Tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu trong thực phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hiện nay, với sự phát triển của khoa học và công nghệ đưa vào các khâu sản xuất giúp tăng năng suất cây trồng và vật nuôi cải thiện đời sống con người.Trước đây, trong quá trình sản xuất

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO ( HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO ( HPLC)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG NCS VŨ THỊ TRANG

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, PGS TS Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện, giúp tôi hoàn thành

đề tài

Tôi xin gử i lời cảm ơn tới các anh chi ̣ trong Khoa chất lượng phụ gia và chất

hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viê ̣n Kiểm nghiê ̣m an toàn vê ̣ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình , bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ khó khăn, đô ̣ng viên và giúp đỡ tôi trong ho ̣c tâ ̣p cũng như trong cuộc sống

Do thời gian thực hiê ̣n đề tài có hạn nên không tránh những thiếu s ót, rất mong nhâ ̣n được ý kiến đóng góp của thầy cô và các ba ̣n để luận văn này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, Ngày 30 tháng 11 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Hải Yến

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

CAC Codex Alimentarius Committee Ủy ban mã thực phẩm

GMP Good Manufacturing Practices Thực hành sản xuất tốt

HPLC High high performance

liquidchromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High performance thin layer

JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on

Food Additives

Uỷ ban chuyên gia phối hợp FAO/WHO về phụ gia thực phẩm LC-

MS/MS

Liquid chromatography tandem mass

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

NP-HPLC Normal phase- High high performance

liquidchromatography Sắc ký pha thường

RP-HPLC Revesed phase- High high performance

S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Tartrazine 10

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Amaranth 10

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Indigocarmin 11

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ponceau 4R 12

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Sunset Yellow 12

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Allura red 13

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Fast green 14

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Camoisine 15

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Erythrosine 15

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của Brillant Blue 16

Hình 2.1 Quy trình phân tích một số phẩm màu 27

Hình 3.1: Hình dạng phổ hấp thụ của các phẩm màu khi sử dụng detector PDA 30

Hình 3.2 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích trên cột X-Brigde C18 31

Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích trên cột IntertSustain C18 32

Hình 3.4 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích trên cột Symmetry C18 33

Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.05 M – ACN 37

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.05 M – MeOH 39

Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC đối với các chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.01 M – MeOH 41

Hình 3.8 Ảnh hưởng của dung môi loại béo đến độ thu hồi của các phẩm màu 44

Hình 3.9 Ảnh hưởng của dung môi chiết mẫu đến độ thu hồi của các phẩm màu 45

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH trong quá trình chiết mẫu 46

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chiết mẫu 47

Hình 3.12 Quy trình chiết mẫu xác định một số phẩm màu trong thực phẩm 48

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phân nhóm, chức năng công nghệ và qui định của các chất phụ gia TP 2

Bảng 1.2 Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS 4

Bảng 1.3 Chỉ tiêu hàm lượng các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm 18

Bảng 3.1 Các gradient thử nghiệm với pha động là NaH2PO4 0.05 M – ACN 36

Bảng 3.2 Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green, camoisine, erythrosine ứng với từng chế độ gradient 36

Bảng 3.3 Các gradient thử nghiệm với pha động là NaH2PO4 0.05 M – MeOH 38

Bảng 3.4 Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green, camoisine, erythrosine ứng với từng chế độ gradient 38

Bảng 3.5 Các gradient thử nghiệm với pha động là NaH2PO4 0.01 M – MeOH 40

Bảng 3.6: Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green, camoisine, erythrosine ứng với từng chế độ gradient 40

Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của tartrazine 49

Bảng 3.8 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của amaranth 50

Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn của 10 phẩm màu 53

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất phân tích 54

Bảng 3.11 Độ lặp lại của các phẩm màu trên nền mẫu bánh 55

Bảng 3.12 Độ lặp lại của các phẩm màu trên nền mẫu thạch 56

Bảng 3.13 Độ thu hồi của phương pháp với 10 phẩm màu trên nền mẫu bánh 58

Bảng 3.14 Độ thu hồi của phương pháp với 10 phẩm màu trên nền mẫu thạch 60

Bảng 3.15 Kết quả phân tích một số mẫu bánh, kẹo, thạch 62

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về phụ gia thực phẩm 2

1.1.1 Phụ gia thực phẩm là gì ? 2

1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 2

1.1.3 Vai trò của các loại phụ gia thực phẩm 6

1.1.4 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe con người 7

1.2 Giới thiệu về phẩm màu thực phẩm 8

1.2.1 Định nghĩa 8

1.2.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm 8

1.2.3 Hiện trạng sử dụng phẩm màu trong thực phẩm 8

1.3 Tổng quan về một số phẩm màu thường được sử dụng trong thực phẩm 9

1.3.2 Chỉ tiêu hàm lượng các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm 17

1.4 Các phương pháp xác định phẩm màu 19

1.4.1 Phương pháp định tính xác định phẩm màu không được phép sử dụng 19

1.4.2 Phương pháp xác định các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 24

2.2.1 Hóa chất 24

2.2.2 Thiết bị 25

2.2.3 Dụng cụ 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tối ưu điều kiện xác định các phẩm màu tổng hợp trên hệ thống HPLC 29

3.1.1 Lựa chọn detector 29

3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký 30

3.1.3 Tối ưu thành phần pha động 34

3.1.4 Lựa chọn thể tích bơm mẫu 41

3.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 43

3.2.1 Tối ưu dung môi loại chất béo 43

3.2.2 Tối ưu dung môi chiết mẫu 44

3.2.3 Tối ưu pH chiết mẫu 46

3.2.4 Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu 46

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 49

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 49

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 53

3.3.3 Độ lặp lại của phương pháp 54

3.3.4 Độ thu hồi của phương pháp 57

3.4 Kết quả phân tích mẫu thực 62

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

An toàn thực phẩm là việc bảo đảm để thực phẩm không gây hại đến sức khỏe, tính mạng con người [5] An toàn thực phẩm là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, được tiếp cận và sử dụng với thực phẩm an toàn đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con người Hiện nay, với sự phát triển của khoa học và công nghệ đưa vào các khâu sản xuất giúp tăng năng suất cây trồng và vật nuôi cải thiện đời sống con người.Trước đây, trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm con người đã biết cho thêm một số chất vào thực phẩm để bảo quản, nâng cao chất lượng hoặc làm tăng tính hấp dẫn của thực phẩm như ướp muối, trộn thính, nhuộm màu thức ăn bằng các loại lá,

củ, quả, hạt… các chất thêm vào như vậy được gọi là phụ gia thực phẩm

Phẩm màu thực phẩm là một trong số những nhóm phụ gia thực phẩm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Chúng được bổ sung vào thực phẩm với mục đích tạo cho sản phẩm có màu sắc đẹp, tăng tính hấp dẫn đối với người tiêu dùng, hoàn toàn không có giá trị về mặt dinh dưỡng [5] Những thức ăn có chứa phẩm màu trong danh mục được phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm của Bộ Y tế, dưới mức giới hạn dư lượng cho phép thì không gây ảnh hưởng độc hại cho sức khoẻ người tiêu dùng.Tuy nhiên,

sử dụng phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm đã quá thời hạn sử dụng, ngoài danh mục được phép sử dụng hoặc trong danh mục được phép sử dụng nhưng vượt quá giới hạn cho phép, sử dụng hóa chất không rõ nguồn gốc, hóa chất bị cấm sử dụng trong hoạt động sản xuất, kinh doanh thực phẩm sẽ rất có hại đến sức khoẻ, có thể gây ngộ độc cấp tính, hậu quả sử dụng lâu dài tích luỹ cao có thể gây ung thư [5]

Vì vậy việc xác định hàm lượng các loại phẩm màu thực phẩm có mặt trong các loại thực phẩm là một vấn đề vô cùng cấp thiết hiện nay Đây cũng chính là lí do

chúng tôi chọn đề tài: “Tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu trong thực

phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao( HPLC)” nhằm 2 mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu trong thực phẩm

2 Áp dụng phương pháp để tách và định lượng một số phẩm màu trong một số mẫu thực phẩm

1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm

1.1.2.1 Phân loại theo nhóm chức năng

Các phụ gia thực phẩm có thể phân chia thành vài nhóm, mặc dù có một số phần chồng lẫn giữa các thể loại này.[11]

Bảng 1.1: Phân nhóm, chức năng công nghệ và qui định của các chất phụ gia TP

1 Chất điều vị Làm tăng hoặc khơi dậy hương vị có

2 Chất làm ẩm

Bảo vệ thực phẩm khỏi bị khô do làm giảm tác dụng của môi trường khí quyển có độ ẩm thấp

QCVN 4-2:2010/BYT

3 Chất tạo xốp Một chất hoặc hỗn hợp các chất sinh

khí và làm tăng thể tích của bột nhào QCVN 4-3:2010/BYT

4

Chất chống

đông vón Làm giảm khả năng kết dính của các phân tử thực phẩm QCVN 4-4:2010/BYT

5 Chất giữ màu làm ổn định, duy trì hoặc làm tăng màu

QCVN 4-9:2010/BYT

10 Phẩm màu Bổ sung hoặc khôi phục mầu của một

13 Chất ổn định Tạo khả năng duy trì một sự phân tán đồng nhất của hai hoặc nhiều chất

không trộn lẫn được trong TP

QCVN 4-13:2010/BYT

15 Chất xử lý bột Chất được pha vào bột để cải thiện chất

lượng làm bánh hoặc màu sắc của bột QCVN 4-15:2010/BYT

16 Chất độn Một chất không phải nước hoặc không khí làm cho thực phẩm tăng lên về khối

lượng nhưng không tạo thêm giá trị năng lượng có sẵn của thực phẩm

QCVN 4-16:2010/BYT

17 Chất khí đẩy

Một chất khí khác không khí đẩy một thực phẩm khỏi bao bì chứa thực phẩm đó

phẩm (như dầu và nước)

QCVN 4-22:2011/BYT

23 Chất tạo bọt

Tạo khả năng hình thành hoặc giữ một

sự phân tán đồng nhất của một pha khí trong một thực phẩm ở dạng lỏng hoặc dạng đặc

QCVN 4-23:2011/BYT

1.1.2.2 Phân loại theo số INS

Để quản lý các phụ gia thực phẩm và thông tin về chúng cho người tiêu dùng thì mỗi loại phụ gia đều được gắn với một số duy nhất Ban đầu các số này là các "số E" được sử dụng ở châu Âu cho tất cả các phụ gia đã được chấp nhận Hệ thống đánh

số này hiện đã được CAC chấp nhận và mở rộng để xác định trên bình diện quốc tế tất

cả các phụ gia thực phẩm mà không liên quan đến việc chúng có được chấp nhận sử dụng hay không Các phụ gia thực phẩm có thể phân chia thành vài nhóm, mặc dù có một số phần chồng lấn giữa các thể loại này

Mã số INS (International Numbering System) được CAC chấp nhận tại phiên họp thứ 18 (tháng 7 năm 1989) và được nhiều nước thành viên công nhận và áp dụng đến ngày nay

Mã số INS là một hệ thống mã số mở nhằm mã hoá các chất phụ gia đang sử dụng cũng như các chất sẽ được xem xét sau này Mã số INS rất thuận tiện trong tra cứu và ghi nhãn các chất phụ gia thực phẩm

Dưới đây là bảng phân loại các chất phụ gia thực phẩm theo số INS

Bảng1.2: Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS

Loại chất Khoảng số INS Tên chất phụ gia

350 – 359 Các malat & adipat

360 – 369 Các succinat & fumarat

520 – 529 Các sulfat & hiddroxit

530 – 549 Các hợp chất kim loại kiềm

1.1.3 Vai trò của các loại phụ gia thực phẩm [5]

Phụ gia thực phẩm là các yếu tố được bổ sung trong quá trình chế biến thực phẩm nhằm giúp cải thiện chất lượng, hương vị, màu sắc, thời gian sử dụng…Có thể được chiết xuất từ tự nhiên, hoặc tổng hợp từ các yếu tố hoá học trong phòng thí nghiệm, có thể cung cấp chất dinh dưỡng hoặc không… Hiện nay trên thị trường có rất nhiều các loại phụ gia với tính năng và vai trò khác nhau, phục vụ mọi nhu cầu đa dạng Có thể chia thành các nhóm phụ gia theo vai trò:

*Tăng giá trị dinh dưỡng

Phụ gia có thể được sử dụng như một chất để bổ sung những chất dinh dưỡng

đã bị thất thoát trong quá trình chế biến, sản xuất sản phẩm Hoặc bổ sung những chất dinh dưỡng mới vốn chưa có trong nguyên liệu sản phẩm ban đầu Có thể lấy ví dụ như khi chế biến các sản phẩm từ bột mì, bột gạo, người ta thường cho thêm phụ gia

bổ sung Vitamin B để bù vào phần vitamin B mất đi trong quá trình xát vỏ gạo

*Cải thiện mùi vị và màu sắc của sản phẩm

Với mục đích làm tăng tính hấp dẫn, ngon mắt của sản phẩm, các phụ gia thực phẩm được sử dụng để thay đổi màu sắc và mùi vị của nguyên liệu trong quá trình chế biến, phù hợp với khẩu bị và mong muốn của người thực hiện

Chất tạo mùi thường là các chất phụ gia hương liệu hoa quả, vani, socola… sử dụng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, nước giải khát…

*Bảo quản thực phẩm tươi lâu

Thông thường các loại thực phẩm thường bị tấn công bởi các vi sinh vật hoặc vi khuẩn, nấm mốc gây hư hỏng hoặc phân huỷ Phụ gia bảo quản thường hoạt động dưới dạng ngăn ngừa sự phát triển của các nhân tố vi sinh vật, vi khuẩn và giữ cho thực phẩm được tươi, ngon, ổn định chất lượng, mùi vị trong thời gian dài hơn

*Phụ gia làm thay đổi cấu trúc

Có nhiều phụ gia thực phẩm được sử dụng để giúp chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu hơn ví dụ như: làm đông, làm loãng hay kích thích nở…

- Chất làm cho món ăn có độ loãng ổn định, không đông đặc hay kết tủa ví dụ như canxi silicate, silicon dioxyd Các chất này có tác dụng ngăn bột, đường, muối hút nước rồi dính lại với nhau

- Chất làm đông các sản phẩm như: thạch, kem, bánh ngọt

Ví dụ: Carrageenan…

- Chất làm bột nở, như muối bicarbonate, bột nở, natri phosphat hoặc một vài loại men, được dùng khi làm bánh nướng, bánh mì giúp cho bánh mềm xốp, nhẹ hơn…

1.1.4 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe con người [8]

Nếu sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho sức khỏe:

+ Gây ngộ độc cấp tính: Nếu dùng quá liều cho phép

+ Gây ngộ độc mạn tính: Dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục, một

số chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thương lâu dài.Thí dụ: Khi sử dụng thực phẩm có hàn the, hàn the sẽ được đào thải qua nước tiểu 81%, qua phân 1%, qua mồ hôi 3% còn 15% được tích luỹ trong các mô mỡ, mô thần kinh, dần dần tác hại đến nguyên sinh chất và đồng hóa các aminoit, gây ra một hội chứng ngộ độc mạn tính: ăn không ngon, giảm cân, tiêu chảy, rụng tóc, suy thận mạn tính, da xanh xao, động kinh, trí tuệ giảm sút

+ Nguy cơ gây hình thành khối u, ung thư, đột biến gen, quái thai, nhất là các chất phụ gia tổng hợp

+ Nguy cơ ảnh hưởng tới chất lượng thực phẩm: phá huỷ các chất dinh dưỡng, vitamin

Hiện nay, việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khởe con người là một vấn đề phức tạp, gây nhiều tranh cãi Các triệu chứng thường thấy thuộc vào loại phản ứng dị ứng như: ngứa ngáy, da nổi đỏ, nhức đầu, đau bụng, nôn mửa, chóng mặt, khó thở…Ngoài ra việc sử dụng thường xuyên một số chất phụ gia với hàm lượng lớn trong một khoảng thời gian lâu dài, có thể gây ra các bệnh ung thư

- Chất màu thực phẩm: theo nghiên cứu các chất màu thực phẩm là nguyên nhân

chính gây ra chứng hiếu động thái quá ở trẻ nhỏ, hoặc một số phản ứng dị ứng Một số phản ứng được sinh ra do nhạy cảm với các thành phần trong thực phẩm bao gồm:

 Rối loạn thần kinh hiếu động thái quá, mất ngủ, dễ bị kích động

 Rối loạn tiêu hoá – đau bụng tiêu chảy

 Các vấn đề về hô hấp – bệnh hen, bệnh suyễn, viêm mũi và viêm xoang…

 Các vấn đề về da - chứng phát ban, nổi mụn, ngứa và sưng

 Dị ứng và tính mẫn cảm: Một số triệu chứng chung bao gồm: nhức đầu, đau yếu, tiêu chảy, rối loạn dạ dày…

1.2 Giới thiệu về phẩm màu thực phẩm

1.2.1 Định nghĩa[2]

Phẩm màu thực phẩm là phụ gia thực phẩm được sử dụng với mục đích tăng cường hoặc khôi phục màu cho sản phẩm thực phẩm chúng được dùng để tạo ra hoặc cải thiện màu sắc của thực phẩm, nhằm tăng tính hấp dẫn của sản phẩm, chúng hoàn toàn không có giá trị về mặt dinh dưỡng

1.2.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm

Phẩm màu được phân làm hai loại chính:

a Phẩm màu tự nhiên: là các chất màu được chiết xuất ra hoặc được chế biến

từ các nguyên liệu hữu cơ (thực vật, động vật) sẵn có trong tự nhiên Ví dụ: Caroten tự nhiên được chiết xuất từ các loại quả có màu vàng, Curcumin được chiết xuất từ củ nghệ, màu Caramen được chế biến từ đường Nhóm phẩm màu có nguồn gốc tự nhiên có nhược điểm là độ bền kém, sử dụng với lượng lớn nên giá thành sản phẩm cao

b Phẩm màu tổng hợp hoá học: Là các phẩm màu được tạo ra bằng các phản

ứng tổng hợp hoá học Ví dụ: Amaranth (đỏ), Brilliant blue (xanh), Sunset yellow (vàng cam), Tartazine (vàng chanh) Các phẩm màu tổng hợp thường đạt độ bền màu cao, với một lượng nhỏ đã cho màu đạt với yêu cầu đặt ra, nhưng chúng có thể gây ngộ độc nếu dùng loại không nguyên chất, không được phép dùng trong thực phẩm

1.2.3 Hiện trạng sử dụng phẩm màu trong thực phẩm [2]

Theo danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm, Bộ Y tế đã

ban hành Thông tư 27/2012/TT-BYT: qui định cho 23 nhóm chức năng với 400 chất

Những loại phẩm màu này không gây độc hại cho sức khỏe người tiêu dùng nhưng

cũng cần sử dụng dưới mức giới hạn dư lượng cho phép Tuy nhiên, hiện nay vẫn có

một số cơ sở sản xuất, kinh doanh do quá ham lợi nên thường sử dụng phẩm màu vượt

giới hạn cho phép, đặc biệt là màu tổng hợp, hoặc sử dụng phẩm màu ngoài danh mục

cho phép Thậm chí có cơ sở sản xuất thực phẩm đã liều lĩnh, xem thường tính mạng

người tiêu dùng, lấy phẩm màu sử dụng trong công nghiệp đưa vào sản xuất thực

phẩm gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng (gây hậu quả tức thời

như các trường hợp ngộ độc cấp tính, có thể dẫn đến tử vong hoặc gây độc tích luỹ từ

các liều lượng rất nhỏ…)

Năm 2013 Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tiến

hành đánh giá hàm lượng phẩm màu trong một số thực phẩm lưu thông trên thị trường

10 tỉnh đồng bằng sông Hồng Kết quả cho thấy trong 140 mẫu bánh kẹo các loại, 50

mẫu cốm và bánh suse 100% âm tính với phẩm màu kiềm, có tổng số 28/140 mẫu

bánh kẹo chứa phẩm màu gồm: tartazine, vàng sunset, xanh brilliant, ponceau 4R,

amaranth, xanh lục, camoisine, carmin với hàm lượng nằm trong giới hạn cho phép

của Bộ Y tế theo thông tư số 27-2012/TT-BYT [10]

1.3 Tổng quan về một số phẩm màu thường được sử dụng trong thực phẩm

a Tartrazine- E102 [11]

Tartrazine chủ yếu gồm trinatri 5-hydroxy-1- sunfonatophenyl) -

(4-sunfonatophenylazo) - pyrazol -3 - cacboxylat và một số chất màu phụ cùng với các

chất không màu khác như natri clorua hoặc natrisunfat

+ Tên hóa học: Trinatri 5 – hydroxyl – 1 - sulfonatophenyl) – 4 -

(4-sunfonato - phenylazo) – H – pyrazol – 3 - cacboxylat

+ CTPT: C16H9N4Na3O9S2

+ Khối lượng phân tử: 534.37 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Tartrazine

+ Trạng thái: bột hoặc màu vàng chanh

+ Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong etanol

+ Tartrazine được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng miệng, bánh kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát, rau muối chua, sốt, cá và sản phẩm nướng

b Amaranth [12]

Amaranth chủ yếu gồm trisodium 3-hydroxy-4-(4-sulfonato-1-naphthylazo)-

2,7-naphthalenedisulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

+ Tên hóa học: Trisodium 3-hydroxy-4-(4-sulfonato-1-naphthylazo)-2,7- naphthalene - disulfonate

+ CTPT: C20H11N2Na3O10S3

+ Khối lượng phân tử: 604.48 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Amaranth

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu nâu đỏ

+ Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong etanol

+ Amaranth được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng miệng, bánh kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát, rau muối chua, sốt, cá và sản phẩm nướng

c Indigo carmin [13]

Indigo carmin chủ yếu gồm disodium 3,3' -dioxo-[delta2,2'

disulfonate, và disodium 3,3'-dioxo-[delta2,2'-biindoline]-5,7'-disulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

-biindoline]-5,5'-+ Tên hóa học: Disodium 3,3'-dioxo-[delta2,2'-biindoline]-5,5'-disulfonate

+ CTPT: C16H8N2Na2O8S2

+ Khối lượng phân tử: 466.36 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Indigocarmin

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu xanh

+ Tính tan: tan nhiều trong nước và tan ít trong etanol

+ Indigo carmin được dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt trong đồ tráng miệng, bánh kẹo, kem, sản phẩm sữa, nước giải khát

d Ponceau 4R- E 124 [14]

Ponceau 4R chủ yếu gồm trinatri – 2 – hydroxyl – 1 - (4 sulfonato – 1 - naphtylazo) - 6,8 - naphthalendisulfonat và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natrisulfat

+ Tên gọi hóa học: Trinatri-2- hydroxyl-1-( 4 sulfonato-1-naphtylazo)- 6,8- naphthalendisulfonat

+ CTPT:C20H11N2Na3O10S3.1,5 H2O

+ Khối lượng phân tử: 631.51 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ponceau 4R

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu hơi đỏ

+ Tính tan: Tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Ponceau 4R có trong nước giải khát, bánh kẹo, mứt, đồ hộp, cá, lớp áo phô mai và kẹo…

e Sunset yellow FCF- E 110 [15]

Sunset yellow FCF chủ yếu gồm dinatri 6hydroxy5( 4sulfonatophenylazo) 2- naphthalene-6- sulfonat và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

-+ Tên hóa học: Dinatri 6 – hydroxyl – 5 - (4 - sulfonatophenylazo) – 2 – naphthalene -6 - sulfonat

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu vàng đỏ

+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Sunset yellow FCF: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát (nhưng có thể tạo kết tủa nếu có ion calcium hiện diện), kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng

f Allura red AC [16]

Allura red chủ yếu gồm disodium sulfonato phenylazo)-2-naphthalene-sulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

6-hydroxy-5-(2-methoxy-5-methyl-4-+ Tên hóa học: Disodium 6-hydroxy-5-(2-methoxy-5-methyl-4-sulfonato

phenylazo)-2-naphthalenesulfonate

+ CTPT: C18H14N2Na2O8S2

+ Khối lượng phân tử: 469.63 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Allura red

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu vàng đỏ

+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Allura red: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

g Fast Green FCF [17]

Fast green chủ yếu gồm disodium sulfonatobenzyl)amino]phenyl](4-hydroxy-2-sulfonatophenyl)methylene]-2,5-

3-[N-ethyl-N-[4-[[4-[N-ethyl-N-(3-cyclohexadien-1-ylidene]ammoniomethyl]benzenesulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

+ Tên hóa học: Disodium 3-[N-ethyl-N-[4-[[4-[N-ethyl-N-(3-sulfonatobenzyl) amino] phenyl] (4-hydroxy-2-sulfonatophenyl) methylene]-2,5-cyclohexadien-1- ylidene] ammoniomethyl]-benzenesulfonate

+ CTPT: C37H34N2Na2O10S3

+ Khối lượng phân tử: 808.86 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Fast green

+ Trạng thái: bột hoặc tinh thể màu nâu tím

+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Fast green: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

h Carmoisine

Carmoisine chủ yếu gồm disodium naphthalenesulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

+ Tên hóa học: Disodium naphthalenesulfonate

4-hydroxy-3-(4-sulfonato-1-naphthylazo)-1-+ CTPT: C20H12N2Na2O7S2

+ Khối lượng phân tử: 502.44 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Camoisine

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu đỏ

+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Carmoisine: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

i Erythrosine [18]

Erythosine chủ yếu gồm disodium salt of 2,4,5,7-tetraiodo-3-isoxanthone monohydrate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natri sulfat

9-(o-carboxyphenyl)-6-hydroxy-+ Tên hóa học: Disodium salt of tetraiodo-3-isoxanthone monohydrate

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu đỏ

+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Erythosine: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

k Brilliant Blue FCF [19]

Brilliant Blue chủ yếu gồm Disodium sulfonatobenzyl)-amino] phenyl] (2-sulfonatophenyl)methylene]-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene] ammoniomethyl] benzenesulfonate và một số chất màu phụ cùng với các chất không màu khác như natri clorua hoặc natrisulfat

+ Tên gọi hóa học: Disodium sulfonatobenzyl)-amino]phenyl](2-sulfonatophenyl)methylene]-2,5-cyclohexa-diene-1-ylidene]ammoniomethyl]-benzenesulfonate;

3-[N-ethyl-N-[4-[[4-[N-ethyl-N-(3-Disodium I-[4-(N-ethyl-3-sulfonatobenzylamino)phenyl]-I- sulfonatobenzyliminio)cyclohexa-2,5-dienyli-dene]toluene-2-sulfonate

[4-(N-ethyl-3-+ CTPT: C37H34N2Na2O9S3

+ Khối lượng phân tử: 792.86 g/mol

+ CTCT:

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của Brillant Blue

+ Trạng thái: bột hoặc hạt màu xanh

+ Tính tan: tan trong nước và tan ít trong etanol

+ Brilliant blue: dùng rộng rãi trong thực phẩm, đặc biệt cho nước giải khát, kem, bánh kẹo, đồ hộp, bánh nướng và đồ tráng miệng…

1.3.2 Chỉ tiêu hàm lƣợng các phẩm màu đƣợc phép sử dụng trong thực phẩm

Theo tiêu chuẩn về phân loại những chất độc hại thì 10 phẩm màu Tartrazine, Amaranth, Indigo carmin, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF, Allura red, Fast Green, Camoisine, Erythrosine và Brilliant Blue đều thuộc nhóm những phẩm màu được phép

sử dụng trong thực phẩm với độ độc nhạy thấp, do chúng hòa tan nhiều trong nước nhưng không tích tụ trong cơ thể mà trao đổi qua gan và được bài tiết trong nước tiểu Tuy nhiên nếu sử dụng các loại thực phẩm có dư lượng phẩm màu vượt quá giới hạn cho phép thêm vào thực phẩm thì rất dễ dẫn tới nguy cơ ngộ độc mãn tính, hàm lượng tích lũy lớn có thể dẫn đến ung thư Dưới đây là chỉ tiêu hàm lượng tối đa các phẩm màu được phép thêm vào trong các loại thực phẩm [2]

Bảng 1.3: Chỉ tiêu hàm lượng các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm

ST

TT Ama In PR SY Allu FG Car Ery Bri

1 Đồ uống từ sữa, có hương liệu hoặc lên men 300 - 300 150 300 300 100 - - 150

3 Quả đóng hộp hoặc đóng chai (đã thanh trùng) 200 - - 300 50 200 200 - - 200

4 Rau, củ (bao gồm nấm, rễ, thực vật thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô

hội) tảo biển ngâm trong dấm, dầu, nước muối hoặc nước tương 300 200 150 - 30 300 300 - 30 500

5 Rau đóng hộp, đóng chai (đã thanh trùng) hoặc đóng túi (bao gồm

nấm, rễ, thực vật thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) và tảo biển 100 - 300 - GMP 200 200 GMP - 200

6 Mỳ ống, mì dẹt đã được làm chín và các sản phẩm tương tự 300 100 - - 300 - 290 GMP - 100

7 Cá, sản phẩm thủy sản lên men hoặc đóng hộp, kể cả nhuyễn

thể, giáp xác, da gai đóng hộp được bảo quản hoàn toàn 30 30 - 500 300 - 100 - - 500

8 Nước chấm không ở dạng nhũ tương (VD: tương cà chua,

Ghi chú: Các giá trị ” –” là các sản phẩm không chứa phẩm màu

”GMP” – là thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practices - GMP)

Sữa lên men (nguyên kem): Không được vượt quá mức giới hạn khi có mặt của hương liệu

1.4 Các phương pháp xác định phẩm màu

1.4.1 Phương pháp định tính xác định phẩm màu không được phép sử dụng

Các phẩm màu thuộc nhóm phẩm dẫn xuất từ than đá có tính axit: được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm

Những chất phẩm thuộc nhóm dẫn xuất từ than đá có tính kiềm: đều độc hại, có khả năng gây ung thư nên không được phép dùng trong chế biến thực phẩm Do đó, có thể căn cứ vào tính axit hay tính kiềm làm đặc điểm nhận dạng phẩm được phép sử dụng hay không Phương pháp được tiến hành cụ thể như sau:

Làm nhiều bộ, mỗi bộ gồm 3 ống nghiệm 10 ml có nút vặn bằng nhựa trong đó: cho vào ống 1: 5ml nước hoặc cồn 75 độ, và 5 giọt NH4OH, cho vào ống 2:3-5 ml ete etylic và 5 giọt NH4OH đặc; cho vào ống 3: 3-5 ml axit axetic 5% Mỗi mẫu ta dùng một bộ như trên và thao tác như sau: Phẩm mẫu dầm nhỏ cho vào ống 1, đậy nắp lắc

kỹ, để yên Gạn nước ống 1 vào ống 2 Để yên Gạn lớp ete bên trên ống 2 sang ống 3, lắc đều, để yên quan sát, đánh giá: nếu dung dịch axit acetic bên dưới có màu: phẩm có tính kiềm, không được phép sử dụng Dung dịch axit axetic bên dưới không có màu: phẩm được phép sử dụng

1.4.2 Phương pháp xác định các phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm

Trên thế giới, việc xác định hàm lượng các phẩm màu nói chung và phẩm màu trong thực phẩm nói riêng là vấn đề đang rất được quan tâm Các phương pháp truyền thống làm phẩm màu như sắc ký giấy , sắc ký bản mỏng , chiết tách sử du ̣ng len lông cừu…Nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định các phẩm màu này bằng nhiều phương pháp khác nhau trên các đối tượng như bánh, kẹo, nước giải khát, thịt, cá…Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được tiến hành thực nghiệm

1.4.2.1 Phương pháp trắc quang

Phân tích trắc quang là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các phương pháp phân tích hoá lý Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém và dễ thực hiện Phương pháp chỉ phù hợp để xác định đơn lẻ từng phẩm màu hoặc các phẩm màu có bước sóng hấp thụ xa nhau Khi phân tích đồng thời nhiều phẩm màu đặc biệt

những phẩm màu có bước sóng hấp thụ gần nhau dễ gây sai số do hiện tượng chồng phổ làm cho độ hấp thụ tăng lên

Tác giả L.F Capitán-Vallvey và cộng sự [21] đã phát triển phương pháp trắc quang sử dụng thuật toán hồi quy đa biến để xác định đồng thời các chất màu tartrazine, ponceau 4R và vàng FCF trong thực phẩm Các chất màu được cố định trên gel Sephadex DEAE A-25 ở pH 2.0 Đo phổ hấp thụ quang của các chất trong khoảng bước sóng 400- 800 nm so với mẫu trắng và định lượng bằng phương pháp đường chuẩn Khoảng tuyến tính cho cả 3 chất màu là 50,0-650,0 ng/ml Kết quả thực nghiệm cho độ lệch chuẩn là 5,5267 cho SY, 6,3878 cho TT và 6,9816 cho PR Hệ số tương quan tuyến tính là 0,9977, 0,9978 và 0,9954 cho SY, TT và PR Phương pháp này được ứng dụng để xác định các chất màu trong thực phẩm và kết quả được so sánh với phương pháp HPLC Trong hầu hết các trường hợp (8/9 mẫu) kết quả của 2 phương pháp là tương đương nhau

1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Tác giả Stefania Bonan và cộng sự [28] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng với detector UV để xác định đồng thời 17 phẩm màu tổng hợp trong mẫu thực phẩm rắn và đồ uống, bao gồm azorubine (E122), amaranth (E123), cochineal red A (E124), red 2G (E128), allura red (E129), azocarmine B (AZO B), azocarmine G (AZO G), ponceau 2R (P2R), ponceau 6R (P6R), tartrazine (E102), sunset yellow (E110), quinoline yellow (E104), orange II (OR II), metanil yellow (MY), patent blue V (E131), indigo carmine (E132) and brilliant blue FCF (E133) Các mẫu rắn được chiết trong hỗn hợp nước-rượu, làm sạch trên cột chiết pha rắn SPE polyamide và rửa giải bằng dung dịch methanol Các mẫu đồ uống dạng lỏng được pha loãng và lọc Phương pháp đã được thẩm định độ chính xác (độ đúng và độ chụm), độ đặc hiệu theo quy định (2004/ 882/ CE) và được áp dụng cho khoảng nồng độ từ 5 đến 300 mg/ kg với mẫu rắn và 5-100 mg/ l cho đồ uống phụ thuộc vào từng chất

Tác giả Simone Pereira Alvesa và cộng sự [27] đã phát triển và áp dụng phương pháp để xác định 5 phẩm màu tổng hợp (Sunset Yellow, tartrazine, Amaranth, Brilliant Blue và Red-40) trong ba loại thực phẩm khác nhau: bột nước cốt rắn, bột thạch rắn và

nước giải khát sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-DAD Quá trình sắc

ký được khảo sát sử dụng một cột ODS Zorbax (250 mm, 4,6 mm, 5 mm) và hai hệ thống dung môi khác nhau Chuẩn bị mẫu bao gồm hòa tan và lọc các mẫu Phương pháp có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phù hợp và hiệu suất thu hồi cao (> 98,8%) Tất cả các mẫu nghiên cứu cho thấy nồng độ phẩm màu phù hợp với quy định của Brazil

Tác giả Katerina S Miniotia và cộng sự [22]đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha đảo để tách thành công 13 màu thực phẩm tổng hợp (Tartrazine E 102, E 104 Quinoline vàng, Sunset Yellow E110, Carmoisine E122, Amaranth E123, Ponceau 4R E124, Erythrosin E127, Red 2G E128, Allura Red AC E129, xanh ve E131, Indigo Carmine E132, Brilliant Blue FCF E133 và Green SE E142) Pha tĩnh sử dụng cột C18

và pha động chứa hỗn hợp acetonitrile-methanol với tỉ lệ (20:80 v/v) và 1% (m/v) đệm ammonium acetate ở pH 7,5 Quá trình rửa giải gradient đã được tối ưu để tách thành công các chất trong vòng 29 phút Định lượng các chất màu ở bước sóng 350- 800 nm Phương pháp đã được thẩm định các thông số Giới hạn phát hiện của các chất trong khoảng 1,59 Green SE (E142) và 22,1 Ponceau 4R (E124) mg/L Độ chụm trong ngày (RSDr) dao động từ 0,37% ( Camoisine E122 trong trái cây uống có hương vị ở nồng độ

100 mg/L) lên 4,8% (Green SE E142 đường ở mức 0,9 mg/ kg) Độ chụm giữa các ngày (RSDR) là giữa 0,86% cho camoisine E122 trong trái cây có hương vị thức uống tại 100 mg/L và 10% cho green SE E142 trong mứt ở nồng độ 9 mg/kg Độ thu hồi cao

từ 94% (E142 trong mứt) đến 102% (E131 trong đồ ngọt) Phương pháp này được áp dụng cho việc xác định các chất màu trong nhiều loại thực phẩm hòa tan trong nước, như trái cây hương vị thức uống, đồ uống có cồn, mứt, bánh kẹo đường và đồ ngọt Tác giả N Yoshioka và cộng sự [29] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết pha đảo với mảng phát hiện photodiode để xác định thành công 40 phẩm màu tổng hợp Các phẩm màu được phân tích trong vòng 19 phút sử dụng một cột phân tích ngắn (50mm×4.6mm, 1.8mm) ở 50°C với gradient rửa giải: Ponceau 6R, Tartrazine, Fast vàng AB, Amaranth, Indigotin, Naphthol vàng S, Chrysoine, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF , đỏ 10B, Orange G, Acid violet 7, Brilliant đen PN, Allura red AC, Yellow

2G, Red 2G, Uranine, Fast E đỏ, xanh S, Ponceau 2R, Azorubine, Orange I, Quinoline màu vàng, màu vàng Martius, Ponceau SX, ponceau 3R, Fast Green FCF, Eosine, Brilliant Blue FCF, Orange II, Orange RN, Acid blue 1, Erythrosin, Amido đen 10B, Acid đỏ 52, Patent xanh V, Acid xanh 9, Phloxine B, Benzyl tím 4B, và Rose Bengal

Độ thu hồi của các hợp chất này khi thêm chuẩn vào nước giải khát và bánh kẹo tại 5mg/g dao động 76,6-115,0%, và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là trong vòng 6,0% Các giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 0,03 và 0,1 mg/g cho tất cả các chất Tác giả Ming Maa, b và cộng sự [24] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ để xác định đồng thời các phẩm màu tổng hợp tan trong nước và tan trong dầu: Tartrazine, Amaranth, Ponceau 4R, Sunset Yellow FCF và Sudan (I-IV) Phương pháp này sử dụng Dimethylsulfoxide (DMSO)

là dung môi chiết trong quá trình chuẩn bị mẫu và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) mảng – diode (PDA)-ghép khối phổ phun điện tử (ESI-MS) Giới hạn phát hiện và định lượng trong phạm vi 0,01-4 và 0,03-11,2 ng Hiệu suất thu hồi dao động 93,2-108,3% Độ lệch chuẩn tương đối < 8,2% Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định các chất màu hòa tan trong nước trong các mẫu nước ngọt và chất màu tan trong dầu trong các mẫu bột ớt và gia vị ớt

Tác giả G.Karanikolopoulos và cộng sự [23] đã nghiên cứu và phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định đồng thời 7 phẩm trong cá và các sản phẩm

từ bằng phương pháp HPLC-PDA: E100 Sunset Yellow, E122 Azorubin, E123 Amaranth, E124 Ponceau 4R, E127 Erythrosine, E128 Red 2G, E129 Allura Red AC với điều kiện chạy máy pha động gồm kênh A: Amoni acetat 0,13M (w/v) ở pH 7.5, kênh B: MeOH, kênh C: ACN Chương trình gradien đã được tối ưu để tách thành công các chất trong vòng 22 phút Sử dụng detector PDA ở bước sóng 300-700nm, cột C18 Symmetry C18(25mm × 4.6mm×5 µm), tốc độ dòng 1.5mL/phút Quá trình xử lý mẫu sử dụng 3 thí nghiệm như sau:

+ Thí nghiệm 1: chiết mẫu bằng dung dịch I (NH3:MeOH= 5:95) + 10ml H2O, sau đó điều chỉnh pH 4.5 bằng dung dịch axit HCl 6N

+ Thí nghiệm 2: chiết mẫu bằng dung dịch I (NH3:MeOH= 5:95) + 10ml H2O, sau đó điều chỉnh pH 7.0 bằng dung dịch axit HCl 6N

+ Thí nghiệm 3: chiết mẫu bằng dung dịch I (NH3:MeOH= 5:95) + 10ml amoni acetat 0.13M, điều chỉnh pH 7.0 bằng dung dịch axit HCl 6N

Hiệu suất thu hồi ở Thí nghiệm 3 là cao nhất và >90% Độ lệch chuẩn nhỏ <10% cũng đã đạt được Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong việc xác định các chất màu có trong nền mẫu cá và các sản phẩm từ cá như trứng cá

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: thực phẩm gồm bánh, kẹo, thạch, nước giải khát

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

* Chất chuẩn

- Chuẩn sunset yellow độ tinh khiết ≥ 90% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn erythrosin độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn brilliant blue độ tinh khiết ≥ 50% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn indigocarmin độ tinh khiết ≥ 80% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn carmoisine độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn amaranth độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn fast green độ tinh khiết ≥ 99% (hãng Merck)

- Chuẩn tartrazine độ tinh khiết ≥ 85% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn ponceau 4R độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich)

- Chuẩn allura red từ độ tinh khiết ≥ 99% (hãng sigma aldrich)

+ Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: cân khoảng 0,1g trên cân phân tích có độ chính xác 0,0001g chuẩn phẩm màu, hòa tan và định mức 100ml bằng H2O Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm

+ Dung dịch chuẩn trung gian (200 ppm): hút 2ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch bằng H2O

+ Các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 ppm được pha trong H2O

* Các loại hóa chất, dung môi khác:

- Methanol (Merck 99,9%) - MeOH

- n-hexan (Merck 99,9%)

- Ethanol (Merck 99,9%) -EtOH

- Petroleum ete (Merck 99,9%)

- Natri hydrophotphate (Merck 99,9%) – NaH2PO4

- Amoni axetat (Merck 99,9%) – CH3COONH4

- Nước cất dùng cho sắc ký lỏng: nước cất hai lần lọc qua bộ lọc màng 0,45µm sau đó rung siêu âm

- Chuẩn bị pha động: Kênh A là dung dịch natri hydrophotphate NaH2PO4, kênh

B là MeOH, ACN

2.2.2 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu bao gồm: Bơm cao áp LC 20AD,

bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AHT, buồng ổn định nhiệt độ cột CTO 10ASvp, detector mảng diod aray PDA - M20A Cột sắc ký C18 - SymmetryC18(150 mm x 4,6mm x 5μm) và tiền cột C18 (20 mm × 3,9 mm × 5µm)

- Máy lắc vortex

- Máy đồng nhất mẫu

- Máy ly tâm Hermle

- Máy rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Germany)

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg)

- Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g)

- Ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Đa số các phẩm màu trên đều thuộc nhóm chất màu monoazo trong phân tử có chứa một nhóm mang màu azo như -N = N - liên kết với các gốc thơm Phẩm nhuộm Azo là những chất rắn, chỉ hoà tan trong nước khi trong phân tử có chứa các nhóm -SO3H, -COOH hoặc -R4N+ nên chúng là các hợp chất phân cực Có thể sử dụng

nhiều phương pháp khác nhau để xác định phẩm màu trong thực phẩm như: phương pháp trắc quang, phương pháp HPLC kết hợp với một detector thích hợp: UV-VIS, PDA, MS…Sử dụng phương pháp trắc quang cho kết quả kém chính xác khi định lượng đồng thời nhiều phẩm màu có bước sóng hấp thụ gần nhau Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ có độ nhạy cao, nhưng thiết bị đắt tiền chưa phổ biến tại Việt Nam Do vậy, để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao để xác định các phẩm màu trong thực phẩm Đây là phương pháp hiện đại, có độ tin cậy cao, có tính ứng dụng rộng rãi

Nguyên lý: Sử dụng hỗn hợp dung môi gồm (NH3:MeOH) và CH3COONH4 để chiết phẩm màu ra khỏi nền mẫu, tiến hành rung siêu âm, ly tâm Dịch chiết được gộp vào bình định mức 50 ml, điều chỉnh pH sau đó lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA với quy trình phân tích mẫu dự kiến như sau:

* Tóm tắt quy trình dự kiến

Hình 2.1 Quy trình phân tích một số phẩm màu

Mẫu TP chứa chất béo Mẫu nguyên liệu không chứa chất béo

+ Dung môi chiết Cân mẫu vào ống ly tâm 50ml

Điều chỉnh pH

- Mẫu được đồng nhất kỹ

- Cân mẫu vào ống ly tâm, với nền mẫu chứa nhiều chất béo (loại chất béo trước khi phân tích)

- Thêm dung môi chiết mẫu vào ống ly tâm trên

- Lắc vortex để mẫu và dung môi được đảo trộn đều

- Rung siêu âm để tăng khả năng hòa tan của chất phân tích

- Để nguội đến nhiệt độ phòng

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và lắng chặt phần cặn

- Phần dịch trong được gạn vào bình định mức 50 ml, phần cặn được chiết lặp với dung môi chiết ở trên

- Định mức đến vạch bằng dung môi chiết, lọc, điều chỉnh pH

- Dịch lọc được bơm vào hệ thống HPLC để định tính và định lượng chất phân tích

2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [6,7,20]

Theo quy định của USFDA, AOAC, USP các thông số cần thẩm định bao gồm các yếu tố chính sau:

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn; (Linearity and Calibration)

- Giới hạn phát hiện; (Limit of Detection – LOD)

- Giới hạn định lượng; (Limit of Quatification – LOQ)

- Độ đúng; (Trueness)

- Độ chụm; (Precision)

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào: Kỹ thuật áp dụng, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm, trong phạm vi và thời gian nghiên cứu, chúng tôi thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thông qua việc đánh giá các thông số: Khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chọn lọc, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng (thông qua hiệu suất thu hồi), độ chụm (thông qua độ lặp lại)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu điều kiện xác định các phẩm màu tổng hợp trên hệ thống HPLC

3.1.1 Lựa chọn detector

Phẩm màu trong thực phẩm là các hợp chất có khả năng hấp thụ tại bước sóng trong vùng khả kiến, tham khảo một số tài liệu [22,24,25], phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành phát hiện và định lượng các phẩm màu trong thực phẩm trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện như sau:

100 200 300 400 500 mAU

250 500 750 1000 1250

250 500 750 mAU

Hình 3.1 Hình dạng phổ hấp thụ của các phẩm màu khi sử dụng detector PDA

Camoisine, 8 Erythrosine, 9 Ponceau 4R, 10 Brillant Blue

Nhận xét: nhìn vào hình 3.1 cho thấy khi sử dụng detector PDA đỉnh hấp thụ cực đại của tatrazine là 426 nm, amaranhth là 521 nm, indigocarmin là 610 nm, sunset yellow là 483 nm, allura red là 508 nm, fast green là 623 nm, camoisine là 519 nm, erythrosine là 531 nm, ponceau 4R là 509 nm, brillant blue là 591 nm

3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký

Cột sắc ký có vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích ra khỏi nhau, nó được ví như trái tim của hệ thống sắc ký Hiện nay, sắc ký pha đảo được sử dụng rộng rãi, do tính phổ biến, tính kinh tế và có hiệu quả cao, hệ này có thể tách các chất có độ phân cực đa dạng từ rất phân cực, ít phân cực đến không phân cực [3,6] Do đó,

chúng tôi lựa chọn hệ sắc ký pha đảo, khảo sát khả năng tách của chất phân tích trên một số cột C18 và cố định các điều kiện phân tích khác:

- Detector PDA tại các bước sóng từ 400 nm đến 800 nm

- Pha động: rửa giải theo chương trình gradient nồng độ

Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tối ưu trên 3 cột C18 với các kích thước khác nhau gồm:

- Cột Xbridge C18 (75mm × 2,1mm × 3,5µm) và tiền cột C18 (20mm × 4,6mm × 3,5µm)

- Cột IntertSustain C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) và tiền cột C18 (10mm × 4,6mm × 5µm)

- Cột Symmetry C18 - Waters (150mm × 4,6 mm × 5µm) và tiền cột C18 (20mm

Nhận xét: Kết quả chỉ ra trong hình 3.2 cho thấy theo dõi ở bước sóng 484 nm

khi sử dụng cột tách hạt nhỏ X-Brigde C 18 (75mm × 2,1mm × 3,5µm), cột ngắn nên

chất phân tích ra quá sớm đồng thời áp suất của cột rất cao có hại cho bơm và cho hệ thống sắc ký Nếu hoạt động liên tục ở áp suất cao như vậy bơm dễ xảy ra hiện tượng

áp suất không ổn định, tốc độ dòng không chính xác Vì vậy, khi phân tích trên nền mẫu thực chất phân tích sẽ không tách được với tạp chất nên xác định là rất khó

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min -10

Nhận xét: Kết quả chỉ ra trong hình 3.3 cho thấy theo dõi ở bước sóng 484 nm

và 640 nm khi sử dụng cột IntertSustain C18 (250mm × 4.6mm × 5µm) có thể tách được chất phân tích Tuy nhiên, chân píc rất doãng, thời gian chất phân tích bị rửa giải

ra muộn, thời gian lưu ngắn làm cho các píc chồng nhau Như vậy, khi phân tích trên nền mẫu thực có thể chất phân tích bị lẫn tạp chất khác nên việc định lượng sẽ không chính xác