Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase của vi khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ TRÀ MI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH ĐẠI GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS KODAKARENSIS KOD1” KHÓA LUẬ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ TRÀ MI

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH ĐẠI GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME

AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS

KODAKARENSIS KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2012 - 2016

Thái Nguyên, năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ TRÀ MI

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU VÀ KHUYẾCH GENE TK 1284 MÃ HÓA ENZYME

AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT THERMOCOCCUS

KODAKARENSIS KOD1”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : K44 - CNSH Khóa học : 2012 - 2016 Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Bằng Phương

Thái Nguyên, năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của khoa Khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên Em đã thực tập tốt nghiệp tại Phòng Nuôi Cấy Mô Tế Bào Thực Vật - Khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm- Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài:

“Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase của vi

khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1”

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự nỗ lực của bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của ban giám hiệu Nhà trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, cùng sự tận tình giảng dạy của các thầy cô trong suốt 4 năm học Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa và toàn thể các thầy cô giáo Đặc biệt, em xin được bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn tới thầy giáo TS Phạm Bằng Phương người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn chị Ma Thị Hoàn, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật khoa Công Nghệ Sinh Học và công nghệ thực phẩm, Trường Đại HọcNông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tại đây

Em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, người thân bạn bè đã động viên giúp

đỡ em trong suốt thời gian qua

Do điều kiện và thời gian có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, kính mong các thầy cô đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài của em được hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Trà Mi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Thành phần môi trường 18

Bảng 3.2: Trình tự mồi 18

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 3.4: Chu trình nhiệt PCR 27

Bảng 4.1: Dải nhiệt độ chạy PCR 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Nơi phân lập 4

Hình 2.2: Vi khuẩn T Kodakarensis kod1 5

Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus 5

Hình 2.4: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 7

Hình 2.5: Enzyme protease 10

Hình 2.6: Cấu trúc enzyme 11

Hình 2.7: Sơ đồ phân loại enzyme protease 12

Hình 3.1: Môi trường nuôi cấy phân lập VK 23

Hình 3.2: Phân tử Ethidium bromide 25

Hình 4.1a: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn T Kodakarensis 31

Hình 4.1b: Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số 32

Hình 4.2a: Thiết kế mồi 32

Hình ảnh 4.2b: Kết quả điện di sản phẩm PCR 33

Hình 4.3: Ảnh điện di kiểm tra nhiệt độ gắn mồi PCR 34

:

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

DNA :Axit deoxiribonucleic

ARN : Axit ribonucleic

ARNase : Ribonuclease

dNTP : Deoxynucleoside triphosphate

EDTA : Ethylene diamine tetra – acetic acid

OD : Optical Density (Mật độ quang học)

PCR : polymerase chain reaction

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

TAE : Tris- acetate- EDTA

E.coli : Escherichia coli

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và nội dung của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Nội dung 3

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 4

2.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.2 Phân loại 5

2.1.3 Đặc điểm chung về hệ gen 6

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 9

2.2 Tổng quan về protein của TK 1284 9

2.2.1 Enzyme proteae 9

2.2.2 Hệ thống phân loại enzyme protease 12

2.2.3 Ứng dụng 13

2.2.4 Aminopeptidase do gene Tk1284 của vi khuẩn T Kodakarensi KOD1 mã hóa 15

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15

PHẦN 3: Đối tượng , nội dung và phương pháp nghiên cứu 17

3.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.2.Nội dung 17

3.4 Địa điểm và thời gian tiến hành 18

3.5 Thiết bị 18

3.6 Phương pháp nghiên cứu 19

3.5.1.phương pháp so sánh trình tự protein………21

3.5.2 Phương pháp nuôi cấy 24

3.5.3 Phương pháp tách chiết AND tổng số 234

3.5.5 Phương pháp PCR 26

3.5.4 Phýõng pháp ðiện di 24

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.3 Kết quả kiểm tra nhiệt độ mồi ảnh hưởng đên phản ứng PCR 34

4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 31

4.2 Nhân gene TK 1284 từ chủng vi khuẩn Thermococcus kodakaren KOD1 bằng phản ứng PCR 32

4.4 Kết quả so sánh trình tự TK 1284 với các protein đã biết trên ngân hàng NCBI bằng phần mềm Runblast và bioedit 28

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

I Tài liệu tiếng Việt 1

II Tài liệu tiếng Anh 1

PHỤ LỤC 4

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…[1]

Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300 nghìn tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các ngành khác nhau[1] Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy[2] Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân, được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên Ngành sản xuất các hóa chất công nghiệp dựa trên xúc tác sinh học đã cho thấy có nhiều lợi thế so với tổng hợp hóa học, ví dụ như sản xu ất có chọn lọc các đồng phân quang học hay là sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp các phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu[3] Việc sử dụng enzyme chịu nhiệt như là chất xúc tác khi thiết kế quy trình chuyển hóa, chứa toàn bộ hệ thống enzyme chịu nhiệt, cấu tạo nên chuổi phản ứng mà chúng ta muốn, sẽ làm biến tính các enzyme nội sinh của tế bào và vì thế chúng ta chỉ cần một bước chuẩn bị

để có thể có một hỗn hợp các enzyme chịu nhiệt Thêm vào đó, do đặc tính bền của enzyme chịu nhiệt nên chúng ta có thể hạn chế bất lợi cơ bản của sinh chuyển hóa in vitro, là không có khả năng tổng hợp và tái tạo protein Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (làm đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt,

bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều

hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm từ 20-30 %[1] Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein Đặc biệt là

các vi khuẩn cổ sống môi trường khắc nghiệt, có tính chống chịu với cả nhiệt hay axít và kiềm, là nguồn tạo ra các enzyme có thể hoạt động dưới những điều kiện khắc nghiệt.Những enzyme phát hiện được tạo ra từ các vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt trên 130˚C, có thể tồn tại và phát triển ở những nơi có nồng độ acid cao… [1]với những khả như vậy nó rất có ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học, cho sự phát triển của các ngành sản xuất

Chính vì vậy, việc nghiên cứu tạo enzyme từ vi khuẩn này là cấp thiết, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme protease trong nghiên cứu nói chung và công nghiệp xuất nói riêng là quan trọng và cấp thiết, xuất phát từ lý do trên,

tôi xin tiến hành đề tài: “Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa

enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” hy vọng sẽ khuyếch đại được dòng gene Tk 1284 mã hóa enzyme

aminopeptidase của vi khuẩn T Kodakarensis đáp ứng nhu cầu cần thiết

1.2 Mục đích và nội dung của đề tài

1.2.1 Mục đích

 Nghiên cứu gene Tk 1284 và enzyme peptidase do gen Tk 1284 của

vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa

 Nhân nhanh gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

KOD1 bằng phản ứng PCR

Nội dung 3: Xác định nhiệt độ PCR tối ƣu, cho phản ứng khuyếch đại

gene Tk1284 của vi khuẩn T kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

 Nghiên cứu gene Tk1284 và enzyme peptidase của gen Tk 1284 của

vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa

 Nhân nhanh gene Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đóng góp một phần vào việc nghiên cứu và tìm ra enzyme có khả năng

chịu đƣợc điều kiện khắc nghiệt Là tiền đề tạo dòng enzyme do gene Tk1284

mã hóa của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, từ đó tinh sạch và

kiểm tra hoạt tính enzyme

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1

2.1.1 Nguồn gốc

Thermococcus kodakaraensis là một loài cổ khuẩn ưa nhiệt, trong đó T.kodakarensis KOD1 là chủng được nghiên cứu nhiều nhất trong các chủng của chi Thermococcus[4] Thermococcus kodakaraensis KOD1, đã được

phân lập tại một miệng núi lửa (khí lưu huỳnh trào ra từ một lỗ thủng) trên hòn đảo Kadakara, Nhật Bản[5] Lần đầu tiên phân lập người ta đặt tên là

Pyrococcus sp KOD1, với khả năng chịu được nhiệt độ và các điều kiện khắc

nghiệt của môi trường, tuy nhiên dựa vào hệ thống cây phân loại loài, thì nó

thuộc giống Thermococcus, dựa trên trình tự chuỗi 16S RNA giữa các loài khác nhau và chủng KOD1 là đại diện mới của Thermococcus, được gọi là Thermococcus kodakaraensis KOD1[6]

Hình 2.1: Nơi phân lập

Tế bào T Kodakarensis có đường kính cầu khuẩn không đều kích

thước 1-2µm và có khả năng di chuyển dễ dàng nhờ lông roi[7] Cấu tạo thành tế bào bao gồm: một lớp di-ether, tetra-ether lipids, và lớp glycoprotein

ngoài cùng[7] T Kodakarensis là vi khuẩn yếm khí bắt buộc, dị dưỡng và

phát triển mạnh trên môi trường có sự hiện diện của nguyên tố lưu huỳnh, tạo

khí huydrogen sulfide[8] Trong điều kiện tối ưu thời gian thế hệ của vi khuẩn T.kodakarensis là 40 phút 1 thế hệ[9] Các điều kiện về lưu huỳnh cần cho sự

tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn Trong trường hợp không có lưu huỳnh, hydrogen sẽ được sản xuất thay vì hydrogen sulfide

Hình 2.2: Vi khuẩn T Kodakarensis kod1 2.1.2 Phân loại

Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 được phân loại như sau:

- Loài : Thermococus kodakarensis KOD1

2.1.3 Đặc điểm chung về hệ gen

Kích thước gene T Kodakarensis dài 2.088.737 bp chứa khoảng 2358

gen, toàn bộ trình tự đã được Đại học Kyoto, Nhật Bản giải trình tự, phát hành trên tạp chí khoa học tháng 03 năm 2005, có duy nhất một NST dạng vòng, không có màng nhân, vùng mã hóa protein chiếm 92,1 %, tỉ lệ G-C là 52% với một cụm 16S-23S rRNA[10] Trong tất cả, 46 gen tRNA nằm rải rác trên hệ gen, trong đó tRNA Met và tRNA Trp được dự đoán là chứa trình tự intron[11].Bằng sự kết hợp của mã hóa dự đoán chức năng và so sánh tương đồng, 2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) với chiều dài trung bình của 833 bp,

bao gồm 92% bộ gen tổng thể 77% protein của T kodakarensis protein cho thấy sự tương đồng cao nhất đối với các protein từ lớp Thermococci, bao gồm

240 loại protein được xác định là Thermococcales cụ thể[12]

So sánh với ba bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp Tổng cộng có

2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) đã được xác định[13] Bộ gen chứa bảy gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus Một trong

số protein di truyền cho thấy sự tương đồng cao với nhóm Pyrococcus spp

Sự sắp xếp Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204

của protein khác nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản,

được chia sẻ giữa T kodakaraensis và Pyrococcus spp., còn cho thấy nhiệm

vụ của các protein khác như tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa nucleotide, vận chuyển kim loại ion

Thermococcus kodakaraensis, một chủng của Thermococcales, kỵ khí

dị dưỡng bắt buộc, giống như hyperthermophiles khác phụ thuộc vào sulfur,

T kodakaraensis có thể phân giải proteinaceous chất nền để thu được cacbon

và các axit amin thiết yếu[14] Để làm như vậy, nó sản xuất một số enzyme ngoại bào để thủy phân polypeptide bên ngoài tế bào

Kích thước bộ gen là là 2.088.737 base pair, với 92,1% vùng mã hóa Năng lượng phân giải protein đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp nhanh chóng các protein điều hòa.Sự hiện diện của peptidase phụ thuộc ATP, được thấy trong tất cả các sinh vật nhân sơ: bao gồm hyperthermophiles, bộ gen

đã được giải trình tự Một số peptidase vi khuẩn đã được xác định Trình tự

bộ gen của T kodakaraensis chỉ ra sự hiện diện của hai loại peptidase nội

bào phụ thuộc vào ATP là protease và proteasome[13] Các gen tương ứng với protease là FtsH và CLP

Hình 2.4: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

KOD1

Chú thích:

-Vòng tròn ngoài cùng: bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở

- Vòng tròn thứ 2: dự đoán các vùng mã hóa protein theo chiều kim

+ Màu hồng nhạt: sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa

+ Xanh lá cây: vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể

+ Vàng nhạt: lớp bên ngoài tế bào

+ Xanh da trời: thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa

+ Xanh nhạt: tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất

+ Xanh lam: cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme

+ Màu tím: sản xuất năng lƣợng

+ Tím nhạt: chuyển hóa lipide

+ Màu xám: chức năng chỉ mới đƣợc đề xuất

+ Màu đen: không rõ chức năng

- Vòng tròn thứ 4: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ

(màu đỏ trong vòng thứ 4)

- Vòng tròn thứ 5: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngƣợc chiều

kim đồng hồ (màu xanh vòng tròn thứ 5)

- Vòng tròn thứ 6: dự báo các yêu tố di động theo chiều kim đồng hồ

(màu đỏ vòng thứ 6)

- Vòng tròn thứ 7: dự báo các yếu tố di động theo chiều ngƣợc kim

đồng hồ (màu xanh vòng thứ 7)

- Đường thẳng đứng thể hiện viêc dự đoán gen chuyển và chỉ ra vùng virus liên quan

- Vòng tròn trong cùng: % (G+ C) trong vòng 10 kb và thay đổi gia tăng tới các giá trị cao hơn trong khoảng ít nhất là 38 %

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Thermococcus kodakarensis KOD1, thuộc hyperthermophiles, vi khuẩn yếm khí bắt buộc, nhiệt độ tăng trưởng của Thermococcus khác nhau,

nằm trong khoảng nhiệt độ 60 - 100˚C, nhiêt độ tăng trưởng tối ưu là 95˚C[15] Cũng như các sinh vật biển khác, nồng độ muối cao là cần thiết cho sự tăng trưởng tối ưu, và biện pháp gây ly giải tế bào bằng cách pha loãng nồng độ Một số loài có khả năng sản xuất CO2, H2, và H2S là sản

phẩm của quá trình chuyển hóa và hô hấp, Thermococcus tương tác với các

sinh vật khác thông qua trao đổi chất chuyển hóa nhờ sự hỗ trợ, sự phát triển

của vi sinh vật tự dưỡng, Thermonococcus kodakarensis KOD1 tạo H2 với

việc sử dụng nhiều hydronagene được xem là các biocatalyst tiềm năng cho các phản ứng chuyển nước và khí Nồng độ pH và NaCl cho KOD1 tăng trưởng, biến đổi tương ứng là 7% và 3%

2.2 Tổng quan về protein của TK 1284

2.2.1 Enzyme proteae

- Enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể, có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dal (có kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton), có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất, enzym có bản chất làproteinnên có tất

cả thuộc tính lý hóa của protein Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn, tan trong nước và các dung môi hữu

cơphân cựckhác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực

Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính[1] Môi trường axít hay bazơcũng làm enzym mất khả năng hoạt động

Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành các phân tử acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton[1]

Hình 2.5: Enzyme protease

Cơ chế thủy phân:

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin[16]

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin[1] Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng

về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…)[8] So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất[17]

Hình 2.6: Cấu trúc enzyme

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để

2.2.2 Hệ thống phân loại enzyme protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 2.7: Sơ đồ phân loại enzyme protease

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại[1]:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ

chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin… Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng

kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng[18]

+ Cysteine proteinase: Cá c proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,

bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng[19] Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung

tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính[20]

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo

proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA[19]

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

Trong công nghiệp chế biến thịt: protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm

thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất, tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ) Sử dụng protease để sản xuất dịch

đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân

keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm

để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin)[21] Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao

và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân[22] Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme

là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân Trong chế biến thuỷ sản khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ

Trong công nghiệp sữa: protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A

candidus, P roquerti, B mesentericus,… được dùng trong sản xuất phô mát [

Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy… protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn[23]

2.2.4.peptidase do gene Tk1284 của vi khuẩn T Kodakarensi KOD1 mã hóa

Peptidases là enzyme xúc tác sự phân cắt các axit amin từ các amino của các protein hay peptide Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và được tìm thấy trong nhiều bào quan dưới tế bào, trong bào tương, và là thành phần của màng tế bào Một số peptidases là monome,enzyme khối lượng tương đối cao

(50 kDa) giúp tiêu hóa protein[24] Các aminopeptide của vi khuẩn T kodakarensis KOD1do được phân lập từ những nơi có điều kiện khắc nghiệt

như miệng núi lửa hay ở suối nước nóng hoặc nước biển mặn[25]… nên có hoạt tính tốt, phản ứng chống chịu được trước các điều kiện bất thường,thông thường khi các enzyme để ở nhiệt độ bình thường sẽ mất hoạt tính và hỏng nhưng đối với enzyme này thì nó có khả năng biến đổi để không bị mất hoạt tính và có thể ở để ở nhiệt độ thường trong một khoảng thời gian[26] Mặt khác enzyme aminopaptidase thuộc nhóm serine nên có khả năng hoạt động ở

dải PH rộng và có tính đặc hiệu cơ chất cao T kodakarensis là sinh vật có

cấu tạo đa bội với một số lượng bản sao nhiễm sắc thể khoảng 7- 19 bản sao, tùy thuộc vào giai đoạn tăng trưởng[26]

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Enzyme aminopeptidase của vi khuẩn T kodakaren KOD1 đã biết đến

từ lâu với những đặc điểm vượt trội và có ích trong cả sản xuất và nghiên cứu, tuy vậy nhưng tính đến thời điểm hiện nay, các công trình nghiên cứu trong nước chưa có báo cáo cụ thể nào về enzyme aminopeptidase do gene

Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa, và cũng

chưa có bài báo khoa học trong nước nào cụ thể nói về nghiên cứu[27]

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus, như nghiên

cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

KOD1, của viện nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trường Đại Học Kyoto, thuộc Katsura, Nashikyo- ku, Nhật Bản, tháng 3 năm 2005[24] Nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các chi Thermococcus, bao gồm các vi khuẩn cổ Hyperthermophilic, các chủng của Thermococcus có mặt ở khắp nơi trong

môi trường nhiệt độ cao[28],

Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm vi sinh, trường đại học Wageningen, Phần Lan vào tháng 7 năm

2015 với công trình nghiên cứu về số lượng nhiễm sắc thể của

Thermococcus kodakarensis KOD1[29] Nghiên cứu đặc tính chịu nhiệt ở dải nhiệt độ cao của Lysophospholipase từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 vào năm 2012 do nhóm tác giả Cui, Z., Y Wang, B P

Phạm, F Bình, H Pan, G W Cheong, S Zhang, và B Jia thực hiện[27]

Nghiên cứu so sánh toàn bộ chuỗi gene của vi khuẩn archaeon hyperthermophilic Thermococcus kodakaraensis KOD1 và bộ gen Pyrococcus vào năm 2005 do Fukui, T., H Atomi, T Kanai, R Matsumi, S

Fujiwara, và T Imanaka tiến hành nghiên cứu[28] Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu khác như: phân tích trình tự gene và tính chịu nhiệt ,của các

enzyme chịu nhiệt vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, phân tích trình tự, cấu trúc và khả năng liên kết của enzyme cyclodextrinase[30] ,vv…

đó là một số công trình nghiên cứu đang còn rất nhiều các nhóm tác giả thực

hiện các đề tài nghiên cứu khác nhau Thermococcus kodakarensis KOD1 và

đăng trên các tạp chí khoa học và các công cụ dữ liệu trên NCBI

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Gene TK1284 có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

Nội dung 3: Xác định nhiệt độ PCR tối ưu, cho phản ứng khuyếch đại

gene Tk1284 của vi khuẩn T kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR

Hóa chất điện di:

+ Dung dịch đệm TAE 0.5X: được pha từ dung dịch TAE 50X

+ Agarose 0.8 – 1.5%, loading dye, Ethydium Bromide, thang chuẩn AND

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

3.4 Địa điểm và thời gian tiến hành

- Địa điểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Khoa Công Nghệ Sinh học và Công Nghệ Thực Phẩm

- Địa chỉ : Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian tiến hành: 14/11/2015- 14/5/2016

3.5 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng thuộc phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ thực phẩm – Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên bao gồm:

 Máy khuấy từ

 Pipet Man các loại

 Máy đo OD (phòng vi sinh)

- Gene Tk 1284 đƣợc so sánh trình tự gene với các gene của các chủng trong

loài và gần loài bằng phần mềm tin sinh học từ đó đƣa ra đƣợc cây phân loại loài

- Sử dụng công cụ online NCBI tìm gene Tk 1284 và sử dụng công cụ

RUNBLAST so sánh trình tự gene với ngân hàng gene, sau đó lấy 4

chủng bất kỳ trong so sánh runblast đi so sánh protein với Tk1284 bằng

TCACCTAAGAAGCTTGACGAACTCTCTCATCCAGGCGTACAGGTCCCCTGGGTGCCTTGAACTGACCCAGTTTCCGTCAA

CGACGACCTCCGCGTCAATCCACTCGGCGCCAGCGTTCTTCACGTCGTCCCTGATGGTTACCGTGCTCGTGCCCTTCCTT

CCCTTCAACACGCCGGCGGAGATGAGTATCTGCGGCCCGTGGCAGATGCTTGCAACTGGCTTTCCGTCCTCGAACATCTT

CTTCGTTATCGCGACGGCCTTTTCGTTCAGCCTGACGATCTCCGGTGCCCTTCCTCCAGGGAGAACCAGCGCGTCGAACT

CGTCCGGATCAACCTCGTCAAAGGCAAGGTCAACGTTGACCGTGTAGCCGTGCTTGCCCGTTATCTTGCCCCTCTGGAAG

CTGGCGACATAGACTTCATGGCCCTCTTCCTTGATCCTGTGGAGAGGATATATCAGCTCAAGGTCTTCAAAACCGTCAGC

ACTCAGAATCAAGACCTTCAT

>gi|1005657440|gb|CP014750.1|:614405-614905 Thermococcus

peptonophilus strain OG-1, complete genome

TCACTTCAAAAGCCTGATGAACTCCCTCATCCAGGCGTACAGGTCCCCTGGATGCCTTGAGCTGACCCAGTTTCCGTCAA

CGACGACCTCTGCATCAATCCACTCGGCGCCAGCGTTCTTCACGTCGTCCCTGATGGTTACCGTGCTCGTGCCCTTCCTC

CCCTCCAACACGCCGGCGGAAATGAGTATCTGCGGCCCGTGGCAGATGCTTGCAACTGGCTTTCCGTCCTCGAACATCTT

CTTCGTTATTGCGACGGCCTTCTCGTTCAGCCTGACGATCTCCGGTGCCCTTCCTCCCGGGAGAACCAGCGCGTCGAACT

CGTCTGGATCAACCTCGTCAAAGGCAAGGTCAACGTTGACCGTGTAGCCATGCTTGCCCGTTATCTTGCCCCTCCGGAAG

CTGGCGACGTAGACTTCATGGCCCTCTTCCTTGATCCTGTGGAGGGGATATATCAGCTCAAGGTCTTCAAAACCGTCAGC

ACTCAGAATCAAGACCTTCAT

>gi|340808746|gb|CP002920.1|:1695210-1695710 Thermococcus sp 4557, complete genome

ATGAGGGTGCTGTTTCTGAGCGCCGACGGTTTCGAGGACCTGGAGCTTATATACCCCCTCCACAGGCTCAGGGAGGAGGG

GCACGAGGTCTACGTGGCGAGCTTCGAGAGGGGCAAGATAACCGGCAAGCACGGCTACTCCGTCGAGGTTCAGCTGGCGT

TTGAAGAGGTTGACCCGGACGAGTTCGACGCCCTCGTTCTGCCCGGGGGAAAGGCGCCCGAGATAGTCAGACTCAACGAG

AAGGCCGTTGAGATAACCCGGAGGATGTTCGAGGCAGGAAAGCCGGTGGCGAGCATCTGTCACGGCCCGCAGATACTCAT