Tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu trong thực phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG NCS VŨ THỊ TRANG Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang giao đề tài, dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, PGS TS Lê Thị Hồng Hảo tạo điều kiện, giúp hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chi ̣trong Khoa chất lượng phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viê ̣n Kiể m nghiê ̣m an toàn vê ̣ sinh thực phẩ m Quố c gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn này Cuố i cùng, xin gửi lời biế t ơn sâu sắ c tới gia đình , bạn bè bên cạnh chia sẻ khó khăn, đô ̣ng viên và giúp đỡ ho ̣c tâ ̣p cũng số ng Do thời gian thực hiê ̣n đề tài có hạn nên không tránh những thiế u s ót, rấ t mong nhâ ̣n đươ ̣c ý kiế n đóng góp của thầ y cô và các ba ̣n để luận văn hoàn thiện Hà Nội, Ngày 30 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hải Yến DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích thức CAC Codex Alimentarius Committee Ủy ban mã thực phẩm GMP Good Manufacturing Practices Thực hành sản xuất tốt HPLC High high performance liquidchromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC High performance thin layer chromatography sắc ký lớp mỏng hiệu cao JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Uỷ ban chuyên gia phối hợp FAO/WHO phụ gia thực phẩm LCMS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ NP-HPLC Normal phase- High high performance liquidchromatography Sắc ký pha thường RP-HPLC Revesed phase- High high performance liquidchromatography Sắc ký pha đảo R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo Tartrazine 10 Hình 1.2 Công thức cấu tạo Amaranth 10 Hình 1.3 Công thức cấu tạo Indigocarmin 11 Hình 1.4 Công thức cấu tạo Ponceau 4R 12 Hình 1.5 Công thức cấu tạo Sunset Yellow 12 Hình 1.6 Công thức cấu tạo Allura red 13 Hình 1.7 Công thức cấu tạo Fast green 14 Hình 1.8 Công thức cấu tạo Camoisine 15 Hình 1.9 Công thức cấu tạo Erythrosine 15 Hình 1.10 Công thức cấu tạo Brillant Blue 16 Hình 2.1 Quy trình phân tích số phẩm màu 27 Hình 3.1: Hình dạng phổ hấp thụ phẩm màu sử dụng detector PDA 30 Hình 3.2 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích cột X-Brigde C18 31 Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích cột IntertSustain C18 32 Hình 3.4 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích cột Symmetry C18 33 Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.05 M – ACN 37 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.05 M – MeOH 39 Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.01 M – MeOH 41 Hình 3.8 Ảnh hưởng dung môi loại béo đến độ thu hồi phẩm màu 44 Hình 3.9 Ảnh hưởng dung môi chiết mẫu đến độ thu hồi phẩm màu 45 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH trình chiết mẫu 46 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ trình chiết mẫu 47 Hình 3.12 Quy trình chiết mẫu xác định số phẩm màu thực phẩm 48 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân nhóm, chức công nghệ qui định chất phụ gia TP Bảng 1.2 Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS Bảng 1.3 Chỉ tiêu hàm lượng phẩm màu phép sử dụng thực phẩm 18 Bảng 3.1 Các gradient thử nghiệm với pha động NaH2PO4 0.05 M – ACN 36 Bảng 3.2 Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) fast green, camoisine, erythrosine ứng với chế độ gradient 36 Bảng 3.3 Các gradient thử nghiệm với pha động NaH2PO4 0.05 M – MeOH 38 Bảng 3.4 Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) fast green, camoisine, erythrosine ứng với chế độ gradient 38 Bảng 3.5 Các gradient thử nghiệm với pha động NaH2PO4 0.01 M – MeOH 40 Bảng 3.6: Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) fast green, camoisine, erythrosine ứng với chế độ gradient 40 Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính đường chuẩn tartrazine 49 Bảng 3.8 Khoảng tuyến tính đường chuẩn amaranth 50 Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn 10 phẩm màu 53 Bảng 3.10 Giới hạn phát giới hạn định lượng chất phân tích 54 Bảng 3.11 Độ lặp lại phẩm màu mẫu bánh 55 Bảng 3.12 Độ lặp lại phẩm màu mẫu thạch 56 Bảng 3.13 Độ thu hồi phương pháp với 10 phẩm màu mẫu bánh 58 Bảng 3.14 Độ thu hồi phương pháp với 10 phẩm màu mẫu thạch 60 Bảng 3.15 Kết phân tích số mẫu bánh, kẹo, thạch 62 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phụ gia thực phẩm .2 1.1.1 Phụ gia thực phẩm ? .2 1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 1.1.3 Vai trò loại phụ gia thực phẩm 1.1.4 Ảnh hưởng phụ gia thực phẩm đến sức khỏe người .7 1.2 Giới thiệu phẩm màu thực phẩm 1.2.1 Định nghĩa .8 1.2.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm 1.2.3 Hiện trạng sử dụng phẩm màu thực phẩm 1.3 Tổng quan số phẩm màu thường sử dụng thực phẩm 1.3.2 Chỉ tiêu hàm lượng phẩm màu phép sử dụng thực phẩm 17 1.4 Các phương pháp xác định phẩm màu 19 1.4.1 Phương pháp định tính xác định phẩm màu không phép sử dụng 19 1.4.2 Phương pháp xác định phẩm màu phép sử dụng thực phẩm 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu 24 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Thiết bị 25 2.2.3 Dụng cụ 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tối ưu điều kiện xác định phẩm màu tổng hợp hệ thống HPLC 29 3.1.1 Lựa chọn detector 29 3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký 30 3.1.3 Tối ưu thành phần pha động 34 3.1.4 Lựa chọn thể tích bơm mẫu 41 3.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 43 3.2.1 Tối ưu dung môi loại chất béo 43 3.2.2 Tối ưu dung môi chiết mẫu 44 3.2.3 Tối ưu pH chiết mẫu 46 3.2.4 Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu 46 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 49 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 49 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 53 3.3.3 Độ lặp lại phương pháp 54 3.3.4 Độ thu hồi phương pháp 57 3.4 Kết phân tích mẫu thực 62 KẾT LUẬN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm việc bảo đảm để thực phẩm không gây hại đến sức khỏe, tính mạng người [5] An toàn thực phẩm vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, tiếp cận sử dụng với thực phẩm an toàn trở thành quyền người Hiện nay, với phát triển khoa học công nghệ đưa vào khâu sản xuất giúp tăng suất trồng vật nuôi cải thiện đời sống người.Trước đây, trình sản xuất, chế biến thực phẩm người biết cho thêm số chất vào thực phẩm để bảo quản, nâng cao chất lượng làm tăng tính hấp dẫn thực phẩm ướp muối, trộn thính, nhuộm màu thức ăn loại lá, củ, quả, hạt… chất thêm vào gọi phụ gia thực phẩm Phẩm màu thực phẩm số nhóm phụ gia thực phẩm sử dụng phổ biến Chúng bổ sung vào thực phẩm với mục đích tạo cho sản phẩm có màu sắc đẹp, tăng tính hấp dẫn người tiêu dùng, hoàn toàn không có giá trị mặt dinh dưỡng [5] Những thức ăn có chứa phẩm màu danh mục phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm Bộ Y tế, mức giới hạn dư lượng cho phép không gây ảnh hưởng độc hại cho sức khoẻ người tiêu dùng.Tuy nhiên, sử dụng phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm thời hạn sử dụng, danh mục phép sử dụng danh mục phép sử dụng vượt giới hạn cho phép, sử dụng hóa chất không rõ nguồn gốc, hóa chất bị cấm sử dụng hoạt động sản xuất, kinh doanh thực phẩm có hại đến sức khoẻ, có thể gây ngộ độc cấp tính, hậu sử dụng lâu dài tích luỹ cao có thể gây ung thư [5] Vì việc xác định hàm lượng loại phẩm màu thực phẩm có mặt loại thực phẩm vấn đề vô cấp thiết Đây lí chọn đề tài: “Tách định lượng đồng thời số phẩm màu thực phẩm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao( HPLC)” nhằm mục tiêu: Xây dựng phương pháp tách định lượng đồng thời số phẩm màu thực phẩm Áp dụng phương pháp để tách định lượng số phẩm màu số mẫu thực phẩm CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phụ gia thực phẩm 1.1.1 Phụ gia thực phẩm ? [5] Phụ gia thực phẩm chất chủ định đưa vào thực phẩm trình sản xuất, có không có giá trị dinh dưỡng, nhằm giữ cải thiện đặc tính thực phẩm 1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 1.1.2.1 Phân loại theo nhóm chức Các phụ gia thực phẩm có thể phân chia thành vài nhóm, có số phần chồng lẫn thể loại này.[11] Bảng 1.1: Phân nhóm, chức công nghệ qui định chất phụ gia TP TT Tên nhóm Chất điều vị Chất làm ẩm Chất tạo xốp Chất chống đông vón 10 Chất giữ màu Chất chống oxy hoá Chức công nghệ Qui định Làm tăng khơi dậy hương vị có QCVN 4-1:2010/BYT thực phẩm Bảo vệ thực phẩm khỏi bị khô làm giảm tác dụng môi trường khí QCVN 4-2:2010/BYT có độ ẩm thấp Một chất hỗn hợp chất sinh QCVN 4-3:2010/BYT khí làm tăng thể tích bột nhào Làm giảm khả kết dính QCVN 4-4:2010/BYT phân tử thực phẩm làm ổn định, trì làm tăng màu QCVN 4-5:2010/BYT sắc thực phẩm Kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm chống lại hư hỏng trình QCVN 4-6:2010/BYT oxy hoá gây ôi chua biến màu mỡ Chất chống tạo Ngăn cản làm giảm bọt QCVN 4-7:2010/BYT bọt Chất tổng Chất đường tạo vị hợp QCVN 4-8:2010/BYT cho thực phẩm Chất làm rắn Phẩm màu Tạo giữ mô rau cứng dòn tác động với chất tạo QCVN 4-9:2010/BYT keo để sinh hay củng cố thể keo Bổ sung khôi phục mầu QCVN 4-10:2010/BYT thực phẩm KẾT LUẬN Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu để xác định hàm lượng số phẩm màu số mẫu thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao thu kết sau: Đã tối ưu điều kiện sắc ký để tách định lượng đồng thời 10 phẩm màu: - Pha tĩnh: Cột Symmetry C18 - Waters (150mm × 4,6 mm × 5µm) tiền cột cột C18 (20mm × 3,9mm × 5µm) - Pha động: Chạy theo chương trình gradient nồng độ Kênh A: Dung dịch NaH2PO4 0,01M, Kênh B: MeOH - Tốc độ dòng: 1mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 µL - Nhiệt độ buồng cột: 400C - Detector PDA quét khoảng 200nm-800nm Đã tối ưu điều kiện xử lý mẫu để chiết phẩm màu khỏi mẫu thực phẩm: - Dung môi loại chấ t béo n-hexan - Dung môi chiết: dung môi I (NH3 0.1M : MeOH = 5:95) dung dịch amoniacetat 0.13M, sau đó điều chỉnh pH= axit HCl 6N - Nhiệt độ chiết: 600 Đã thẩm định phương pháp xác định phẩm màu: - Đường chuẩn xây dụng khoảng tuyến tính từ 0.1ppm - 10ppm với hệ số tương quan R2>0.999 cho tất chất - Giới hạn phát phương pháp khoảng 0.10-0.25 mg/kg giới hạn định lượng phương pháp tương ứng từ 0.34-0.79 mg/kg - Độ lặp lại RSD