Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1.

LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài:

BÀN THỊ NGÂN

Tên đề tài:

“ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME

AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT

Thermococcus kodakarensis KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Thái Nguyên- Năm 2016

BÀN THỊ NGÂN

Tên đề tài:

“ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME

AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT

Thermococcus kodakarensis KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH- CNTP Khóa học : 2012- 2016 Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Bằng Phương

Thái Nguyên- Năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Được sự nhất trí của Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho

enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1”

Qua sáu tháng thực tập tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên em đã thu được những kết quả thiết thực phục vụ cho việc hoàn thành đề tài tốt nghiệp Để đạt được kết quả đó em xin chân thành cảm ơn

chị Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình

thực tập tốt nghiêp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Bằng Phương, bộ môn

Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ,giúp

đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi sai sót, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016

Sinh viên thực hiện

Bàn Thị Ngân

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 : Danh mục các thiết bị 18

Bảng 3.2 : Thành phần môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 19

Bảng 3.3: Một số thành phần khoáng sử dụng trong nuôi cấy 21 Bảng 3.4: Thành phần một số vitamin sử dụng trong quá trình nuôi cấy 22 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 4 Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus 5 Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 8 Hình 2.4: Cấu tạo hóa học của aminopeptidase 12

Hình 2.5 : Kiểm tra và so sánh trình tự protein của gen Tk 1178 với một số trình tự khác trong ngân hàng dữ liệu NCBI 14 Hình 3.1 : Màu sắc môi trường thay đổi khi bổ sung thêm lưu huỳnh 20

Hình 3.2 : Môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 sau khi đã bổ

sung lưu huỳnh và hấp khử trùng dưới dòng ni tơ trong 5 giờ 20

Hình 3.3 : Trình tự gen tk1178 trên trang NCBI 25 Hình 3.4 : Bản đồ enzyme cắt giới hạn gen Tk1178 26 Hình 3.5 : Kết quả kiểm tra trình tự đoạn mồi dựa trên chương trình Tm Calculator 27

Hình 3.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk 1178 29 Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA genome 32 Hình 4.2 : Kết quả so sánh trình tự protein của gen TK1178 với một số gen thuộc

giới Achaea 33

Hình 4.3: Kết quả khuếch đại đoạn gen Tk1178 dưới điều kiện nhiệt độ tối ưu 34 Hình 4.4: Mức nhiệt độ tương ứng với thứ tự các giếng 35 Hình 4.5 : Kết quả điện điện di sản phẩm PCR đoạn gen Tk1178 dưới các mức nhiệt

độ khác nhau 35

EDTA Etilenduamin tetraacetic acide

IPTG Isopropyl- β- D- Thiogalactopyranosidase

NCBI National center for biotechnology infor

mation

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.3.Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

2.1.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.1.2 Phân loại 5

2.1.2 Đặc điểm chung cho sự phát triển và tồn tại 6

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 9

2.2 Đặc điểm của enzyme aminopeptidase do gen Tk1178 tổng hợp 10

2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa và ứng dụng 10

2.2.1.1 Enzyme 10

2.2.1.2 Khái niệm, phân loại và đặc tính ứng dụng của protease 11

2.2.1.3 Ý nghĩa và ứng dụng 12

2.2.2 Protease của Tk1178 13

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1.Đối tượng nghiên cứu 16

3.2.Nội dung nghiên cứu 16

3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 16

3.2.2 Nội dung 2: So sánh trình tự protein của gen Tk1178 với một số trình tự protein khác trong cùng họ 16

3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu và khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme

aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 16

3.2.4 Nội dung 4: Kiểm tra sự ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến sự khuếch đại đoạn gen Tk 1178 16

3.3.1.Hóa chất 16

3.3.2.Thiết bị, dụng cụ 16

3.4.Phương pháp 17

3.4.1.Phương pháp nuôi cấy 17

3.4.2.Phương pháp tách chiết DNA genome 21

3.4.3.Phương pháp điện di 22

3.4.4 Phương pháp PCR 23

3.4.4.1.Thiết kế mồi cho gen Tk1178 23

3.4.4.2.Tiến hành PCR 27

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

4.1.Kết quả tách chiết DNA genmome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 29

4.2.Kết quả so sánh trình tự protein của Tk1178 với một số protein của gen khác trong giới Archaea 30

4.3.Kết quả khuếch đại đoạn gen Tk1178 bằng kỹ thuật PCR 33

4.4.Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự khuếch đại gen Tk1178 34

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

5.1.Kết luận 36

5.2.Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một chủng vi khuẩn thuộc giới

vi khuẩn cố Archea đươc các nhà khoa học phân lập từ miệng núi lửa gần bờ biển

thuộc đảo Kodakara của Nhật Bản, có khả năng sống trong điều kiện nhiêt độ từ 60-

[7] Theo cây phân loại ( Hình 2.2 ) trình tự 16s rRNA quết định sự phân loại khác nhau của các loài theo bộ Thermococcales, các nghiên cứu cho thấy KOD1 có trình tự 16s RNA

do đó nó là một thành viên của chi Thermococcus, các nghiên cứu về trình tự 16S DNA ribosome dẫn đến các khả năng phân loại khác nhau bao gồm Thermococcus peptonophilus

và Thermococcus , kết quả lai DNA- DNA và sự khác biệt trong đặc tính phát triển với việc sử dụng chất nền để phân lập chủng KOD1 từ T peptonophilus và T stetteri ở mức độ loài chỉ ra rằng trình tự KOD1 đại diện cho một loài mới của Thermococcus, mà chúng ta biết đến như Thermococcus kodakaraensis KOD1 sp [10]

Hệ gen của KOD1 có trên hai nghìn đoạn gen khác nhau ( 2434 gen ) trong đó có đoạn gen Tk1178 có khả năng mã hóa cho enzyme aminopeptidase, được các nhà khoa học

trường đại học Khoa Hóa tổng hợp và sinh học Hóa học, Trường Đại Học Kỹ thuật, Đại học Kyoto, Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, Nhật Bản và Cục Chất liệu và Khoa học đời sống, trường Kỹ thuật, Đại học Osaka, Yamadaoka, Suita, Osaka, Nhật Bản công bố cụ thể trên

trang NCBI [7] Aminopepdidase là enzyme xúc tác sự phân cắt của các axit amin từ các

amino của các protein hay peptide Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và được tìm thấy trong nhiều bào quan dưới tế bào, trong bào tương, và là thành phần của màng tế bào

Một số aminopeptidases là monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp tiêu hóa

enzyme của protein do đó đóng vai trò vô cùng quan trọng do khả năng bền với nhiệt độ cao khó bị biến tính trong khi các enzyme khác lại biến tính rất nhanh khi thay đổi nhiệt độ lên mức cao, dễ tham gia phản ứng do đó nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp và các lĩnh vực nghiên cứu khoa học [6]

Chính vì những ứng dụng quan trọng của enzyme nên ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu về enzyme và khả năng tổng hợp enzyme từ sinh vật ( động vật, thực vật và cả

vi sinh vật ) [4] Đoạn gen Tk 1178 của vi khuẩn Thermococcus korakadensis KOD1 (T

korakadensis ) có khả năng mã hóa enzyme aminopeptidase, ứng dụng nhiều trong công

nghiệp và sản xuất thực phẩm ( sản xuất bột giặt, các loại bánh mỳ…), y học…Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tai phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, dưới sự hướng

dẫn của TS Phạm Bằng Phương, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu và khuếch đại

gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” với mục tiêu chính là có thể khuếch đại được đoạn gen này và tìm ra

nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại- phản ứng PCR, phục vụ cho các nghiên cứu tạo dòng, tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme do gen Tk1178 mã hóa

1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

- Mục tiêu :

+ Nghiên cứu được những đặc điểm của protein của gen Tk1178

+ Khuếch đại được đoạn gen TK1178 từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus

kodakarensis KOD1

-Yêu cầu :

+ Nghiên cứu, nắm bắt đặc điểm của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1

và của gen TK1178

+ Khuếch đại đoạn gen TK1178 bằng kỹ thuật PCR

+ So sánh được trình tự của TK1178 với trình tự một số gen trong cùng nhóm

1.3.Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Nghiên cứu khuếch đại thành công gen TK1178 mã hóa cho enzyme

aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 thuận lợi cho

việc nghiên cứu tạo dòng gen sau này

- Cung cấp tài liệu cho các nghiên cứu của sinh viên về nghiên cứu khuếch đại các đoạn gen tương tự hoặc nghiên cứu mở rộng ra việc tạo dòng gen

- Sinh viên củng cố, hệ thống lại kiến thức đã học và thông qua hoạt động thực tiễn làm giàu thêm hiểu biết của bản thân về những gì được học

- Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần làm tiền đề cho việc tạo dòng, biểu hiện protein do gen Tk1178 mã hóa từ đó tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme

aminopeptidase

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một vi khuẩn chịu nhiệt sống

trưởng, phát triển trong dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu là 6,5 ), độ muối cao ( từ 1- 5% ) tối ưu ở 3 %, phát hiện đầu tiên ở khu vực miệng núi lửa gần bờ đảo Kodakara,

Kagoshima, Nhật Bản, ban đầu được đặt tên là Pyrococcus kodakarensis KOD1 sau đó được phân loại vào loài Thermococcus dựa vào trình tự 16sRNA [7], [9]

Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 có kích thước trong khoảng từ 1-

2 µm, tồn tại chủ yếu ở dạng hình cầu, cấu trúc dạng sợi [10], thiếu màng trong và bào quan, cấu trúc gồm màng sinh chất và thành tế bào, màng tế bào được tạo thành từ những phân tử phospholipid, lớp lipide kép thay bằng lớp lipide đơn và 2 phân tử lipide được nhập làm 1tạo thành 1 phân tử lipide có 2 đầu cực, giúp tăng khả năng thích nghi với môi trường biến đổi [11]

2.1.1.2 Phân loại

Đầu tiên Fiala and Stetter 1986 [12] xây dựng một cây phát sinh loài với các loài khác nhau sử dụng Thermococcus Pyrococcus furiosus như một nhóm Các trình

tự gen 16S rRNA của chủng thể hiện trong Hình 2.2 được lựa chọn cho nhiều liên kết

và xây dựng một cây phả hệ bằng cách sử dụng phương pháp neighbor-joining [13]

Các vị trí phát sinh loài của giống KOD1 đã nằm trong chi Thermococcus, với các trình tự KOD1 nhóm với T peptonophilus [14] và T stetteri (99%) [15] Khi áp dụng

phương thức maximum-likelihood [16], vị trí phát sinh loài của một số chủng thay

đổi, nhưng các phân nhóm trong T peptonophilus và T stetteri và KOD1 không thay đổi gì Kết quả chỉ ra rằng KOD1 là thành viên của Thermococcus và cho rằng nó có liên quan chặt chẽ với T peptonophilus và T stetteri [15] được thể hiện cụ thể bởi cây

phân loại

Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus

Dựa vào các nghiên cứu phân loại [17] có thể thấy vi khuẩn Thermococcus

kodakarensis KOD1 được phân loại như sau:

- Loài : Thermococus kodakarensis KOD1

Do được phân loại trong giới Achaea nên Thermococcus kodakarensis KOD1 cũng mang những đặc trưng của khuẩn cổ Achaea , vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật

nhân chuẩn là những dòng giống riêng biệt được rẽ nhánh khởi đầu từ một tập hợp các

cá thể tổ tiên sơ khai [18], tuy nhiên các nhà sinh vật học lại cho rằng vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn được rẽ ra từ một nhóm vi khuẩn [19], có thể tổ tiên của chúng cũng là một sinh vật ưa nhiệt đặc biệt trong điều kiện môi trường thay đổi cực đoan như ngày nay [20]

T.kodakarensis được phân loại dựa vào trình tự 16s DNA ribosome của loài

Thermococcus khác nhau có sẵn từ các cơ sở dữ liệu EMBL / GenBank / DDBJ Khu

Thermococcus kodakaraensis) đã được sử dụng để tính toán phát sinh loài Các liên

kết nhiều trình tự DNA được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình ALIGN chứa trong các chương trình ClustalW (Thompson et al., 1994) được cung cấp bởi ngân hàng dữ liệu ADN của Nhật Bản (DDBJ) Cây phát sinh loài được xây dựng theo

phương pháp neighbor-joining (Saitou và Nei 1987) và theo phương pháp tối

đa-likelihood (Felsenstein, 1981) với chương trình fastDNAmL (Olsen et al., 1994) được

thực hiện 1000 lần [7] Cây phát sinh loài đã được hình tượng với chương trình TreeView

2.1.2 Đặc điểm chung cho sự phát triển và tồn tại

Để có thể tồn tại trong điều kiện môi trương khắc nghiệt thì bản thân vi khuẩn

Thermococcus kodakarensis KOD1 phải có những đặc điểm khác biệt nhất là hệ gen,

hệ gen của Thermococcus kodakarensis được ước lượng khoảng 2,09 triệu bp chứa khoảng 2434 gen, toàn bộ trình tự genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 đã được nhóm tác giả thuộc Viện Nghiên Cứu Hóa Sinh Tổng Hợp Và Hóa Sinh Học thuộc Đại Học kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản nghiên cứu và giải trình tự [8]

Một số nghiên cứu mô tả sự so sánh giữa hai loài Archaea hyperthermophilic có quan hệ họ hàng là Thermococcus barophilus chủng MP và Thermococcus

kodakarensis KOD1 đã cho thấy có tổng cộng có 378 gene khác nhau được biểu hiện

trong tế bào của T barophilus tăng trưởng 0,1, 40 và 70 MPa, trong khi 141 gen khác trong tế bào T kodakarensis tăng trưởng 0,1 và 25 MPa Trong T Barophilus- tế bào

nuôi cấy trong điều kiện (0,1 và 70 MPa), 178 gen được phân bố trong ba cụm thuộc

nhóm Orthologous (COG): sản xuất năng lượng và chuyển đổi (C); vận chuyển ion vô

cơ và trao đổi chất (P); vận chuyển carbohydrate và trao đổi chất (G), trong khi 156 gen được phân bố trong 3 nhóm: vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); sao chép, tái kết hợp và sửa chữa (L); vận chuyển nucleotit và trao đổi chất (F) Những biểu hiện

của 141 gen đã được quy định trong các tế bào T kodakarensis phát triển trong điều

kiện khắc nghiệt (25 MPa); 71 gen thuộc về ba COG: sản xuất năng lượng và chuyển đổi (C); vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); phiên mã (K), trong khi đó 70 gen được kết hợp với sao chép, tái kết hợp và sửa chữa (L), vận tải coenzyme (H ) và cơ

chế phòng vệ (V) [21], như vậy genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 có vai

trò vô cùng quan trọng trong việc tham gia các hoạt ðộng chuyển hóa và trao đổi chất

Thermococcus kodakarensis KOD1, đã thích nghi với sự phát triển tối ưu trong

điều kiện nhiệt độ cao và độ mặn Tuy nhiên, các điều kiện môi trường cho sự tác động không phải luôn luôn ổn định, và tác động này có thể phải đối mặt với tác động khác nhau trong cùng môi trường Nghiên cứu của Lamosa và cs, 1998 [22] đã so sánh

phản ứng chịu nhiệt, oxy hóa protein của T kodakarensis và ảnh hưởng của muối

bằng cách điện di hai chiều, và các điểm protein đã được xác định thông qua TOF / MS Năm mươi chín, bốn mươi hai, hai mươi chín điểm đã gây ra dưới nhiệt, oxy hóa, và ảnh hưởng của muối tương ứng Trong số các protein dưới họ hàng có bốn protein (một loại protein giả, sinh tổng hợp lyase pyridoxal, peroxiredoxin, và protein disulphide oxidoreductase) có liên quan với cả ba protein, phân tích Gene Ontology cho thấy các protein này được chuyển hóa chủ yếu tham gia vào các quá trình của tế

MALDI-bào Các phân tích cho rằng con đường chuyển hóa chính liên quan đến các enzyme có liên quan đến quá trình chuyển hóa carbohydrate, tổng hợp chất chuyển hóa cơ sở, và sinh tổng hợp axit amin Những dữ liệu này có thể nâng cao sự hiểu biết của chúng ta

về các chức năng và cơ chế phân tử của ưa nhiệt Archaea để tồn tại và thích ứng trong

môi trường khắc nghiệt

Trình tự genome của thermococcus đã được phân loại cụ thể với trên 2.000 gen

khác nhau có chung đặc điểm của Achaea và những chức năng tổng hợp mã hóa quan trong khác được trình bày trong NCBI (Hình 2.3)

Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1

Chú thích :

-Vòng tròn ngoài cùng: bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở

-Vòng tròn thứ 2: dự đoán các vùng mã hóa protein trong chiều kim đồng hồ -Vòng tròn thứ 3 : dự đoán các vùng mã hóa ngược chiều kim đồng hồ

-Các gen biểu thị được phân màu theo nhóm phân loại chức năng, cụ thể:

+ Màu hồng: phiên mã

+ Màu hồng nhạt: sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa + Xanh lá cây: vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể

+ Vàng nhạt: lớp bên ngoài tế bào + Xanh da trời: thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa + Xanh nhạt: tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất + Xanh lam: cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme + Màu tím: sản xuất năng lượng, chuyển đổi

+ Tím nhạt: chuyển hóa lipide + Màu xám: chức năng chỉ mới được đề xuất +Màu đen: không rõ chức năng

- Vòng tròn thứ 4: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ (màu đỏ trong vòng thứ 4)

- Vòng tròn thứ 5: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngược chiều kim đồng

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Đặc điểm của Thermococcus kodakarensis KOD1 là vi khuẩn chịu nhiệt, có khả

ứng hóa học đa dạng và sử dụng nhiều nguồn năng lượng đặc biệt là năng lượng từ các hợp chất vô cơ như lưu huỳnh, amoniac, năng lượng giải phóng thông qua quá trình

trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là môi

trường đặc biệt có bổ sung khoáng và vi lượng, đặ biệt là sử dụng khí lưu huỳnh và nuôi trong điều kiện kỵ khí [22]

Thông tin từ phép lai DNA-DNA giữa chủng KOD1 và Thermococcus

peptonophilus JCM9653T, Thermococcus gorgonarius JCM10552T, Thermococcus fumicolans JCM10128T và Thermococcus guaymasensis JCM10136T Tiến sĩ Takashi

Itoh tại trung tâm trưng bày sinh vật Nhật Bản của các vi sinh vật (JCM), RIKEN, Saitama, Nhật Bản và Tiến sĩ Francesco Canganella tại Sở Sinh lý thực vật và hóa sinh học, Đại học Tuscia, Ý Đối với thí nghiệm riêng do nhóm tác giả lai tạo,

Thermococcus stetteri JCM8559T, Thermococcus profundus JCM9378T (Kobayashi et

al., 1994) và Thermococcus fumicolans JCM10128T (Godfroy et al 1996) đã thu được

từ JCM Thermococcus ATCC35543T celer (Zillig et al 1983) đã thu được từ Type

Culture Collection Mỹ (Manassas, VA) Tất cả các thao tác nuôi cấy được thực hiện trong một buồng kỵ khí Môi trường đã được thêm 0,5% lưu huỳnh, vừa bị kỵ khí kín

và ủ ở 85 hoặc 95 ° C cho 24-40 h Các tế bào được thu hoạch và ly giải với chất tẩy rửa (1% N-lauroylsarcosine, Nacalai Tesque), và nhiễm sắc thể DNA đã được tinh chế bằng mật độ CsCl Gradient siêu ly tâm (Optima XL-90, Beckman, Fullerton, CA) Các thí nghiệm lai DNA-DNA được thực hiện tại Higeta Shoyu (Chiba, Nhật Bản) sử dụng phương pháp mô tả ở nơi khác (Ezaki et al 1989)

2.2 Đặc điểm của enzyme aminopeptidase do gen Tk1178 tổng hợp

2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa và ứng dụng

2.2.1.1 Enzyme

trong và ngoài cơ thể, có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dal (có kích thước

chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật

enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn, tan

môi không phân cực Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị

- Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các

Trong phân tử enzym hai cấu tử có hai phần

+apoenzym: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzym, quyết định tính đặc

hiệu)

+coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym),

bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp

2.2.1.2 Khái niệm, phân loại và đặc tính ứng dụng của protease

- Một protease (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) là bất kỳ loại enzyme nào có khả năng phân giải protein, bắt đầu quá trình dị hóa protein bằng cách thủy phân liên kết peptide và liên kết axit amin với nhau trong một chuỗi polypeptide Protease đã có nhiều biến đổi, và các lớp khác nhau của protease có thể thực hiện những phản ứng tương tự bởi cơ chế xúc tác hoàn toàn khác nhau Proteases có thể được tìm thấy trong động vật, thực vật, vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi rút (Lê Ngọc Tú và cs, 2002) [2]

Hình 2.4: Cấu tạo hóa học của aminopeptidase

- Phân loại: protease được phân thành 7 nhóm lớn

+ protease serine - sử dụng một rượu serine

+ protease cystein - sử dụng một thiol cysteine

+ protease Threonine - sử dụng một thứ rượu threonine

+ protease Aspartic - sử dụng một axit cacboxylic aspartate

+ protease glutamic - sử dụng một axit cacboxylic glutamate

+ Metalloproteases - sử dụng một kim loại, thường là kẽm

+ Asparagin peptide lyases - sử dụng một asparagin để thực hiện một phản ứng loại bỏ (không cần nước)

- Protease dùng để chỉ một nhóm các enzyme có chức năng xúc tác là để thủy phân protein Họ còn được gọi là enzyme phân giải protein hoặc enzym hệ thống, enzyme thủy phân protein rất quan trọng trong việc tiêu hóa vì chúng c [4]

Ký sinh trùng, mẫu nấm, và vi khuẩn là protein Virus là những ký sinh trùng tế bào bao gồm các axit nucleic được bao phủ bởi một màng protein Enzyme có thể phá

vỡ các protein không tiêu hóa được, mảnh vỡ tế bào, và các độc tố trong máu, dành

phần hệ thống miễn dịch của nhiệm vụ này Sau đó hệ thống miễn dịch có thể tập trung hành động đầy đủ của nó về cuộc xâm lược của vi khuẩn hoặc ký sinh trùng [5]

- Aminopeptidases là enzyme xúc tác sự phân cắt của các axit amin từ các

amino của các protein hay peptide Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và được tìm thấy trong nhiều bào quan dưới tế bào, trong bào tương, và là thành phần của màng

tế bào Một số aminopeptidases là monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp

tiêu hóa enzyme của protein [24]

2.2.2 Protease của Tk1178

Trình tự protein của gen tk1178:

MRVILIVPIGYIPEWLIKDVAEFVDSYYSRRGVSVKAGDSLSESLFLSAYHPFRRQFLGGAFLPTLSEIG

RRAGALATVGITKVDLYEKGMNFVFGVASEKLRSAVVSIHRLRPEFYGRPSNDELLIERTVKEVMHELGH

VFGLSHCPNVRCVMHFSNSVDDTDIKLPYYCPNCERKLLRNLEVVL

Hình 2.5 : Kiểm tra và so sánh trình tự protein của gen Tk 1178 với một số trình tự

họ hàng trong ngân hàng dữ liệu NCBI

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

2.3.1.Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện các nghiên cứu trong nước về vi khuẩn Thermococcus kodarensis KOD1

và các gen đặc trưng là không có, các nghiên cứu xuất hiện chỉ liên quan đến việcnghiên cứu tạo vector T bắt nguồn từ vi khuẩn suối nước nóng phục vụ cho việc biến nạp và tạo dòng, nổi bật trong các công trình nghiên cứu là sản phẩm chế tạo vector T-TUAF của TS Dương Văn Cường- Phó Khoa Công nghệ Sinh học và Công

nghệ Thực phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên Một số công ty công ty hoạt động trong lĩnh vực công nghệ sinh học tập trung vào việc thiết kế mồi dặc hiệu

cho viêc bắt cặp đặc hiệu từng đoạn gen trong hệ gen của Thermococcus kodakarensis

KOD1 ( công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên sinh hóa Phù Sa, Tỉnh Vĩnh Long)

Các nghiên cứu về gen TK1178 và khả năng mã hóa cho enzyme

aminopeptidase hầu như không có

2.3.2.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus và đoạn gen TK1178, như nghiên cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

KOD1, của viện nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trường Đại Học Kyoto, thuộc Katsura, Nashikyo- ku, Nhật Bản, tháng 3 năm 20005 Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chi

Thermococcus, bao gồm các vi khuẩn cổ Hyperthermophilic, các thành viên của Thermococcus có mặt ở khắp nơi trong môi trường nhiệt độ cao, và đóng một vai trò

quan trọng trong hệ sinh thái và trao đổi chất hệ vi sinh vật hoạt động trong hệ sinh

thái nước nóng Fukui T và cs, 2005 đã xác định và ghi chú các bộ gen 2.088.737- cơ

sở hoàn chỉnh của Thermococcus kodakaraensis KOD1, theo sau là sự so sánh với ba

bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp Tổng cộng có 2306 trình tự DNA mã hóa

(CDS) đã được xác định, trong đó một nửa (1165 CDS) là chú thích, trong khi các chức năng của 41% (936 CDS) không thể được dự đoán từ các cấu trúc chính Bộ gen chứa bảy gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus Một trong

số protein di truyền cho thấy sự tương đồng cao với nhóm Pyrococcus spp Sự sắp xếp

Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204 của protein khác

nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản, được chia sẻ giữa T

kodakaraensis và Pyrococcus spp Mặt khác, còn cho thấy nhiệm vụ của các protein

khác như tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa nucleotide, vận chuyển kim loại ion [7]

Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm vi sinh, trường đại học Wageningen, Phần Lan vào tháng 7 năm 2015 [25] với nội dung

trình bày về số lượng nhiễm sắc thể của Thermococcus kodakarensis KOD1, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra nhận định rằng các euryarchaeon Thermococcus

kodakarensis là sinh vật kỵ khí dị dưỡng Hyperthermophilic đặc trưng và do sự sẵn có

của các hệ thống kỹ thuật di truyền nó đã trở thành một trong những sinh vật mẫu cho

giới Archaea Mặc dù vai trò nổi bật này trong số các euryarchaeota, không sẵn có dữ

liệu về mức độ sắp đăt trình tự của loài này Cấu tạo thể đa bội có nhiều trong

euryarchaeota, đặc biệt là Halobacteria, số lượng bản sao nhiễm sắc thể của loài thuộc

một trong các đơn vị trong đơn vị cấu tạo nên giới đó, nghĩa là các Thermococcales (bao gồm Thermococcus spp và Pyrococcus spp.) chưa bao giờ được xác định Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học chứng minh rằng T kodakarensis là sinh vật có cấu

tạo đa bội với một số lượng bản sao nhiễm sắc thể mà thay đổi trong khoảng 7- 19 bản sao, tùy thuộc vào giai đoạn tăng trưởng [25]

Còn rất nhiều các nghiên cứu khác trên thế giới về chủng vi khuẩn

Thermococcus kodakarensis KOD1, giải trình tự các đoạn gen của nó và ứng dụng của

nó trong nghiên cứu khoa học được đề cập trên các bài báo, tạp chí khoa học được công bố rộng trên các trang web đặc biệt là NCBI

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Đối tượng nghiên cứu

- Gen Tk1178 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1

3.2.Nội dung nghiên cứu

3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn

Thermococcus kodakarensis KOD1

3.2.2 Nội dung 2: So sánh trình tự protein của gen Tk1178 với một số trình

tự protein khác trong cùng họ

3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu và khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho

enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cần sử dụng những thiết bị sau:

3.4.1.Phương pháp nuôi cấy

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 được nuôi cấy trong môi trường

phức hợp giàu dinh dưỡng [26] chứa các thành phần sau:

Bảng 3.2 : Thành phần môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1

Trộn các thành phần, trừ lưu huỳnh và Na2S 9H2O, điều chỉnh pH đến 7,0-7,2

và hấp khử trùng, Trung hòa dịch lưu huỳnh 5% hấp trong nồi khử trùng thêm bột lưu