Tách dòng và giải trình tự Gene mã hóa Enzyme Nattokinase từ B. subtilis.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - -

PHẠM THẾ ANH

Tên đề tài:

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE MÃ HOÁ ENZYME

NATTOKINASE TỪ BACILLUS SUBTILIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Thái Nguyên - 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - -

PHẠM THẾ ANH

Tên đề tài:

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE MÃ HOÁ ENZYME

NATTOKINASE TỪ BACILLUS SUBTILIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy

cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường – Trưởng Bộ

môn Công nghệ sinh học Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –

Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Th.S Ma Thị Trang, Cán bộ tại Bộ môn

Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện để tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Phạm Thế Anh

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHOÁ LUẬN

Trang

Bảng 1: Đặc điểm của Nattokinase (Kim, Gum et al 2008) 4

Bảng 2: Cặp mồi sử dụng nhân gene aprE 13

Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 16

Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR 20

Bảng 5: Thành phần phản ứng gắn nối 23

Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt với HindIII và EcoRI 26

Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt với BamHI và SacI 26

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHOÁ LUẬN

Trang

Hình 1: Sản phẩm natto sau khi lên men 3

Hình 2: Sơ đồ hoá quy trình lên men dịch thể Nattokinase 8

Hình 3: Cấu trúc vector pTUAF 15

Hình 4: Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis 18

Hình 5: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 21

Hình 6: Hình ảnh tách chiết DNA tổng số của B subtilis 28

Hình 7: Sản phẩm PCR gene aprE từ B subtilis 28

Hình 8: Sản phẩm PCR trước và sau khi tinh sạch 29

Hình 9: Đĩa chứa khuẩn lạc mang plasmid nghi ngờ mang đoạn xen 30

Hình 10: Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn 31

Hình 11: PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc nghi ngờ 32

Hình 12: Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn 33

Hình 13: Trình tự gene aprE 34

Hình 15: Sắc ký đồ một số điểm sai khác 37

Hình 16: Dịch mã trình tự gene aprE 38

Hình 17: So sánh trình tự peptide 39

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

E coli Escherichia coli

chuỗi trùng hợp

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn gốc thực vật của Nattokinase 3

2.2 Đặc điểm, cấu trúc của Nattokinase 4

2.2.1 Đặc điểm 4

2.2.2 Cấu trúc phân tử Nattokinase 4

2.3 Hoạt tính của Nattokinase 4

2.3.1 Hoạt tính 4

2.3.2 So sánh các tác nhân tiêu sợi 5

2.4 Tác dụng của Nattokinase 6

2.4.1 Khả năng làm tam cục máu đông 6

2.4.2 Đề phòng , hỗ trợ các bệnh liên quan đến tim mạch 7

2.4.3 Giảm huyết áp, giúp lưu thông máu 7

2.4.4 Các lợi ích khác 8

2.5 Các phương pháp sản xuất Nattokinase 8

2.5.1 Phương pháp lên men dịch thể 8

2.5.2 Phương pháp sản xuất từ vi sinh vật 9

2.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase trong và ngoài nước 10

2.6.1 Trên thế giới 10

2.6.2 Tình hình trong nước 11

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Vật liệu nghiên cứu 12

3.1.1 Vi khuẩn B subtilis 12

3.1.2 Hóa chất 12

3.1.3 Vật liệu 13

3.1.4 Thiết bị sử dụng 16

3.2 Địa điểm và thời gian thực tập 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 17

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Quy trình tách dòng, xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis 18

3.4.2 Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc 19

3.4.3 Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn 19

3.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 19

3.4.5 Phương pháp PCR 20

3.4.6 Điện di sản phẩm trên gel agarose 21

3.4.7 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel 22

3.4.8 Phương pháp gắn nối gene đã khuếch đại vào vetor tách dòng pTUAF 23

3.4.9 Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α 24

3.4.10 Phương pháp tách chiết DNA plasmid bằng bộ Kit thương mại 24

3.4.11 Phương pháp cắt kiểm tra các dòng plasmid với enzyme cắt giới hạn 26

3.4.12 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của Sanger và các cộng sự 26

3.4.13 Phương pháp so sánh trình tự gene aprE đã tách dòng với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene thế giới – Ngân hàng Gen bank 27

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn B subtilis 28

4.2 Kết quả nhân gene aprE từ vi khuẩn B subtilis bằng phương pháp PCR 28

4.3 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel agarose 29

4.4 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối 30

4.5 Kết quả chọn lọc dòng 31

4.5.1 Kết quả sàng lọc dòng bằng điện di so sánh kích thước plasmid 31

4.5.2 Kết quả chọn lọc dòng bằng PCR 32

4.5.3 Kết quả chọn lọc dòng plasmid bằng lập bản đồ giới hạn 32

4.6 Kết quả giải trình tự gene 34

4.6.1 Kết quả phân tích các thành phần của gene aprE sau khi giải trình tự 34

4.6.2 Kết quả dịch mã của gene aprE 38

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Tài liệu trong nước 41

Tài liệu nước ngoài 41

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Hiện nay, trên thế giới mỗi năm, có hàng triệu bệnh nhân tử vong do các bệnh liên quan đến tim mạch và huyết áp Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu người tử vong do bệnh lý tim mạch Tại Việt Nam, theo PGS.TS Phạm Nguyễn Vinh (Phó chủ tịch Hội Tim mạch TP.HCM), hiện nước ta có khoảng 10 triệu người mắc bệnh tăng huyết áp Nguyên nhân chủ yếu đó là sự tắc nghẽn mạch máu mà tác nhân chính là việc hình thành các cục máu đông hay còn gọi là sự tăng sợi huyết Điều này đặt ra thách thức lớn cho không chỉ ngành Y tế mà còn là một áp lực không nhỏ đối với những ngành khoa học khác, trong đó có công nghệ sinh học

Nattokinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hiệu quả trong các loại enzyme hoạt huyết, gấp 4 lần Plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông, đồng thời an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống (Yanagisawa, Chatake et al 2010)

Từ trước đến nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên

men bán rắn chủng B subtilis trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể

(Sumi, Hamada et al 1987) Thực tế, Nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định Vì thực nghiệm

đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong tự nhiên ở B subtilis khá phức tạp

và chỉ đạt mức độ giới hạn Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa.Tuy nhiên các quy trình công nghệ này ít được công bố (Nguyen Sle, Quyen et al 2014) Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc và Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng Do vậy, việc tìm hiểu, thu nhận nguồn gen

mã hóa Nattokinase từ các chủng B subtilis, xây dựng, phát triển hệ thống tái tổ

hợp là cách tiếp cận mới mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức

năng Nattokinase được mã hóa bởi gen aprE có trong hệ genenome của chủng vi

B subtilis tôi sử dụng E coli DH5α để tạo dòng tái tổ hợp sản xuất Nattokinase Sản

độ an toàn như Nattokinase lên men tự nhiên

Trong nước, các doanh nghiệp dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản, giá thành khá cao Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hướng của nhiều công ty Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tôi thực hiện đề tài:

“Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme Nattokinase từ B subtilis” nhằm

mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản

xuất Nattokinase tái tổ hợp, trước tiên là tạo chủng E coli tái tổ hợp

1.2 Mục tiêu đề tài

- Phân lập gene aprE từ vi khuẩn B subtilis

- Xác định trình tự gene aprE đã phân lập và so sánh với trình tự trên ngân

hàng gene (Gene bank)

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Nắm được các nguyên lý, kĩ thuật và các phương pháp thực hiện trong quá trình phân tích

- Thành thạo các thao tác và thực hiện được quy trình phân lập, tách dòng gene

- Nắm được phương pháp nghiên cứu cấu trúc và trình tự gene

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu kế tiếp có liên quan đến việc sản xuất Nattokinase sau này

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất

Nattokinase trên quy mô công nghiệp, rút ngắn thời gian sản xuất

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc thực vật của Nattokinase

Trong nhiều nghiên cứu về ngồn gốc của Natto đã chỉ ra rằng Natto bắt đầu

mô ̣t tuần Mô ̣t loa ̣i vi khuẩn có sẵn trong rơm giúp cho quá trình lên men đâ ̣u tươ ng

mô ̣t cách tự nhiên và ta ̣o ra natto Phương pháp hiê ̣n đa ̣i chỉ mới được phát hiện lần đầu tiên ở Sendai bằng cách tiêm vi khuẩn giống tinh khiết vào đâ ̣u tương (Elahi, Choi et al 2015)

Ngày nay, natto đã phổ biến ta ̣i Nhâ ̣t Thông thường nó được bán ta ̣i các cửa hiê ̣u ta ̣p hóa trong các túi nilon Ở Nhật, natto được sử du ̣ng dưới một số dạng như trô ̣n với lúa mì , cải bắp, trứng hoă ̣c trô ̣n salát, hoặc như mô ̣t loa ̣i gia vi ̣ Trong một

thử nghiê ̣m kiểm chứng , natto được chuẩn bi ̣ bằng cách bổ sung B subtilis vào đậu

tương hấp chín cho vào trong túi nylon rồi để hỗn hợp lên men trong 24 giờ ở 37ºC

phẩm (Sumi 1999)

Hình 1: Sản phẩm natto sau khi lên men

2.2 Đặc điểm, cấu trúc của Nattokinase

2.2.1 Đặc điểm

Bảng 1: Đặc điểm của Nattokinase (Kim, Gum et al 2008)

Bacillaceae › Bacillus

2.2.2.Cấu trúc phân tử Nattokinase

Enzyme Nattokinase có tính tương đồng cao với các enzyme subtilisin ở mức

độ trình tự trên 99% Cấu trúc của Nattokinase có đặc điểm cấu hình linh hoạt phù hợp với việc tác động lên cấu trúc fibrin, một tác nhân làm đông máu trong cơ thể

(Suzuki, Kondo et al 2003), (Tai and Sweet 2006)

2.3 Hoạt tính của Nattokinase

Cục máu đông có thể hình thành trong động mạch, tĩnh mạch, hoặc trong các buồng tim Cục máu đông trong tĩnh mạch hình thành trong điều kiện dòng chảy thấp, bao gồm chủ yếu của các tế bào máu với vài tiểu cầu và chứa một lượng lớn các sợi fibrin xen kẽ Các khối huyết này có thể vẫn còn tồn tại trong mạch máu Tuy nhiên, cục máu đông cũng có thể di chuyển hoặc bất đô ̣ng Nếu cục máu

phổi.Tương tự như vậy , nếu một cục máu đông di chuyển từ tim hoặc động mạch cảnh lên não, nó gây ra đột quỵ Và, cuối cùng, nếu cục máu đông di chuyển từ một

vị trí đến bi ̣t kín động mạch vành, nó gây ra một cơn đau tim

enzym huyết khối làm tan các cục máu đông được tạo ra trong các tế bào nội

lại và máu dễ bị làm đông hơn Tuy nhiên, cục máu đông có thể hình thành ở bất cứ

độ tuổi nào Vì vậy, viê ̣c phòng ngừa nên đươc ưu tiên ngay cả đối với những người trẻ tuổi và việc sử dụng một sản phẩm có chứa thành phần Nattokinase để phòng ngừa sẽ giúp hõ trợ một phần cho việc phòng ngừa và điều trị Đáng chú ý, fibrinolysis (hiệu ứng sinh lý chính của Nattokinase) là một quá trình sinh lý tự nhiên Fibrin, một thành phần làm đông máu nhanh được thủy phân thành các sản phẩm an toàn hơn cho hệ mạch trong quá trình fib rinolysis Khi fibrin bi ̣ thủy phân , thời gian đông máu chậm lại Nattokinase thủy phân sợi tơ

bởi Nattokinase Bằng cách làm giảm sự hình thành huyết khối, Nattokinase giảm tốc độ tiến triển của sự hình thành mảng bám và hạn chế việc làm tổn thương động mạch (Toki, Sumi et al 1985)

2.3.2 So sánh các tác nhân tiêu sợi

2.3.2.1 Urokinase

Trong bệnh viện, Urokinase được thường được sử dụng như là một enzyme

tiêu sợi huyết để xử lý các cục máu đông buồng tim tâm nhĩ , trong cơn đau tim và

đột quỵ do nghẽn ma ̣ch Nó được chỉ định để hòa tan huyết khối trong tim, mạch

máu, hoặc phổi Urokinase có chi phí giá thành cao hơn so với Nattokinase nhưng

hoạt lực cũng chỉ tương đương với hiệu quả của 100 gam Natto Nattokinase duy trì

hoạt động trong thời gian 4-6 giờ, thời gian tác du ̣ ng lâu hơn so với Urokinase

2.3.2.2 Streptokinase

Đây cũng là một enzyme được sử dụng như một tác nhân tan huyết khối trong

các trường hợp chăm sóc khẩn cấp Nó có giá thành thấp hơn so với Urokinase

trong mỗi lần điều trị Streptokinase được chỉ định để điều trị nhồi máu cơ tim sớm,

đặc biệt là nhồi máu cơ tim cấp tính trong vòng 6 giờ trước khi bắt đầu đau đớn dẫn

đến nhập viện

2.3.2.3 Bromelain

Bromelain được sử dụng như một nhân tố tham gia vào quá trình chống đông

máu hiệu quả có khả năng hoạt hóa trong quá trình fibrinolysis thông qua việc

kích thích sản xuất plasmin Vì nattokinase ức chế fibrin hiệu quả hơn plasmin

trong thử nghiê ̣m In -vitro nên nattokinase là một tác nhân tiêu sợi huyết ma ̣nh hơn

nhiều so với bromelain

2.3.2.4 Tỏi

và giảm fibrinogen và fibrinopeptide đến 10% (Mansell and Reckless 1991)

2.3.2.5 Nhân sâm

Từ các so sánh trên, có thể Nattokinae có hoạt tính tác động mạnh hơn và có

tác dụng lâu hơn, điều đó nâng cao khả năng điều trị cho các bệnh nhân mắc các

bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch hoặc suy tim do nguyên nhân bị hình thành các

cục máu đông

2.4 Tác dụng của Nattokinase

2.4.1 Khả năng làm tan cục máu đông

nghiệm đầu tiên trên người tiến hành với 12 tình nguyện viên khỏe mạnh người Nhật Bản Mỗi người tham gia sử du ̣ng 200 g Natto một lần mỗi ngày trước bữa ăn sáng, tiếp theo là kiểm tra định kỳ lượng plasmin trong máu Sau một khoảng thời

kiểm tra định kỳ plasmin trong máu Chỉ có một biế n đổi nhỏ trong kết quả của

nhóm kiểm chứng là những người ăn đậu nành luộc Ngược lại, nhóm ăn natto cho thấy thời gian thủy phân fibrin (euglobulin lysis time-ELT) giảm đáng kể và hoạt độ enzyme tiêu sợi huyết tăng sau khi sử du ̣ng natto (Sumi, Hamada et al 1990)

hiện diện của chất chống huyết áp cao của natto (Okamoto, Hanagata et al 1995) Trong nghiên cứu này nhỏ , Natto đông khô đươ ̣c chiết bằng ethanol 80% rồi cho 5 tình nguyện viên sử du ̣ng Có 4 trong 5 đối tượng, huyết áp tâm thu trung bình giảm

từ 173,8 ± 20,5 mm Hg thành 154,8 ± 12,6 mm Hg và huyết áp tâm trương giảm từ 101,0 ± 11,4 mm Hg đến 91,2 ± 6,6 mm Hg

2.4.2 Đề phòng, hỗ trợ các bệnh liên quan đến tim mạch

Nattokinase làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông) Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phá tan sợi fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin này Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông Nattokinase cũng giúp tăng cường lượng plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase

2.4.3 Giảm huyết áp, giúp lưu thông máu

Nattokinase làm giảm huyết áp Người Nhật đã sử dụng đậu tương lên men

đã khá lâu vì mục đích này Các nghiên cứu chỉ ra rằng nó làm giảm huyết áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE) ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao Nattokinase có khả năng ức chế ACE, trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ bù trừ trong tuần hoàn Nó cũng được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch

2.4.4 Các lợi ích khác

Làm chắc xương, hỗ trợ điều trị đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn, bệnh lị Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và giảm trí nhớ Lợi ích từ Nattokinase có thể hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh trên hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho những người bệnh này

2.5 Các phương pháp sản xuất Nattokinase

2.5.1 Phương pháp lên men dịch thể

Hình 2: Sơ đồ hoá quy trình lên men dịch thể Nattokinase

Lựa chọn nguyên liệu Đậu tương

Rửa sạch

Cho vào khay chứa

Lên men 12 – 24 giờ ở

Thuyết minh tổng quát phương pháp

- Lựa chọn nguyên liệu: Chọn những hạt đậu tương khô dồng đều, không sauu bệnh, không bị nhiễm nấm mốc

- Rửa sạch: Mục đích là để lại bỏ tạp chất, loại bỏ một số vi sinh vật bám trên hạt đậu tương Quá trình rửa hoàn toàn bằng nước lạnh

- Ngâm: Hạt đậu được ngâm trong nước lạnh trong vòng 12-20 giờ, nhằm làm

tăng kích thước hạt, làm cho hạt nở ra

Mục đích là để làm chín nguyên liệu, tiêu diệt vi sinh vật không có lợi trong

quá trình sản xuất

- Trộn giống Natto: Công thức phối trộn như sau: 250 gram đậu tương + một

nửa muỗng cafe bột natto + 2 muỗng canh nước + hỗn hợp nước muối đường

- Cho vào khay chứa: Vật liệu nuôi cấy có thể lên khay ( phương pháp của người Nhật Bản hay sử dụng), cấy trên rơm hoặc lá chuối ( Thái Lan)…

ngày sau đó được làm lạnh và cho vào tủ lạnh khoảng một tuần để Natto phát

triển và sinh sợ nhớt

- Để chín: Sau giai đoạn lên men ta đã có được sản phẩm Natto có chứa

enzyme rất quý, đó là Nattokinase

2.5.2 Phương pháp sản xuất từ vi sinh vật

Vi sinh vật với tốc độ tăng trưởng nhanh chóng và dễ chịu tác động di truyền phân tử là mục tiêu lý tưởng cho công nghệ sinh học và có thể được lựa chọn cho khả năng phát triển để sản xuất Nattokinase Nattokinase sản xuất từ phương pháp

vi sinh vật được coi là an toàn và hàm lượng các chỉ số dinh dưỡng giống như Nattokinase tự nhiên

E coli là một vi khuẩn Gram âm, hình que dài khoảng 2.5μm, có roi

(flagella) và bộ gene gồm 4639221 cặp base mã hóa ít nhất cho 4406 gene Giống

như tất cả các vi khuẩn Gram âm khác, E coli không có màng nhân và nhiễm sắc

thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí

khởi đầu sao chép (origin of replication) E coli là loài được chọn trong các phòng

thí nghiệm về sinh học phân tử bởi vì dễ nuôi cấy, bộ gene đơn giản và đã được giải trình tự khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo sản phẩm gene cao

từ 50 mg/l đến 500 mg/l Các tế bào E coli có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid

DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay

các phức hợp màu như Xgal –β –galactosidase

Hơn nữa, E coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền đã được công

bố rõ ràng, an toàn và dễ thao tác, rất phù hợp với mục đích của đề tài nghiên cứu

Từ việc tách dòng thành công gene mã hoá cho enzyme Nattokinase là aprE vật liệu này sẽ được sử dụng để tạo ra enzyme Nattokinase thông qua sự tạo thành sản phẩm nhờ của các vector biểu vi khuẩn E coli

2.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase trong và ngoài nước

2.6.1 Trên thế giới

Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khám phá ra Nattokinase vào năm 1980 trong khi tiến hành nghiên cứu tại Đại học Chicago Năm 1995, các nhà nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh học và JCR Pharmaceuticals của Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm hiệu quả của Nattokinase trong việc giảm huyết khối động mạch cảnh trên chuột Một số chuột được tiêm huyết khối ở động mạch cảnh, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho não Ba enzym là Nattokinase, plasmin và elastase được dùng

để thử nghiệm trên chuột Elastase cho thấy không mở được các động mạch bị chặn

Nhóm ăn Plasmin cho thấy lưu thông phục hồi 16% sau một giờ Còn nhóm ăn Nattokinase cho thấy phục hồi 62% lưu thông trong cùng khoảng thời gian Kết quả này giúp nhà nghiên cứu kết luận rằng khả năng tiêu fibrin của Nattokinase là mạnh

hơn so với plasmin hoặc elastase trong cơ thể (Chan, Fan et al 2000)

Cũng trong năm 1995, các nhà nghiên cứu từ Trường y khoa Miyazaki Kurashiki và Đại học Khoa học và Nghệ thuật tại Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của Nattokinase với huyết áp ở cả động vật và con người Trong các thử nghiệm

chuột được cho uống một liều duy nhất 400 - 450 gam Nattokinase Tính trung bình huyết áp tâm thu (SBP) của chuột giảm 12,7% trong 2 giờ

lyophilized trích xuất (tương đương 100 g natto) Trung bình huyết áp tâm thu SBP giảm 10,9% và huyết áp tâm trương (DBP) giảm 9,7%

điều trị sự tổn thương nội mạc động mạch đùi ở chuột

Tóm lại, Nattokinase là chủ đề của ít nhất 17 nghiên cứu từ năm 1986 Hoạt tính của Fibrinolytic đã được xác đi ̣nh là khá tốt trong các cuộc thử nghiệm

2.6.2 Tình hình trong nước

Ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu và công bố nhiều công

trình về Nattokinae khác nhau chủ yếu tập trung vào các mảng nội dung như tối ưu

hoá quy trình sản xuất và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất Nattokinse

(Nguyen Sle, Quyen et al 2014) Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sản xuất Nattokinase hiệu suất cao (Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong,

Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương) Tăng cường biểu hiện tiết và khả năng sản xuất từ các chủng vi sinh vật phân lập được trên sản phẩm Nattokinase thương mại (Hoàng Thị Khánh Hồng) Bước đầu nghiên cứu chiết tách và đánh giá khả năng tiêu fibrin từ đậu tương lên men ( Nguyễn Thị Lập, Nguyễn Thị Loan)…

Trong những năm trở lại đây, người tiêu dùng trong nước cũng đã chu ý và quan tâm hơn đến các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên tốt cho sức khoẻ, đặc biệt là các sản phẩm tốt cho tim mạch và vận động Các sản phẩm có chứa Nattokinase vì thế mà cũng được ưa chuộng không chỉ bởi tính tiện lợi mà còn vì sự an toàn mà nó mang lại Tuy nhiên, những sản phẩm này lại có giá thành khá cao so với mặt bằng chung của đại đa số người tiêu dùng Vì thế câu hỏi đặt ra là làm thế nào để một sản phẩm tốt như Nattokinase đến được nhiều hơn với người tiêu dùng với mức giá cạnh tranh sẽ là hướng đi đúng đắn và là cơ hội mới hứa hẹn của các nhà khoa học trong tương lai

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vi khuẩn B subtilis

Chủng vi khuẩn B subtilis sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Bộ

môn Công nghệ vi sinh và Sinh thái môi trường, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên

 Hoá chất dùng cho phản ứng gắn nối gene vào vector tách dòng

Bộ kit Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit các thành phần bao gồm:

+ 10X Ligation Buffer

+ T4 DNA Ligase

+ Nước khử ion

+ Vector pTUAF

 Hóa chất cho biến nạp và chọn lọc khuẩn lạc

- Môi trường LB lỏng và LB-Agar- Amp- Xgal- IPTG

+ Kháng sinh Ampicilin 100mg/ml

+ X- gal stock solution (20mg/ml)

Cân 0,2g X-gal (5- bromo -4-Chloro -3 –indolyl- β- D- galactopyramoside) vào

+ IPTG 100mM

Cân 1,2 g IPTG (isopropyl- β- D- thiogalactopyranmoside) vào 50 ml nước

C

 Hoá chất tách chiết DNA plasmid

Sử dụng bộ kit Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit để tách chiết DNA plasmid

 Enzyme giới hạn: SacI, HindIII, BamHI, EcoRI của hãng Thermo Scientific

3.1.3 Vật liệu

3.1.3.1 Mồi phản ứng PCR

Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân gene aprE Trình tự mồi được

thiết kế dựa vào trình tự gene đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI

Bảng 2: Cặp mồi sử dụng nhân gene aprE

Tên

Enzyme thiết kế

Chiều dài đoạn gene

Trình tự của mồi được thiết kế gồm hai phần chính:

- Phần thứ nhất là đầu treo của mồi (ở đầu 5’) không bắt cặp với trình tự gene đích trong hệ gene, đầu treo bao gồm một số thành phần được thêm vào để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, phần treo bao gồm:

+ Một nucleotide được thêm vào phía ngoài cùng ở đầu 5’để bảo vệ vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn khỏi các tác động có thể làm thay đổi trình tự này

+ Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn (phần chữ đậm gạch chân) ở phía

vụ cho công việc gắn nối gene aprE vào vector biểu hiện

- Phần thứ hai là phần bắt cặp đặc hiệu với hai đầu của gene aprE trong hệ gene của vi khuẩn B subtilis nằm ở đầu 3’, trong đó bao gồm cả 3 nucleotide bổ

chính xác trình tự của gene aprE từ hệ gene của vi khuẩn B subtilis

3.1.3.2 Vector tách dòng pTUAF

Vector pTUAF là vector tách dòng TA, đã được thiết kế thành công dựa trên vector thương mại pTZ57R/T có kích thước 2886 bp, thiết kế dựa vào hoạt tính terminal transferase cuả enzyme Taq- DNA polymerase trong phản ứng PCR Nó bổ sung một nucleotide A (Adenosine) vào đầu 3’ của mạch tổng hợp trong sản phẩm khuếch đại Vector pTUAF có đầu dính là một nucleotide T (Thymine), cho phép tách dòng tất cả các trình tự khuếch đại của phản ứng PCR do enzyme Taq- DNA polymerase tổng hợp

Trong cấu trúc của vector pTUAF bao gồm hai hệ thống chọn lọc, cho phép chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid đã gắn xen trình tự đích thành công Hệ thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa cho enzyme phân giải kháng sinh ampicilin (Amp resistant gene), điều này đồng nghĩa với việc các tế bào mang vector pTUAF có thể sống sót và phát triển trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị màu Lac-

operon, hệ thống này bao gồm gene LacZ mã hóa cho enzyme β –galactosidase và Lac-promoter cảm ứng bởi IPTG Vị trí của gene LacZ được thiết kế sao cho bao

gồm vị trí gắn xen, thiết kế này có ý nghĩa quan trọng trong chọn lọc, cho phép phân biệt các dòng tế bào mang vector có hoặc không có đoạn xen Với các tế bào

chủ mang vector pTUAF tự đóng vòng hay không có sự gắn đoạn xen xảy ra , operon hoạt động bình thường Trong môi trường có IPTG Lac-promoter sẽ được kích hoạt quá trình phiên mã xảy ra, sau đó là quá trình dịch mã tổng hợp enzyme β -galactosidase Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X –gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này có màu xanh Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon bị phá vỡ do gắn xen thành công, dẫn đến enzyme β –galactosidase không được tổng hợp, không có sự phân giải cơ chất X –gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng Các khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc

Lac-mong muốn trong chọn lọc dòng

Trong vị trí của Lac –operon còn có vị trí đa tách dòng bao gồm các vị trí

cắt của enzyme cắt giới hạn: EcoRI, Ecl136II, SacI, Acc65I, KpnI, Bsp68I,

Mva1269I, Mph1103I, Xbal, BamHI, Cfr9I, Eco88I, SmaI, ApaI, Bsp120I, HincII, SalI, XmiI, PstI, AlfI, Eco147I, PaeI, HindIII Chúng tôi quan tâm đến vị trí cắt của enzyme SacI, BamHI nằm ở sát hai đầu của vị trí gắn xen và enzyme HindIII, do đó trong đề tài

này chúng tôi sử dụng ba enzyme này để kiểm tra đoạn xen trong vector tách dòng

Hình 3: Cấu trúc vector pTUAF

Chú giải

Tên gọi pTUAF được đặt theo tên tiếng Anh của Trường Đại học Nông lâm

Thái Nguyên (Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry) Trong đó, ký hiệu đầu tiên, chữ p, là ký hiệu của plasmid theo quy tắc quốc tế Chữ T trong cụm

từ TUAF vừa có ý nghĩa là T-vector vừa trùng với chữ cái đầu tiên trong cụm từ

viết tắt của Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

3.1.4 Thiết bị sử dụng

Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

3.2 Địa điểm và thời gian thực tập

Địa điểm: Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gene, Viện khoa học sự

sống, Đại học Thái Nguyên

Thời gian : Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2014 - 6/2015

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập gene aprE bằng PCR

- Khuếch đại gene aprE từ hệ gene của vi khuẩn B.subtilis bằng phản ứng PCR sử

dụng cặp mồi đặc hiệu

Nội dung 2: Tạo dòng gene aprE

- Gắn gene vào vector tách dòng pTUAF bằng enzyme T4 - DNA ligase

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E coli DH5α khả biến

- Tách chiết DNA plasmid

- Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

Nội dung 3: Xác định trình tự gene aprE đã tách dòng

- Giải trình tự gene aprE đã tách dòng trên máy giải trình tự tự động Applied

Biosystems

- So sánh thành phần thiết yếu của trình tự gene aprE đã giải trình tự với thiết kế

- Phân tích kết quả dịch mã của đoạn gene đã giải trình tự

- So sánh trình tự gene aprE đã tách dòng với trình tự đã công bố trên ngân hàng

gene NCBI (Gene bank) thông qua chương trình Blast

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Quy trình tách dòng, xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis

Hình 4: Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis

Cặn tế bào B subtilis

PCR

pTUAF Gắn nối

Các dòng khuẩn lạc trắng