Xác Định Caffein trong một số loại cà phê bán trên thị trường bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

Caffein là một trong sáu chỉ tiêu mà tiêu chuẩn Việt Nam 525190 dùng dể đánh giá chất lượng sản phẩm cà phê . Chính vì vậy trong công trình này chúng tôi nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng caffein trong một số loại cà phê hiện đang được bán trên thị trường.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA HÓA HỌC -*** -

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

Xác Định Caffein trong một số loại cà phê bán trên thị trường bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

HPLC

Hà Nội, năm 2017LỜI CẢM ƠN

Trước tiên , em xin gửi lời cảm ơn đến cô Chu Ngọc Châu đã giao cho em đề tàinày Cám ơn cô và thầy Chu Đình Bính đã tận tình hướng dẫn , hỗ trợ em trong suốtthời gian nghiên cứu

Em cũng xin cảm ơn các thầy cô , bạn bè ở phòng thí nghiệm bộ môn Hóa phântích đã giúp đỡ em trong quá trình làm nghiên cứu

Một lần nữa em xin cảm ơn tất cả mọi người Kính chúc các thầy cô và các bạn

và gia đình thật nhiều sức khỏe và hạnh phúc

Sinh Viên Lại Thị Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1

1.1.1 Giới thiệu 1

1.1.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 1

1.1.3 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột 3

1.1.4 Các đại lượng đặc trưng 5

1.1.5 Định lượng bằng HPLC 11

1.2 Caffein [3, 4] 12

1.3 Các phương pháp phân tích caffein 13

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 15

2.1 Hóa chất, dụng cụ 15

2.1.1 Hóa chất 15

2.1.2 Dụng cụ , thiết bị 15

2.2 Thực nghiệm 15

2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu 15

2.2.2 Xác định Caffein 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 18

3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu 18

3.1.1 Khảo sát thành phần pha động 18

3.1.2 Khảo sát tốc độ pha động 19

3.2 Phân tích mẫu caffein 21

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 21

3.2.2 Phân tích một số mẫu cà phê thị trường 23

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – ĐÁNH GIÁ 25

3.3 Kết luận 25

3.4 Đánh giá chất lượng cà phê 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

DANH MỤC BẢNG BIỂU:

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của ACN

trong pha động 19

Bảng 3.2 Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và diện tích pic 20

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc kí vào nồng độ của caffein 22

Bảng 3.4 Kết quả phân tích mẫu thực 23

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống HPLC 3

Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải 4

Hình 1.3 Quá trình tách sắc kí của các chất 4

Hình 1.4 Thời gian lưu trong HPLC 5

Hình 1.5 Giản đồ về sự tách hai pic sắc A và B 9

Hình 1.6 Phương trình đường cong Van Deemter 10

YHình 3.1 Sắc kí đồ của caffein khi khảo sát pha động 18

Hình 3.2 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động Caffein 20

Hình 3.3 Đường chuẩn của caffein 22

Hình 3.4 Sắc đồ phân tích mẫu cà phê ( Mẫu 11) 24 Y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Caffein là một hoạt chất có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kích thích hệ thầnkinh trung ương; kích thích hô hấp, tăng nhịp tim và lợi tiểu Vì vậy caffein được sử dụngnhiều trong y dược như một chất trợ tim Nếu lạm dụng caffein sẽ dấn đến bị nghiện; sửdụng thường xuyên sẽ gây mất ngủ Khi dùng với liều cao có thể dẫn đến bị kíchđộng ,hồi hộp, buồn nôn, tiêu chảy; với liều cao trên 1000mg có thể gây đột quỵ và tửvong Liều gây chết người là khi sử dụng 10g caffein Do tính chất hai mặt này màcaffein thường được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra những khuyến cáo khi sử dụng

và liệt kê vào những loại dược chất phải bán theo đơn

Cà phê là loại cây được trồng khá phổ biến ở nước ta ; đặc biệt là các tỉnh miền núiphía Bắc, các tỉnh Tây Nguyên Trong những năm gần đây Việt Nam trở thành nước xuấtkhẩu cà phê lớn thứ 2thế giới Cà phê là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực ,góp phần thúc đẩy sự phát triển kinh tế của đất nước Caffein có nhiều trong cà phê làloại thức uống phổ biến nhất trên thế giới , có tác dụng tăng lưu thông máu , kích thíchthần kinh, tăng khả năng bài tiết rượu và các chất có hại khác như chất béo, nicotin rakhỏi cơ thể

Caffein là một trong sáu chỉ tiêu mà tiêu chuẩn Việt Nam 5251-90 dùng dể đánhgiá chất lượng sản phẩm cà phê Chính vì vậy trong công trình này chúng tôi nghiên cứu

sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng caffein trong một

số loại cà phê hiện đang được bán trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.1.1 Giới thiệu

Sắc kí là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử chất phân tíchlên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là phatĩnh,một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có áilực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc kí.Kỹ thuậtphân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc kí lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc kílỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong cộttách mà người ta chia thành:

o Sắc kí phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau

o Sắc kí hấp phụ pha thường (NP-HPLC)

o Sắc kíhấp phụ pha ngược hay pha đảo (RP- HPLC)

o Sắc kí trao đổi ion (IEX-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)

o Sắc kí rây phân tử (FG-HPLC)

1.1.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

Hệ thống trang bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản (đơn giản và đủ để làm việcđược theo kỹ thuật HPLC) bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:

a Bơm cao áp:

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan rakhỏi cột sắc kí Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) để tạo ra được nhữngtốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độnằm trong vùng 0,5 – 3 ml/phút

b Van bơm mẫu:

Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổitrong một quá trình sắc kí Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác định

(20, 50 hay 100l).Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu, nhưng van 10 chiều thì có 3 vòngmẫu.

c Cột tách:

Cột tách là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc kí Nó là một trongnhững yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc kí của một hỗn hợp chất mẫu Cột tách cónhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc kí Nói chung, các cột tách phân tíchthường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính trong thường từ 2 – 5 mm

d Bộ phận phát hiện chất phân tích:

Đây thường là các loại detector dựa theo các tính chất của chất phân tích Một sốdetector thông dụng như:

 Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV-VIS

 Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hấp thụ nguyên tứ (AAS)

 Detector huỳnh quang phân tử

 Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng)

 Detector chiết suất

 Detector đo độ dẫn nhiệt

 Detector diode phát quang và diode mảng

 Detector phổ khối lượng

Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp đểđạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng Trong cácloại trên, thì detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay đangđược dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại không quá đắt

e Bộ phận hiển thị kết quả:

Bộ phận hiển thị kết quả có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là cácmáy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tíchphân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả

Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC.Những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm:

 Bộ chương trình gradient dung môi (pha động)

 Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu

 Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc kí

 Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC và

xử lý kết quả tách, in kết quả tách

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống HPLC

1.1.3 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột

Trong quá trình sắc kí các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trongkhi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định Mặt khác, do cấu trúc vàtính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình củamỗi chất tan là khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc kí Khi ởtrong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong phatĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữlại trong cột sắc kí Vì vậy, trong quá trình sắc kí, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chấttan ít bị lưu giữ

Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các mối tương tác:

Hình 1.2 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước.Đối với mỗi chất,sự lưu giữ được qui định bởi ba lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữvai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phântích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy vớicác chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyểntrong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây)

Hình 1.3 Quá trình tách sắc kí của các chất

injector

1.1.4 Các đại lượng đặc trưng

1.1.4.1 Thời gian lưu

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc kí sẽ bị lưu giữ

ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Thời gian lưu là thời giantính từ lúc bắt đầubơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại Như vậy nếu gọi

tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:

t R i=(t0+t ' R i)

Trong đó:

 t0là thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động )

 t ' R ilà thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc kí (thời gian lưu hiệu chỉnh)Nếu to = 0 thì ta sẽ có t R i= t ' R i Trường hợp này chỉ có khi t R i là rất nhỏ (thường làkhi t R i nhỏ hơn 4 phút)

Hình 1.4 Thời gian lưu trong HPLC

Giá trị t ' R i của một chất tan trong quá trình sắc kí là phụ thuộc vào nhiều yếu tố

Ví dụ như:

 Bản chất sắc kí của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp

 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

 Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

 Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độchất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng độngtrong quá trình sắc kí

Giá trị thời gian lưu tRi có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc kí Vì nócho ta biết các chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nàotrong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn Đồng thời đó cũng là đại lượng đểchúng ta phát hiện định tính một chất

k’i là hệ số dung lượng của chất tan i;

l là chiều dài của cột sắc kí

1.1.4.2 Hệ số phân bố

Quá trình tách sắc kí của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan giữapha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc kí Sự phân bố này được đặc trưngbởi mộtđại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i Hệ số này được định nghĩa là tỷ sốnồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và nó được tính theo công thức:

SP MP

i i

C K

C



(1.4)Trong đó C i SPvà C i MPlà nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động, hệ số Ki cho tabiết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh)

Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1

1.1.4.5 Số đĩa lý thuyết N

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc kí, người ta dùng khái niệm

số đĩa N Đây là một đại lượng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc kí như làmột lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H Tất nhiên đây là lớp có tính chất động, và bềdày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:

- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh

- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích)

- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc kí

- Độ nhớt của pha động

Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc kí đã chọn, thì chiều cao

H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan Chiều cao lí thuyết H và số đĩa líthuyết N được xác định theo công thức:

Trong đó Wi là chiều rộng đáy pic sắc kí và tRi là thời gian lưu của chất i

Trong thực tế của quá trình sắc kí, thì số đĩa hiệu dụng Nef và chiều cao hiệu dụngHef của một cột sắc kí mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng được khả năng của một cộttách và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể

2

0

w 16

t

t ef

R

L H

16.

w

t

R ef

không hoàn toàn.Nhưng nếu Nef là quá lớn thì cũng không cần thiết Vì khi đó pic sắc kícủa các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động.

1.1.4.6 Độ phân giải R

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc kí Haicấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao Độ phân giảiđược tính theo công thức sau:

là tốt Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được

1.1.4.7 Phương trình Van Deemter

Phương trình Van Deemter thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao H của một đĩa vàtốc độ tuyến tính của pha động u Phương trình Van Deemter được viết như sau:

 B: hệ số khuếch tán dài

 CS và CM: hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động

Nếu biểu thị các đường biểu diễn tổng cộng trong quan hệ của H với u thì chúng ta

có được đường cong Van Deemter

Hình 1.6 Phương trình đường cong Van Deemter

Hệ số A phụ thuộc vào đường kính hạt nhồi dp trong pha tĩnh; cách chúng đượcnhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ (hệ số nạp cột) phụthuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột:

DM: hệ số khuyếch tán của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của cột

: hằng số đặc trưng cho sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian và trongđiều kiện nạp tốt thì  hầu như bằng 1

Hệ số C tỉ lệ thuận với tốc độ pha động và ảnh hưởng đáng kể đếnđường cong H-u Hệ số CM và CS được tính theo công thức sau:

CM = .(dp)2 / DM (1.16)

CS = k 2 / DS (1.17)

Trong đó:

 : một hệ số thực nghiệm, nó được quyết định bởi hệ số dung tích ki’ của chất tan

 k: một hằng số phụ thuộc vào điều kiện nạp cột, và thường nhỏ hơn 2

 :tỷ khối của pha tĩnh

 Ds: hệ số khuyếch tán của chất tan trong pha tĩnh

Đường cong Van Deemter được dùng để xác định tốc độ pha động tối ưu uopt màtại tốc độ đó chiều cao đĩa H là nhỏ nhất nên hiệu quả tách là tốt nhất

1.1.5 Định lượng bằng HPLC

1.1.5.1 Phương trình cơ bản để định lượng

Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phươngtrình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc kí (diện tích, hay chiều cao) của chấtvới nồng độ C của chúng được bơm vào cột tách

Trong đó:

+ H : Chiều cao pic sắc kí của chất

+ S : Diện tích pic sắc kí của chất

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng mộttrong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm

chuẩn.Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượngchất phân tích.

1.1.5.2 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Dựa trên (1.17) và (1.18) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theophương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học vớicác đặc trưng sau:

1 n i i

x

 

(1.21)

1.2 Caffein [3, 4]

Tên chung quốc tế: Caffein.

Công thức phân tử: C8H10N4O2.

Nhóm dược lí: thuốc hướng tâm thần

Dược lực:

Caffein là thuốc thuộc dẫn xuất xanthin được chiết

từ cà phê, ca cao hoặc được tổng hợp từ axit uric Caffein

có tác dụng rõ trên thần kinh trung ương

Dược động học:

Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và đường

tiêm Thuốc đạt nồng độ tối đa tr huyết tương sau khi uống khoảng một giờ

Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể, qua nhau thai và sữa mẹ, thể tích phân bố 0,4– 0,6 l/kg