Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÀN THỊ NGÂN Tên đề tài: “ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT Thermococcus kodakarensis KOD1” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Công nghệ Sinh học : CNSH- CNTP : 2012- 2016 Thái Nguyên- Năm 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÀN THỊ NGÂN Tên đề tài: “ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT Thermococcus kodakarensis KOD1” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH- CNTP Khóa học : 2012- 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phạm Bằng Phƣơng Thái Nguyên- Năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Được trí Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm thời gian thực đề tài tốt nghiệp em thực đề tài: “ Nghiên cứu khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” Qua sáu tháng thực tập phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên em thu kết thiết thực phục vụ cho việc hoàn thành đề tài tốt nghiệp Để đạt kết em xin chân thành cảm ơn chị Ma Thị Hoàn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực tập tốt nghiêp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Bằng Phƣơng, môn Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên tận tình bảo, hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ủng hộ,giúp đỡ động viên em suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có hạn nên tránh khỏi sai sót, em mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Bàn Thị Ngân ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 : Danh mục thiết bị 18 Bảng 3.2 : Thành phần môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 19 Bảng 3.3: Một số thành phần khoáng sử dụng nuôi cấy 21 Bảng 3.4: Thành phần số vitamin sử dụng trình nuôi cấy 22 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR .28 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 Hình 2.4: Cấu tạo hóa học aminopeptidase 12 Hình 2.5 : Kiểm tra so sánh trình tự protein gen Tk 1178 với số trình tự khác ngân hàng liệu NCBI 14 Hình 3.1 : Màu sắc môi trường thay đổi bổ sung thêm lưu huỳnh .20 Hình 3.2 : Môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 sau bổ sung lưu huỳnh hấp khử trùng dòng ni tơ 20 Hình 3.3 : Trình tự gen tk1178 trang NCBI 25 Hình 3.4 : Bản đồ enzyme cắt giới hạn gen Tk1178 26 Hình 3.5 : Kết kiểm tra trình tự đoạn mồi dựa chương trình Tm Calculator 27 Hình 3.6: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk 1178 29 Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra DNA genome 32 Hình 4.2 : Kết so sánh trình tự protein gen TK1178 với số gen thuộc giới Achaea .33 Hình 4.3: Kết khuếch đại đoạn gen Tk1178 điều kiện nhiệt độ tối ưu 34 Hình 4.4: Mức nhiệt độ tương ứng với thứ tự giếng 35 Hình 4.5 : Kết điện điện di sản phẩm PCR đoạn gen Tk1178 mức nhiệt độ khác .35 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Ý nghĩa từ, cụm từ viết tắt Các từ, cụm từ viết tắt Dal Dalton DNA Deoxyribonucleic acide dNTPs Deoxynucleotide trytophate Bp Base pair Kb Kilobase PCR Polymerase chain reaction EDTA Etilenduamin tetraacetic acide TE Tris- EDTA TK Thermococcus kodakarensis IPTG Isopropyl- β- D- Thiogalactopyranosidase SDS Sodium dodecyl sulfate NCBI National center for biotechnology infor mation TAE Tris- acetate- EDTA v MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề .1 1.2.Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3.Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 Tổng quan vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 .4 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc 2.1.1.2 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm chung cho phát triển tồn .6 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.2 Đặc điểm enzyme aminopeptidase gen Tk1178 tổng hợp .10 2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa ứng dụng 10 2.2.1.1 Enzyme 10 2.2.1.2 Khái niệm, phân loại đặc tính ứng dụng protease 11 2.2.1.3 Ý nghĩa ứng dụng 12 2.2.2 Protease Tk1178 .13 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1.Đối tượng nghiên cứu 16 3.2.Nội dung nghiên cứu 16 3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 16 3.2.2 Nội dung 2: So sánh trình tự protein gen Tk1178 với số trình tự protein khác họ 16 vi 3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 16 3.2.4 Nội dung 4: Kiểm tra ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến khuếch đại đoạn gen Tk 1178 16 3.3.1.Hóa chất 16 3.3.2.Thiết bị, dụng cụ 16 3.4.Phương pháp 17 3.4.1.Phương pháp nuôi cấy 17 3.4.2.Phương pháp tách chiết DNA genome .21 3.4.3.Phương pháp điện di 22 3.4.4 Phương pháp PCR 23 3.4.4.1.Thiết kế mồi cho gen Tk1178 .23 3.4.4.2.Tiến hành PCR 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 4.1.Kết tách chiết DNA genmome vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 29 4.2.Kết so sánh trình tự protein Tk1178 với số protein gen khác giới Archaea 30 4.3.Kết khuếch đại đoạn gen Tk1178 kỹ thuật PCR 33 4.4.Kết kiểm tra ảnh hưởng nhiệt độ tới khuếch đại gen Tk1178 34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1.Kết luận .36 5.2.Kiến nghị .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 chủng vi khuẩn thuộc giới vi khuẩn cố Archea đươc nhà khoa học phân lập từ miệng núi lửa gần bờ biển thuộc đảo Kodakara Nhật Bản, có khả sống điều kiện nhiêt độ từ 60100 0C ( tối ưu 85 0C ) khả sống dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu 5,5 ) [7] Theo phân loại ( Hình 2.2 ) trình tự 16s rRNA quết định phân loại khác loài theo Thermococcales, nghiên cứu cho thấy KOD1 có trình tự 16s RNA thành viên chi Thermococcus, nghiên cứu trình tự 16S DNA ribosome dẫn đến khả phân loại khác bao gồm Thermococcus peptonophilus Thermococcus , kết lai DNA- DNA khác biệt đặc tính phát triển với việc sử dụng chất để phân lập chủng KOD1 từ T peptonophilus T stetteri mức độ loài trình tự KOD1 đại diện cho loài Thermococcus, mà biết đến Thermococcus kodakaraensis KOD1 sp [10] Hệ gen KOD1 có hai nghìn đoạn gen khác ( 2434 gen ) có đoạn gen Tk1178 có khả mã hóa cho enzyme aminopeptidase, nhà khoa học trường đại học Khoa Hóa tổng hợp sinh học Hóa học, Trường Đại Học Kỹ thuật, Đại học Kyoto, Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, Nhật Bản Cục Chất liệu Khoa học đời sống, trường Kỹ thuật, Đại học Osaka, Yamadaoka, Suita, Osaka, Nhật Bản công bố cụ thể trang NCBI [7] Aminopepdidase enzyme xúc tác phân cắt axit amin từ amino protein hay peptide Chúng có mặt động vật thực vật tìm thấy nhiều bào quan tế bào, bào tương, thành phần màng tế bào Một số aminopeptidases monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp tiêu hóa enzyme protein đóng vai trò vô quan trọng khả bền với nhiệt độ cao khó bị biến tính enzyme khác lại biến tính nhanh thay đổi nhiệt độ lên mức cao, dễ tham gia phản ứng ứng dụng nhiều công nghiệp lĩnh vực nghiên cứu khoa học [6] Chính ứng dụng quan trọng enzyme nên ngày có nhiều công trình nghiên cứu enzyme khả tổng hợp enzyme từ sinh vật ( động vật, thực vật vi sinh vật ) [4] Đoạn gen Tk 1178 vi khuẩn Thermococcus korakadensis KOD1 (T korakadensis ) có khả mã hóa enzyme aminopeptidase, ứng dụng nhiều công nghiệp sản xuất thực phẩm ( sản xuất bột giặt, loại bánh mỳ…), y học…Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp tai phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, hướng dẫn TS Phạm Bằng Phƣơng, thực đề tài “ Nghiên cứu khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” với mục tiêu khuếch đại đoạn gen tìm nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại- phản ứng PCR, phục vụ cho nghiên cứu tạo dòng, tinh kiểm tra hoạt tính enzyme gen Tk1178 mã hóa 1.2.Mục tiêu yêu cầu đề tài - Mục tiêu : + Nghiên cứu đặc điểm protein gen Tk1178 + Khuếch đại đoạn gen TK1178 từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 -Yêu cầu : + Nghiên cứu, nắm bắt đặc điểm vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 gen TK1178 + Khuếch đại đoạn gen TK1178 kỹ thuật PCR + So sánh trình tự TK1178 với trình tự số gen nhóm 1.3.Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu khuếch đại thành công gen TK1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo dòng gen sau - Cung cấp tài liệu cho nghiên cứu sinh viên nghiên cứu khuếch đại đoạn gen tương tự nghiên cứu mở rộng việc tạo dòng gen 30 +Thứ : thiết bị soi gel chưa vệ sinh sạch, sử dụng lâu kiểm tra điện di nhiều lần ngày nên xuất tạp ảnh ( vệt sáng ảo ), gel bị vỡ dễ nhìn thấy vệt sáng - Giếng 2: xuất vạch sáng, không sáng rõ song băng vạch thể to, thành cụm đáy có đứt gãy Dựa vào kết điện di kiểm tra đƣa khẳng định : - Mẫu genomekod1 không sử dụng không DNA genome, nguyên nhân khẳng đinh không rực tiếp tách chiết, mẫu nhận mẫu để lâu thời gian vận chuyển lâu dài, điều kiện không đảm bảo nên hư hại, sử dụng cho thí nghiệm - Mẫu genomekod2 hoàn toàn đủ điều kiện để sử dụng cho thí nghiệm 4.2.Kết so sánh trình tự protein Tk1178 với số protein gen khác giới Archaea Bằng việc sử dụng thông tin từ trang NCBI để lấy trình tự gen TK1178 sau chọn FASTA để thông tin gen Tk1178, tiếp tục lấy trình tự protein gen Tk1178 kết chạy Run Blast cho kết so sánh điểm giống chúng thông qua độ bao phủ ( Hình 2.5) Tiếp tục sử dụng phần mềm Bioedit [1] thu kết Hình 4.2, dựa vào kết so sánh có thê thấy trình tự protein giống ( đặc điểm nhận dạng giống từ 36- 93 % tùy gen ), độ bao phủ thấp 53 %, tỷ lệ cao tạo nên độ tin cậy lớn, phân loại TK1178 đúng, nhóm Archaea 31 Bảng 4.1: Kết so sánh trình tự protein gen Tk1178 với protein khác NCBI Description Max score Total score Query cover E value Ident Archemetzinchin (Thermococcus kodakarensis) 381 381 100% 3e134 100% Archemetzinchin(Thermococcus peptmophilus) 355 355 98% 4e124 93% Archemetzinchin(Thermococcus thiorudians) 228 228 97% 1e- 73 59% Archemetzinchin(Thermococcus zilligii) 225 225 100% 2e- 72 58% Archemetzinchin(Thermococcus onnurieus) 220 220 97% 8e- 71 88% Peptidase M54(Natronomonas pharaonis) 101 101 94% 4e- 24 34% 101 101 94% 4e- 24 34% Peptidase M54(desulfucoccus fermentans) Ở bảng trích dẫn vài trình tự protein gen khác có quan hệ họ hàng với Thermococcus kodakarensis KOD1, hàng trăm trình tự khác đem so sánh kết cho tỷ lệ độ tương đồng cao, có loại giống protein Tk1178 đến 90% 32 WP_011250129.1: protein gen tk1178 KYH39825.1: protein candidatus bathyarchaeta archaeon B26- (giống 39%) WP_058947068.1: protein Thermococcus sp 2319x1(giống 47%) CUU05893.1: protein bacterium JGL-3(tỷ lệ giống 36%) KPK24729.1: protein dehalocoidia bacterium SGB51.3 ( giống 41%) WP_042701069.1: protein Pyrococcus horikoshi ( giống 49%) Hình 4.2 : Kết so sánh trình tự protein gen TK1178 với protein số gen khác ngân hàng NCBI sử dụng Bioedit 33 4.3.Kết khuếch đại đoạn gen Tk1178 kỹ thuật PCR Hình 4.3: Kết khuếch đại đoạn gen Tk1178 điều kiện nhiệt độ tối ưu Hình 4.3 thể ảnh điện di mẫu gen Tk1178 vi khuẩn T Kodakarensis KOD1, hình ảnh thể giếng theo thứ tự M, 1, M marker; 1, mẫu gen Tk1178 giống tất thành phần phản ứng ( nồng độ, thể tích, thành phần phản ứng ) khác mức nhiệt độ Sau thực xong phản ứng khuếch đại- PCR, khuếch đại sản phẩm thực điện di gel agarose 1% theo quy trình trình bày phần nội dung để kiểm tra kết Sau soi gel thu kết sau băng vạch sáng rõ, đối chiếu với thang chuẩn thấy sản phẩm rơi vào khoảng 300- 340 34 bp, đối chiếu với thông tin báo khoa học NCBI [7] kết luận thực khuếch đại thành công đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminpeptidase từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 4.4.Kết kiểm tra ảnh hƣởng nhiệt độ tới khuếch đại gen Tk1178 Hình 4.4: Mức nhiệt độ tương ứng với thứ tự giếng Hình 4.5 : Kết điện điện di sản phẩm PCR đoạn gen Tk1178 mức nhiệt độ khác Tiến hành PCR trình tự đoạn gen Tk1178 theo quy trình, chia thành 10 mẫu riêng biệt với nồng độ 25 µl điều chỉnh mức nhiệt độ cho phù hợp theo thang nhiệt độ tăng dần từ 55- 66 0C ( Hình 4.4 ) Tra theo thứ tự marker, mẫu 1, mẫu 2, mẫu cuối mẫu 10, kết điện di hình 4.5 cho thấy 35 ảnh hưởng quan trọng nhiệt độ đến phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk 1178, cụ thể: - Các giếng 1, 2,3, 4, điện di không xuất băng vạch - Giếng 6, 7, 8, 9, 10 điện di cho lên băng vạch - Giếng băng vạch hiển thị sáng rõ nhất, sau đến giếng thứ 9; giếng 10 giếng cho băng sáng nhau, giếng cho băng sáng yếu Đối chiếu với thứ tự nhiệt độ PCR khuếch đại gen hình 4.4 thấy thực phản ứng PCR khuếch đại gen Tk1178 nhiệt độ khác cho kết hiển thị khác nhau, nhiệt độ cao phản ứng khuếch đại diễn mạnh, cho băng vạch rõ ngược lại, nhiệt độ thấp khả khuếch đại yếu chí khả khuếch đại Tuy nhiên nhiệt độ tăng cao làm ảnh hưởng đến khả khuếch đại thể việc kiểm tra khả khuếch đại hai mức nhiệt 65,89 0C 66 0C băng vạch hiển thị sáng yếu dần Khi kiểm tra ảnh hưởng nhiệt độ tới khuếch đại đoạn gen Tk1178 vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 thấy nhiệt độ 65,23 0C phản ứng khuếch đai diễn hiệu nhất, băng vạch hiển thị rõ ràng nhiệt độ 65, 23 0C nhiệt độ tối ưu cho thực phản ứng PCR khuếch đại gen Tk 1178 Từ kết luận cho thực phản ứng PCR khuếch đại gen Tk1178 nên sử dụng nhiệt độ 65, 23 0C kết tốt nhất, trường hợp khuếch đại lượng lớn mẫu đặt mẫu vào khoảng nhiệt từ 64, 13- 65,89 C tốt nên mức 65, 23 0C dây nhiệt độ tối ưu phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk1178 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1.Kết luận Trong trình thực thí nghiệm đưa số kết luận sau - Đã so sánh trình tự protein tk 1178 với trình tự protein số gen khác - Khuếch đại đoạn gen tk 1178 - Kiểm tra kết luận nhiệt độ tố ưu cho khuếch đại gen tk1178 Cụ thể sau: - Protein Tk1178 protein thuộc nhóm archemetzincin với phân tử lượng 21079,47 kdal điểm đẳng điện Pi= 8.34 - Trình tự đoạn gen Tk1178 khuếch đại thành công với vạch màu sáng rõ, chứng tỏ bắt cặp mồi đặc hiệu tốt điều kiện nhiệt độ PCR phù hợp, mức nhiệt độ tốt nằm khoảng 65,23 0C 5.2.Kiến nghị Do thời gian thực tập điều kiện phòng thí nghiệm có hạn nên dừng lại việc nghiên cứu khuếch đại đoạn gen Tk1178 vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, so sánh trình tự protein với số trình tự protein khác ngân hàng liệu NCBI, kiểm tra ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến khuếch đại đoạn gen Tk1178 tìm nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại gen Tk1178 vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 có điều kiện tiếp tục xin phép đưa số kiến nghị sau: - Tiếp tục thực nghiên cứu tạo dòng cho gen Tk 1178 tổng hợp aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 - Tiến hành biểu gen Tk1178 vào protein biểu - Kiểm tra hoạt tính protein biểu 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Văn Cách,(2005 ) Giáo trình tin sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc, Triệu Thị Lệ, Hà Thị Minh,(2007) Giáo trình sinh học phân tử, nhà xuất khoa học kỹ thuật Hồ Thị Tuyết Mai, Bài giảng Công nghệ Enzyme,(2006) Trường CĐ Lương Thực Thực Phẩm Đà Nẵng Trần Xuân Ngạch, Công Nghệ Enzyme,(2007) Nhà xuất Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật,(2004) Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu,(2002) Giáo trình hóa sinh công nghiệp, nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh Atomi, H., et al., Description of Thermococcus kodakaraensis sp nov., a well studied hyperthermophilic archaeon previously reported as Pyrococcus sp KOD1 Archaea, 2004 1(4): p 263-7 Fukui, T., et al., Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes Genome Res, 2005 15(3): p 352-63 Huber, R and K.O Stetter, Discovery of hyperthermophilic microorganisms Methods Enzymol, 2001 330: p 11-24 10 Ruan, J., [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (second edition) Volume and the study of Actinomycetes systematic in China] Wei Sheng Wu Xue Bao, 2013 53(6): p 521-30 38 11 Macalady, J.L., et al., Tetraether-linked membrane monolayers in Ferroplasma spp: a key to survival in acid Extremophiles, 2004 8(5): p 411-9 12 Fiala, J., [The Scientific Council of the Czech Ministry of Health and its function] Cesk Pediatr, 1986 41(7): p 418-9 13 Li, J.F., A fast neighbor joining method Genet Mol Res, 2015 14(3): p 8733-43 14 Escriva, H., et al., Rat mammary-gland transferrin: nucleotide sequence, phylogenetic analysis and glycan structure Biochem J, 1995 307 ( Pt 1): p 47-55 15 Miroshnichenko, V.P., et al., [Characteristics of the diagnosis and treatment of severe forms of late pregnancy toxemia] Akush Ginekol (Mosk), 1989(5): p 43-8 16 Zheng, X., et al., Phylogeny and evolutionary histories of Pyrus L revealed by phylogenetic trees and networks based on data from multiple DNA sequences Mol Phylogenet Evol, 2014 80: p 54-65 17 Ishino, Y and I.K Cann, The euryarchaeotes, a subdomain of Archaea, survive on a single DNA polymerase: fact or farce? Genes Genet Syst, 1998 73(6): p 323-36 18 Woese, C.R and R Gupta, Are archaebacteria merely derived 'prokaryotes'? Nature, 1981 289(5793): p 95-6 19 Gupta, R.S., The natural evolutionary relationships among prokaryotes Crit Rev Microbiol, 2000 26(2): p 111-31 20 Gribaldo, S and C Brochier-Armanet, The origin and evolution of Archaea: a state of the art Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2006 361(1470): p 1007-22 39 21 Vannier, P., et al., Genome expression of Thermococcus barophilus and Thermococcus kodakarensis in response to different hydrostatic pressure conditions Res Microbiol, 2015 166(9): p 717-25 22 Lamosa, P., et al., Effects of temperature, salinity, and medium composition on compatible solute accumulation by thermococcus spp Appl Environ Microbiol, 1998 64(10): p 3591-8 23 Valentine, D.L., Adaptations to energy stress dictate the ecology and evolution of the Archaea Nat Rev Microbiol, 2007 5(4): p 316-23 24 Hearn, A., et al., Characterizing the specificity and cooperation of aminopeptidases in the cytosol and endoplasmic reticulum during MHC class I antigen presentation J Immunol, 2010 184(9): p 4725-32 25 Zhang, J., et al., Analysis of chromosome 22q11 copy number variations by multiplex ligation-dependent probe amplification for prenatal diagnosis of congenital heart defect Mol Cytogenet, 2015 8: p 100 26 Rinker, K.D and R.M Kelly, Growth Physiology of the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus litoralis: Development of a Sulfur-Free Defined Medium, Characterization of an Exopolysaccharide, and Evidence of Biofilm Formation Appl Environ Microbiol, 1996 62(12): p 4478-85 PHỤ LỤC Phụ lục 1: VÙNG BIỂU HIỆN CỦA VECTOR PET -28A- C Phụ lục 2: VECTOR Pet-28A- C SỬ DỤNG TRONG THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU Phụ lục 3: TRÌNH TỰ GEN TK1178 Phụ lục : TRÌNH TỰ PROTEIN CỦA TK1178 VÀ KẾT QUR SO SÁNH VỚI PROTEIN CỦA MỘT SỐ GEN KHÁC Trình tự protein tk1178 MRVILIVPIGYIPEWLIKDVAEFVDSYYSRRGVSVKAGDSLSESLFLSAYHPF RRQFLGGAFLPTLSEIG RRAGALATVGITKVDLYEKGMNFVFGVASEKLRSAVVSIHRLRPEFYGRPS NDELLIERTVKEVMHELGH VFGLSHCPNVRCVMHFSNSVDDTDIKLPYYCPNCERKLLRNLEVVL So sánh trình tự protein tk1178 với protein gen khác có quan hệ họ hàng XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái nguyên, ngày tháng năm 2016 Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn [...]... hạn một thành vi n sinh hóa Phù Sa, Tỉnh Vĩnh Long) Các nghiên cứu về gen TK1178 và khả năng mã hóa cho enzyme aminopeptidase hầu như không có 2.3.2.Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus và đoạn gen TK1178, như nghiên cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, của vi n nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trường Đại Học Kyoto,... sánh trình tự protein của gen Tk1178 với một số trình tự protein khác trong cùng họ 3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu và khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 3.2.4 Nội dung 4: Kiểm tra sự ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ đến sự khuếch đại đoạn gen Tk 1178 3.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 3.3.1 Hóa chất - Hóa chất tách chiết DNA gồm... đoạn gen của nó và ứng dụng của nó trong nghiên cứu khoa học được đề cập trên các bài báo, tạp chí khoa học được công bố rộng trên các trang web đặc biệt là NCBI 16 PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Đối tƣợng nghiên cứu - Gen Tk1178 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 3.2.Nội dung nghiên cứu 3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis. .. Kiểm tra và so sánh trình tự protein của gen Tk 1178 với một số trình tự họ hàng trong ngân hàng dữ liệu NCBI 2.3 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới 2.3.1.Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Hiện các nghiên cứu trong nước về vi khuẩn Thermococcus kodarensis KOD1 và các gen đặc trưng là không có, các nghiên cứu xuất hiện chỉ liên quan đến vi cnghiên cứu tạo vector T bắt nguồn từ vi khuẩn suối... có những đặc điểm khác biệt nhất là hệ gen, 7 hệ gen của Thermococcus kodakarensis được ước lượng khoảng 2,09 triệu bp chứa khoảng 2434 gen, toàn bộ trình tự genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 đã được nhóm tác giả thuộc Vi n Nghiên Cứu Hóa Sinh Tổng Hợp Và Hóa Sinh Học thuộc Đại Học kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản nghiên cứu và giải trình tự [8] Một số nghiên cứu mô tả sự so sánh giữa hai loài Archaea... Pyrococcus kodakarensis KOD1 sau đó được phân loại vào loài Thermococcus dựa vào trình tự 16sRNA [7], [9] Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 có kích thước trong khoảng từ 12 µm, tồn tại chủ yếu ở dạng hình cầu, cấu trúc dạng sợi [10], thiếu màng trong và bào quan, cấu trúc gồm màng sinh chất và thành tế bào, màng tế bào được tạo thành từ những... 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một vi khuẩn chịu nhiệt sống trong điều kiên nhiệt độ cao từ 60- 100 0C, nhiệt độ tối ưu là 85 0C, có khả năng sinh trưởng, phát triển trong dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu là 6,5 ), độ muối cao ( từ 1- 5% ) tối ưu ở 3 %, phát hiện đầu... cũng mang những đặc trưng của khuẩn cổ Achaea , vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn là những dòng giống riêng biệt được rẽ nhánh khởi đầu từ một tập hợp các cá thể tổ tiên sơ khai [18], tuy nhiên các nhà sinh vật học lại cho rằng vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn được rẽ ra từ một nhóm vi khuẩn [19], có thể tổ tiên của chúng cũng là một sinh vật ưa nhiệt đặc biệt trong điều kiện... 71 gen thuộc về ba COG: sản xuất năng lượng và chuyển đổi (C); vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); phiên mã (K), trong khi đó 70 gen được kết hợp với sao chép, tái kết hợp và sửa chữa (L), vận tải coenzyme (H ) và cơ chế phòng vệ (V) [21], như vậy genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 có vai trò vô cùng quan trọng trong vi c tham gia các hoạt ðộng chuyển hóa và trao đổi chất Thermococcus kodakarensis. ..3 - Sinh vi n củng cố, hệ thống lại kiến thức đã học và thông qua hoạt động thực tiễn làm giàu thêm hiểu biết của bản thân về những gì được học - Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần làm tiền đề cho vi c tạo dòng, biểu hiện protein do gen Tk1178 mã hóa từ đó tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme aminopeptidase 4 PHẦN