5966 -0639E [17] DeLuca Hector F;(2004), Overview of general physiologic features and functions of vitamin D, American Society for Clinical Nutrition, USA [18] Clifford J Rosen , (2011) “Vitamin D Insufficiency”, Massachusetts Medical Society [19] George F.M Ball (2006) Vitamins in foods Analysis, Bioavailability, and Stability Taylor & Francis group [20] Atisha Pandya et al, (2010) “A case series of vitamin D deficiency in mothers affecting their infants” , SNL All rights reserved , UK, Vol [21] Bilal Ahmad Wani, R.H Bodha, and A.H.Wani (2010) Nutritional and medicinal imfortance of mushrooms Journal of medicinal Plants research, vol (24), pp 2598- 2604 [22] Chang S.T (2008) Mushrooms as Functional Foods Wiley 53 53 [23] Chang S.T and Miles P.G (2004) Mushroom cultivaton, nutritional value, medicinal effect, and enviroment impact Second edition CRC press p.1-41 [24] David A B (2003) Nutritional biochemistry of the vitamins Second edition, Cambridge university press [25] Janos Z, Robert B.R, Donald M.C, John W.S (2007) “Handbook of vitamins”.Fourth edition.CRC Press Taylor & Francis group [26].Kakon A.J, Md Bazlul Karim Choudhury, Shusmita Saha (2012) Mush is an ideal food supplement J.Dhaka National Med.Cod.Hoss [27] Regina Prado Zanes Furlani, Helena T.G (2008) Analytical nutritional and Clinical Methods Vitamin B1 and B2 contents in cultivated mushrooms Food chemistry [28] AOAC 981.17 (1982), Vitamin D in Fortified Milk and Milkpowder - Liquid Chromatographic Method [29] AOAC 992.26, (1995),Vitamin D3 (cholecalciferol) in ready-to-feed milk-based infant formula Liquid chromatographic method [30] A Catharine Ross et al, (2011), Dietary Reference Intakes For Calcium And Vitamin D, National Academy of Sciences, Washington, D.C [31] Anders Staffas et al,(2003), “Determination of Cholecalciferol (Vitamin D3) in Selected Foods by Liquid Chromatography”, Journal Of AOAC International Trang web: [32] http://idoc.vn/tai-lieu/xac-dinh-ham-luong-vitamin-d-d2-va-d3-trong-thuc-pham-bangphuong-phap.html [33] http://www.hoahoc.org [34] http://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_D [35] http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=820 [36] http://123doc.org/document/927970-xac-dinh-ham-luong-vitamin-b2-bang-phuongphap-trac-quang.htm [37] http://123doc.org/document/1342713-cac-phuong-phap-xac-dinh-ham-luong-vitamintrong-thuc-pham.htm [38] 54 54 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Võ Thị Huyền Nguyễn Thị Khánh Huyền Msv: 1052043927 Msv: 1052043941 Khóa : 51 Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài: Xác định hàm lượng vitamin D3 số sản phẩm thực phẩm và vitamin B2 nấm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Cán hướng dẫn Ngày giao nhiệm vụ đồ án Ngày hoàn thành đồ án : : : ThS Hoàng Văn Trung Ngày tháng năm 2014 Ngày tháng năm 2014 Ngày tháng năm 2015 Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) Chủ nhiệm môn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO tháng năm 2015 Người duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM 55 55 TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: : Võ Thị Huyền Nguyễn Thị Khánh Huyền Msv: 1052043927 Msv: 1052043941 Khóa: 51 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn: ThS Hoàng Văn Trung Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… Nhận xét cán hướng dẫn ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………… Ngày tháng năm 2015 Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) 56 56 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Võ Thị Huyền Nguyễn Thị Khánh Huyền Msv: 1052043927 Msv: 1052043941 Khóa: 51 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hướng dẫn: ThS Hoàng Văn Trung Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ……………………… ……………………………………… Ngày tháng năm 2015 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) 57 57 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực phòng thí nghiệm – Trung tâm thực hành thí nghiệm – Trường Đại học Vinh Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo Th.s Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Chúng tơi xin chân thành cảm ơn Ths Chu Thị Thanh Lâm - Khoa Hóa, trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy cơ, cán khoa Hố, trường Đại học Vinh tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu môi trường học tập khoa học, giúp cho chúng tơi có kiến thức vững vàng trước bước vào đời Cuối chúng tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ chúng tơi hồn thành khóa luận Vinh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực Võ Thị Huyền Nguyễn Thị Khánh Huyền 58 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT HPLC NP – HPLC RP – HPLC LOD LOQ UV – VIS IU FMN FAD ELSD MeOH High Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký hấp phụ pha thường Sắc ký hấp phụ pha đảo Limit of detection: Giới hạn phát Limit of quality: Giới hạn định lượng hay giới hạn xác định Ultraviolet – spectrophotometer: Quang phổ tử ngoại khả kiến International Unit: Là đơn vị quốc tế dùng để định lượng vitamin, thuốc số chất sinh học khác Flavin mononucleotide Flavin adenine dinucleotide Evapovative Light Scatering Detecter: Detector tán xạ bay Metanol 59 ... Xác định hàm lượng vitamin D3 số sản phẩm thực phẩm vitamin B nấm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích vitamin D3, B2 bằng phương pháp sắc. .. ký lỏng hiệu cao HPLC, từ xác định hàm lượng chúng số đối tượng: trứng, sữa, nấm Mục tiêu nghiên cứu + Thiết lập phương pháp phân tích đảm bảo độ xác, độ hội tụ, độ nhạy cao + Áp dụng phương pháp. .. sống người 2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.4.1 Cơ sở lí thuyết HPLC viết tắc chữ đầu bằng tiếng anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (high performance liquid chromatography) Sắc