Caffein là một trong sáu chỉ tiêu mà tiêu chuẩn Việt Nam 525190 dùng dể đánh giá chất lượng sản phẩm cà phê . Chính vì vậy trong công trình này chúng tôi nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng caffein trong một số loại cà phê hiện đang được bán trên thị trường.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC -*** BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: Xác Định Caffein số loại cà phê bán thị trường phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Hà Nội, năm 2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên , em xin gửi lời cảm ơn đến cô Chu Ngọc Châu giao cho em đề tài Cám ơn cô thầy Chu Đình Bính tận tình hướng dẫn , hỗ trợ em suốt thời gian nghiên cứu Em xin cảm ơn thầy cô , bạn bè phòng thí nghiệm mơn Hóa phân tích giúp đỡ em trình làm nghiên cứu Một lần em xin cảm ơn tất người Kính chúc thầy bạn gia đình thật nhiều sức khỏe hạnh phúc Sinh Viên Lại Thị Thảo MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG BIỂU: DANH MỤC HÌNH VẼ: ĐẶT VẤN ĐỀ Caffein hoạt chất có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương; kích thích hơ hấp, tăng nhịp tim lợi tiểu Vì caffein sử dụng nhiều y dược chất trợ tim Nếu lạm dụng caffein dấn đến bị nghiện; sử dụng thường xuyên gây ngủ Khi dùng với liều cao dẫn đến bị kích động ,hồi hộp, buồn nơn, tiêu chảy; với liều cao 1000mg gây đột quỵ tử vong Liều gây chết người sử dụng 10g caffein Do tính chất hai mặt mà caffein thường Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa khuyến cáo sử dụng liệt kê vào loại dược chất phải bán theo đơn Cà phê loại trồng phổ biến nước ta ; đặc biệt tỉnh miền núi phía Bắc, tỉnh Tây Nguyên Trong năm gần Việt Nam trở thành nước xuất cà phê lớn thứ 2thế giới Cà phê mặt hàng xuất chủ lực , góp phần thúc đẩy phát triển kinh tế đất nước Caffein có nhiều cà phê loại thức uống phổ biến giới , có tác dụng tăng lưu thơng máu , kích thích thần kinh, tăng khả tiết rượu chất có hại khác chất béo, nicotin khỏi thể Caffein sáu tiêu mà tiêu chuẩn Việt Nam 5251-90 dùng dể đánh giá chất lượng sản phẩm cà phê Chính cơng trình chúng tơi nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao để phân tích hàm lượng caffein số loại cà phê bán thị trường CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 1.1.1 Giới thiệu Sắc kí q trình tách dựa phân bố liên tục cấu tử chất phân tích lên hai pha: pha thường đứng yên, có khả hấp thu chất phân tích gọi pha tĩnh,một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi pha động; cấu tử chất phân tích có lực khác với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) phương thức phép sắc kí.Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc kí lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Trong nhóm HPLC, tùy theo chất q trình sắc kí pha tĩnh cột tách mà người ta chia thành: o Sắc kí phân bố (PC) chất tan hai pha không tan (trộn) vào o Sắc kí hấp phụ pha thường (NP-HPLC) o Sắc kíhấp phụ pha ngược hay pha đảo (RP- HPLC) o Sắc kí trao đổi ion (IEX-HPLC) cặp ion (IP-HPLC) o Sắc kí rây phân tử (FG-HPLC) 1.1.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC Hệ thống trang bị kỹ thuật HPLC, (đơn giản đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC) bao gồm phận sau đây: a Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách, thực trình sắc kí, rửa giải chất tan khỏi cột sắc kí Bơm phải điều chỉnh áp suất (0 – 400 bar) để tạo tốc độ định pha động qua cột tách phù hợp cho q trình sắc kí, phải có tốc độ nằm vùng 0,5 – ml/phút b Van bơm mẫu: Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo lượng mẫu định khơng đổi q trình sắc kí Đó van chiều có chứa vòng mẫu tích xác định (20, 50 hay 100µl).Van chiều có vòng mẫu, van 10 chiều có vòng mẫu c Cột tách: Cột tách cột chứa pha tĩnh, trái tim q trình tách sắc kí Nó yếu tố định hiệu tách sắc kí hỗn hợp chất mẫu Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc kí Nói chung, cột tách phân tích thường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính thường từ – mm d Bộ phận phát chất phân tích: Đây thường loại detector dựa theo tính chất chất phân tích Một số detector thơng dụng như: • Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV-VIS • Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hấp thụ nguyên tứ (AAS) • Detector huỳnh quang phân tử • Detector điện hố (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng) • Detector chiết suất • Detector đo độ dẫn nhiệt • Detector diode phát quang diode mảng • Detector phổ khối lượng Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector cho phù hợp để đạt độ nhạy cao phát chất, định lượng chúng Trong loại trên, detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS dùng phổ biến thích hợp cho nhiều loại chất lại không đắt e Bộ phận hiển thị kết quả: Bộ phận hiển thị kết có nhiều loại, đơn giản phổ biến máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dạng pic chất, đến tích phân kế (intergrator), sau máy tính máy in kèm theo để xử lý kết in kết Đó phận cần thiết tối thiểu phải có hệ thống máy HPLC Những hệ thống máy HPLC hồn chỉnh, đại, ngày có thêm: − Bộ chương trình gradient dung mơi (pha động) − Bộ bơm mẫu tự động pha loãng mẫu − Bộ gia nhiệt ổn nhiệt độ cho cột tách sắc kí − Máy tính chương trình (phần mềm) điều khiển toàn hệ thống HPLC xử lý kết tách, in kết tách injector Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống HPLC 1.1.3 Nguyên tắc trình sắc kí cột Trong q trình sắc kí phân tử chất tan phân bố qua lại hai pha pha động chảy qua cột tách với tốc độ định Mặt khác, cấu trúc tính chất phân tử chất tan khác nên tốc độ dịch chuyển trung bình chất tan khác trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc kí Khi pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ pha động; pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại Như có thời gian định chất tan bị lưu giữ lại cột sắc kí Vì vậy, q trình sắc kí, có chất bị lưu giữ lâu cột, có chất tan bị lưu giữ Quyết định hiệu tách sắc kí tổng mối tương tác: Giữa chất phân tích pha tĩnh (F1) Giữa chất phân tích pha động (F2) Giữa pha tĩnh pha động (F3) Hình 1.2 Sơ đồ thể ảnh hưởng lực rửa giải Tổng tương tác định chất rửa giải khỏi cột trước Đối với chất,sự lưu giữ qui định ba lực F1, F2, F3 Trong F1 F2 giữ vai trò định, F3 yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở F1 lực giữ chất phân tích cột, F2 lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột Như với chất khác F1 F2 khác Kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột (như hình đây) Hình 1.3 Q trình tách sắc kí chất 1.1.4 Các đại lượng đặc trưng 1.1.4.1 Thời gian lưu Các chất tan hỗn hợp mẫu phân tích, nạp vào cột sắc kí bị lưu giữ cột tách (trên pha tĩnh) theo thời gian định Thời gian lưu thời gian tính từ lúc bắt đầubơm mẫu vào cột pic đạt giá trị cực đại Như gọi tRi thời gian lưu tổng cộng chất tan i ln có: Trong đó: + thời gian khơng lưu giữ ( thời gian chất tan nằm pha động ) + thời gian lưu giữ thực chất i cột sắc kí (thời gian lưu hiệu chỉnh) Nếu to = ta có = Trường hợp có nhỏ (thường nhỏ phút) Hình 1.4 Thời gian lưu HPLC Giá trị chất tan trình sắc kí phụ thuộc vào nhiều yếu tố Ví dụ như: • Bản chất sắc kí pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp • Bản chất, thành phần, tốc độ pha động • Cấu tạo chất phân tử chất tan, nhóm 10 1.3 Các phương pháp phân tích caffein Hàm lượng caffein có huyết người thức uống có cola Wenrui Jin cộng xác định phương pháp điện di mao quảnvào năm 2000 -4 Giới hạn phát caffein thu 2,9.10 mM độ lệch chuẩn thời gian điện di diện tích pic thu caffein 0,68% 2,3% [7] Năm 2000, Guzin Alpdogan, Kadir Karabina, Sidika Sungurg dùng phương pháp phổ đạo hàm để xác định caffein loại nước uống cola, cà phê trà, lấy phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao sử dụng làm phương pháp đối chiếu với chương trình sắc kí sử dụng cột C18, hỗn hợp methanol: nước theo tỉ lệ thể tích 30:70 thu pic sắc kí thời gian lưu 5,14 phút Kết thu giới hạn phát caffein với phương pháp μg/g; 1,5 μg/ml μg/g trà, cola cà phê [8] 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Hóa chất, dụng cụ 2.1.1 Hóa chất Chất chuẩn bao gồm: caffein dạng bột Sigma-Aldrich Dung môi: kênh B: Metanol độ tinh khiết > 99,9% Merck, kênh C: acetonitrile độ tinh khiết > 99,9% Merck, kênh D:đệm pH=3 Hóa chất khác: Metanol độ tinh khiết > 99,9% 2.1.2 Dụng cụ , thiết bị Dụng cụ bao gồm: Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml, micro pipet 10-100µm, micro pipet 100- 1000µm đầu cơn, lọ đựng mẫu 2ml dùng cho máy chạy sắc ký, bình định mức: 5, 10, 50, 100ml, ống đong, phễu, giấy lọc Thiết bị sử dụng nghiên cứu gồm: cân phân tích xác đến 0,0001g, máy rung siêu âm, máy điều nhiệt, hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm (Bộ loại khí dung môi, Degasser- DGU-14AM, van trộn dung môi FCV- 10ALVP, bơm dung môi bốn kênh LC- 10ADVP, ổn nhiệt cột tách CTO10 ASVP, van bơm mẫu với thể tích vòng mẫu 20µl, detector UV-Vis SPD-M10A VP, hệ điều khiển SCL-10AVP, phầm mềm điều khiển xử lý số liệu LCMS solution Ver 3, cột sắc ký: LiChrospher 100 RP-18 (5µm)) 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu 2.2.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu Độ xác, độ lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách phụ thuộc vào thiết kế van bơm mẫu mà phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào cột Dựa vào khả thay đổi vòng mẫu khác mà thay đổi thể tích bơm mẫu vào cột.Tuy nhiên yếu tố góp phần làm chân pic sắc kí bị dỗng Nếu vòng mẫu q dài, lượng mẫu bơm vào cột q lớn tượng dỗng pic xảy lớn gây chen lấn pic trình tách Lượng mẫu xác định thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn Với thể tích mẫu nhỏ thể tích mẫu tới hạn V0 bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay 20 diện tích pic tăng tuyến tính Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà tiếp tục tăng thể tích mẫu chiều cao pic sắc kí khơng tăng lúc pic sắc kí tù, dỗng chân khơng sắc nét Vì việc lựa chọn thể tích vòng mẫu quan trọng Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu tích nhỏ tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao, tránh dỗng pic Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng vòng mẫu 10, 20, 30, 50 100 µl vòng mẫu 20 µl thường hay sử dụng Trong đề tài nghiên cứu để phân caffein lựa chọn van bơm mẫu chiều thể tích vòng mẫu 20 µl 2.2.1.2 Chọn cột Trong đề tài nghiên cứu này, caffein chất phân cực dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định tiêu phân tích định lượng thành phần dược phẩm, nên ta phải chọn loại cột RP – HPLC Trên thị trường có nhiều hãng sản xuất cột sắc kí pha đảo C8 C18 Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 hãng Perkin Elmer sử dụng rộng rãi ngành kiểm nghiệm dược phẩm trang bị cho hệ thống HPLC phòng thí nghiệm trường, cho thấy khả tách tốt, thời gian lưu ngắn nhà sản xuất hỗ trợ kỹ thuật nên chúng tơi chọn cột Brownlee RP – 18,5µm, 220 x 4,6mm cho phép định lượng 2.2.1.3 Khảo sát thành phần pha động Tỷ lệ thành phần dung môi tạo pha động có ảnh hưởng lớn đến q trình rửa giải chất mẫu khỏi cột Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải đặc trưng cho q trình sắc kí Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi lực rửa giải dung môi pha động thay đổi, nghĩa làm thay đổi thời gian lưu chất phân tích qua làm thay đổi hệ số lưu chất phân tích Vì để có tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác với điều kiện sắc kí nhau: - Cột tách : RP – 18,5µm, 220x4,6 mm - Thể tích vòng mẫu: 20 μl - Tốc độ dòng: 1.2 ml/phút - Detector: 270nm 21 2.2.1.4 Khảo sát tốc độ pha động Để khảo sát ảnh hưởng tốc độ pha động, tiến hành khảo sát thay đổi chiều cao pic sắc kí theo bước sóng detector với điều kiện chạy sắc kí: -Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm -Thể tích vòng mẫu: 20µl -Tốc độ dòng: 1.2 ml/phút -Detector: UV-VIS -Pha động: pha động khảo sát 2.2.1.3 Tổng kết điều kiện khảo sát suy điều kiện tối ưu để phân tích caffein 2.2.2 Xác định Caffein 2.2.2.1 Xác định khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính thơng số quan trọng quy trình phân tích Một chất định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn nồng độ chất phân tích nằm khoảng tuyến tính Để khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ caffein diện tích pic sắc kí, ta pha dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần dung mơi pha động Sau tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu khảo sát mục 2.2.1, ghi giá trị diện tích pic dùng phần mềm Microsoft Excel xây dựng phương trình hồi quy mối quan hệ nồng độ C diện tích pic Spic 2.2.2.2 Phân tích số loại cà phê thị trường Chúng tơi tiến hành phân tích số loại cà phê thông dụng bán thị trường số loại cà phê bán dạo , thơng qua đánh giá chất lượng cà phê đặc biệt cà phê bán dạo 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu 3.1.1 Khảo sát thành phần pha động Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí mục 2.2.1.2 trình bày với thay đổi thành phần pha động Dung dịch chất chuẩn caffein pha lỗng từ dung dịch gốc 206ppm Thành phần dung mơi pha động chọn để khảo sát acetonitril đệm pH=3 với tỉ lệ thể tích khác Kết phụ thuộc thời gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào thành phần pha động bảng 3.1 hình 3.1 270nm4nm (1.00) 270nm,4nm (1.00) 1.50 3.0 1.25 2.5 1.00 2.0 1.5 0.75 1.0 0.50 0.5 0.25 0.00 2.5 7.5 10.0 12.5 0.0 4.593 mAU(x100) 5.0 270nm4nm (1.00) mAU(x100) 270nm4nm (1.00) 3.0 3.0 2.5 10.0 15.0 2.5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 mAU(x100) 270nm4nm (1.00) 3.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 3.232 0.0 5.0 3.943 0.0 0.0 5.718 mAU(x100) 2.831 mAU(x100) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình 3.1 Sắc kí đồ caffein khảo sát pha động a)10%ACN b 15%ACN c)20%ACN 23 d)25%ACN e)30% CAN Bảng 3.1 Sự phụ thuộc thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ ACN pha động Caffein % Acetonnitrin Thời gian lưu (tR – phút) Diện tích pic (S) 10 2.831 3148336 15 5.718 2878244 20 4.593 4129364 25 3.943 3414134 30 3.232 3144746 Nhìn vảo bảng 3.1 pic sắc kí hình 3.1 nhận thấy với tỷ lệ ACN 15% chất tách rõ ràng, pic sắc nét thời gian rửa giải không nhanh không chậm Tiến hành chạy sắc kí kiểm tra mẫu 09 theo chương trình sau : Cột tách: RP – 18, 5µm, 220 x 4,6 mm Thể tích vòng mẫu: 20 μl Tốc độ dòng: ml/phút Detector: 270 nm Do lựa chọn tỉ lệ pha động 15 % CAN/85% đệm để tiến hành phân tích caffein 3.1.2 Khảo sát tốc độ pha động Sự ảnh hưởng tốc độ pha động đến thời gian lưu chiều cao pic sắc kí khảo sát cách tiến hành chạy sắc kí mẫu 09 với tốc độ khác nhau: • 0,8 ml/phút • 1ml/phút • 1,2ml /phút • 1,4 ml/phút Các điều kiện lại q trình sắc kí khơng đổi, cụ thể sau: Ct tỏch: RP 18,5àm, 220 x 4,6 mm Th tớch vũng mu: 20àl Detector UV-VIS: 270 nm • Pha động: pha động khảo sát 24 Kết khảo sát tốc độ pha động bảng 3.2 hình 3.2 Bảng 3.2 Mối quan hệ tốc độ pha động diện tích pic Tốc độ pha Thời gian lưu Diện tích pic động u(ml/phút) ( tR) (Sp) 0.8 8.532 4368170 1.0 7.874 2819241 1.2 5.718 2650101 1.4 4.797 2469137 Hình 3.2 Sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ pha động Caffein Theo đường cong Van Deemter, giá trị tốc độ tối ưu để hiệu tách lớn 1,2 ml/phút Như từ khảo sát ta rút điều kiện chạy tối ưu để phân tích caffein sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 15% ACN -85% H2O - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm - Thể tích vòng mẫu : 20µl 3.2 Phân tích mẫu caffein 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính Để khảo sát khoảng tuyến tính caffein, ta tiến hành khảo sát dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần: 2.06 ppm; 5.17ppm;8.27ppm; 10.33 ppm; 15.50ppm; 20.60 ppm; 41.63ppm Dãy dung dịch pha loãng từ dung dịch caffein gốc có nồng độ 206.0 ppm Sau đó, tiến hành chạy sắc kí với dung dịch dãy chuẩn theo chương trình sắc kí sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 15%ACN/85%đệm 25 - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm - Thể tích vòng mẫu : 20µl Từ giá trị diện tích pic S p thu được, xây dựng phương trình hồi quy diện tích pic Sp nồng độ C dãy chuẩn Sau đó, tiến hành chạy sắc kí với dung dịch dãy chuẩn theo chương trình sắc kí sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 15%ACN/85% đệm - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm - Thể tích vòng mẫu : 20µl Từ giá trị diện tích pic S p thu được, xây dựng phương trình hồi quy diện tích pic Sp nồng độ C dãy chuẩn Kết khảo sát khoảng tuyến tính bàng 3.3, hình 3.3 26 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc diện tích pic sắc kí vào nồng độ caffein Nồng độ C 2,06 Diện tích pic TB (Sp) 140209 5,17 371769 8,27 491119 10,33 653207 15,50 913196 20,60 1192646 41,63 2355744 Hình 3.3 Đường chuẩn caffein Mối quan hệ diện tích pic (y) với nồng độ caffein (x) thể qua phương trình: y =55300 x +56330 (3.2) Hệ số tương quan r = 0,9992 3.2.2 Phân tích số mẫu cà phê thị trường Các mẫu cà phê hòa tan bán thị trường pha theo hướng dẫn nhà sản xuất, tiến hành lọc thơ sau lọc 0,45um pha loãng tùy theo nồng độ caffein loại cà phê ( số lần pha loãng dựa vào hàm lượng cafein ghi bao bì) Mẫu cà phê dạo nước tăng lực lọc pha loãng 10 lần Kết thu sau: Bảng 3.4 Kết phân tích mẫu thực Mẫu 01 02 03 Lần Lần Lần Lần Lần Pha Lỗng (lần) Thời gian lưu (tR) Diện Tích Pic (Sp) Hàm lượng caffein tách cà phê (50ml) (ppm) 100 100 100 100 100 5.768 5.701 5.752 5.740 5.804 1162967 980661 853881 924630 436895 2001.5 1671.5 1442.2 1570.2 1047.7 27 04 05 06 07 08 09 10 11 12 Lần Lần 100 10 5.786 5.786 415068 1455718 987.6 2141.6 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 10 10 10 10 10 10 10 5.776 5.678 5.670 5.666 5.677 5.815 5.678 1140226 590018 836549 847457 920025 935617 953682 1508.3 684.0 1000.2 885.0 966.0 1048.9 1070.7 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Ghi : 10 10 10 10 10 10 100 100 100 100 5.700 5.696 5.713 5.709 5.798 5.718 5.618 5.597 5.582 5.570 1393794 1372901 1561379 1434447 2650101 2878244 1916672 1558308 327701 280000 241.8 238.1 272.2 249.2 469.0 510.3 3364.1 2716.1 764.6 630.3 -Mẫu 01: cà phê hòa tan đen G7 -Mẫu 02: cà phê hòa tan đen Nescafe Red Cup -Mẫu 03: cà phê hòa tan 3in1 wake-up hương chồn -Mẫu 04: cà phê hòa tan sữa đá maccoffy-cà phê phố -Mẫu 05: cà phê hòa tan nescafe-cà phê Việt -Mẫu 06: cà phê hòa tan G7 3in1- cà phê thứ thiệt -Mẫu 07: cà phê hòa tan ness cà phê 3in1 -Mẫu 08: cà phê bán dạo đường Tây Sơn -Mẫu 09: nước tăng lực redbull -Mẫu 10: cà phê dạo Lê Thánh Tông -Mẫu 11: cà phê rang xay- cà phê Trung Nguyên sáng tạo -Mẫu 12: cà phê rang xay nguyên chất 28 5.597 mAU(x10) 270nm4nm (1.00) 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 Hình 3.4 Sắc đồ phân tích mẫu cà phê ( Mẫu 11) 29 CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐÁNH GIÁ 3.3 Kết luận Kết đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng caffein số loai cà phê thị trường phương pháp HPLC” cho kết luận sau: Chọn điều kiện phù hợp để tách xác định caffein số dược phẩm hệ thống sắc kí HPLC sử dụng detector UV-VIS o Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm o Pha động : 15%ACN/85% nước o Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút o Detectơ UV-VIS: = 270 nm o Thể tích vòng mẫu : 20µl Xác định khoảng tuyến tính cho caffein Caffein Phương trình hồi quy y = 55300 x + 56330 Hệ số tương quan r = 0,9992 Khoảng tuyến tính 2.06 – 41.63 ppm 3.4 Đánh giá chất lượng cà phê Hàm lượng caffein số loại cà phê thị trường có khác biệt đáng kể : Nhóm cà phê hòa tan sữa có hàm lượng caffein thấp , khoảng 800ppm-1000ppm cho tách cà phê 50ml ( Mẫu 03,05,06,07) Ngoại trừ cà phê Maccoffee có hàm lượng caffein cao hẳn ( khoảng 1800ppm ) Điều giải thích uống cà phê sữa để đầu óc tỉnh táo , chống lại buồn ngủ lại thấy tác dụng ngược lại ( Trong cà phê sữa hàm lượng đường cao ) Nhóm cà phê hòa tan đen có hàm lượng caffein trung bình, khoảng 1500ppm -2000ppm (Mẫu 01,02) Nhóm cà phê rang xay có hàm lượng caffein cao , khoảng 3000ppm ( Mẫu 11) , nhiên cà phê rang xay nguyên chất người dân tự chế biến nồng độ caffein lại thấp khoảng 700ppm , thấy trình bảo quản chế biến cà phê từ hạt cà phê ảnh 30 hưởng lớn đến chất lượng cà phê (Mẫu 11) Nhóm cà phê bán dạo có hàm lượng caffein cực thấp , khoảng 250-500ppm (Mẫu 08, 10) , hàm lượng caffein loại cà phê tương đương caffein nước tăng lực Redbull (Mẫu 09) Tuy cà phê bán dạo lại có hương vị đậm đà cà phê, nói cà phê bán dạo pha thêm hương liệu để tạo mùi vị , chất lượng cà phê không đảm bảo 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết sắc kí lỏng iệu cao HPLC, trường Đại học Tổng hợp Hà Nội [2] Hồ Viết Q, Phân tích lí – hóa, NXB Giáo dục [3] Bộ Y tế, Dược thư quốc gia, NXB Y học, 2009 [4] Bộ Y tế, Dược điển quốc gia, NXB Y học, 2010 [5] Sinan Suzen, Cemal Akay, Senol Tartilmis, R Serdar Erdol, Atilla Onal and Semsettin Cevheroglu (1998), Quantitative of acetaminophen in pharmaceutical formulations using high-performance liquid chromatography, J Fac Pharm Ankara, pp 93-100 [6] Shulin Zhao, Wenling Bai, Hongyan Yuan and Dan Xiao (2006), Detection of paracetamol by capillary electrophoresiswith chemiluminescence detection, Analytica Chimica Acta,pp 195-199 [7] Wenrui Jin, Daiqing Yu, Qian Dong, and Xiaoying Ye (2000), Quantitation of Caffeine by Capillary ZoneElectrophoresis with End-Column AmperometricDetection at a Carbon Microdisk Array Electrode, Journal of Chromatographic Science, Vol 38, pp 11-15 [8] Guzin Alpdogan, Kadir Karabina and Sidika Sungurg (2000), DerivativeSpectrophotometric Determination ofCaffeine in Some Beverages, Turk J Chem, 2002, pp 295-302 [9] H Tavallali and M Sheikhaei (2009), Simultaneous kinetic determination of paracetamol and caffeine by H-point standard addition method, African Journal of Pure and Applied Chemistry Vol 3, pp 11-19 [10] Vijaya Vichare, Preeti Mujgond, Vrushali Tambe and Dhole S.N (2010),Simultaneous Spectrophotometric determination of Paracetamol and Caffeine in tablet formulation, International Journal of PharmTech Research, Vol.2, No.4, pp 2512-2516 [11] M Prodan, E Gere-Paszti, O Farkas, E Forgacs, Validation and Simultaneous Determination of Paracetamol and Caffeine in Pharmaceutical Formulations by RP-HPLC, Chem Anal (Warsaw), 2003 32 [12] M Levent Altun (2001), HPLC Method for Paracetamol,Caeine and Dipyrone, Turk J Chem, pp 521 – 528 the Analysis of [13] Viswanath Reddy Pyreddy, Useni Reddy Mallu, Varaprasad Bobbarala and Somasekhar Penumajji (2011), A novel RP-HPLC method for analysis of paracetamol, pseudoephedrine, caffeine and chlorpheniramine maleate in pharmaceutical dosage forms,Journal of Pharmacy Research 2011, Vol 4, Issue 4, pp 1225-1227 [14] SM Ashraful Islam , Shamima Shultana, Muhammad Shahdaat Bin Sayeed and Irin Dewan (2012),UV- spectrophotometric and RP-HPLC methods for the simultanios estimation of acetaminophen an caffeine: valiation, comparison and application for marketed tablet analysic, International journal of pharmacy, 2012 [15] Thái Duy Thìn (2005), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) đo quang phổ UV-VIS để định tính định lượng hoạt chất có số thuốc có từ đến thành phần, Bộ Y Tế 33