Nghiên cứu bệnh viêm ruột hoại tử ở đàn gà của trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên (thuộc Trung tâm Nghiên cứu gia cầm Thụy Phương) và thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh

Trong số các bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi gia cầm có bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Clostridium perfringens Cl.. vào đường tiêu hoá của gà và gây bệnh, môi trườ

NGUYỄN DUY TRANG

NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ

Ở ĐÀN GÀ CỦA TRẠM NGHIÊN CỨU CHĂN NUÔI GÀ PHỔ YÊN (THUỘC TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU GIA

CẦM THỤY PHƯƠNG) VÀ THỬ NGHIỆM

PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Thái Nguyên - 2017

NGUYỄN DUY TRANG

NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ

Ở ĐÀN GÀ CỦA TRẠM NGHIÊN CỨU CHĂN NUÔI GÀ PHỔ YÊN (THUỘC TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU GIA

CẦM THỤY PHƯƠNG) VÀ THỬ NGHIỆM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả trong luận văn này là trung thực, chính xác và chưa được sử dụng để bảo vệ ở bất kỳ một học vị nào; Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc, tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Duy Trang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được

sự chỉ bảo tận tình của cô giáo hướng dẫn: GS TS Nguyễn Thị Kim Lan Tôi

xin chân thành cảm ơn sự chỉ bảo tận tình của cô;

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Nga, người đã trực tiếp hướng

dẫn tôi trong quá trình thực tập tại Trạm Nghiên cứu Chăn nuôi gà Phổ Yên; Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quý Khiêm, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thuỵ Phuơng đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài;

Phòng Đào tạo - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn;

Sự đóng góp to lớn trong đào tạo của tập thể các thầy cô giáo, sự góp ý chân thành và giúp đỡ nhiệt tình của các nhà khoa học, bạn bè đồng nghiệp để tôi nâng cao được trình độ trong quá trình học tập và thực hiện đề tài;

Xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Duy Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu: 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

1.1.1 Hệ thống vi sinh vật trong đường tiêu hoá của gà 3

1.1.2 Một số đặc tính của vi khuẩn Clostridium perfringens và bệnh do vi khuẩn này gây ra 4

1.1.3 Hiểu biết về bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Cl perfringens gây ra 14

1.1.4 Hiểu biết về một số bệnh ở gà thường ghép với NE 16

1.1.5 Cơ chế tác dụng của một số kháng sinh 22

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 24

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 24

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 25

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu 26

2.4 Nội dung nghiên cứu 27

2.4.1 Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do Cl perfringens gây ra tại Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên 27

2.4.2 Theo dõi triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của bệnh viêm ruột hoại tử ở đàn gà 27

2.4.3 Phân lập và giám định vi khuẩn Cl perfringens từ gà bệnh 27

2.4.4 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do Cl perfringens gây ra 27

2.5 Phương pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y 27

2.5.2 Phương pháp lấy mẫu 27

2.5.4 Xác định số lượng vi khuẩn trong 1g phân 29

2.5.5 Phương pháp giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được 30

2.5.6 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Cl perfringens phân lập được 31

2.5.7 Phương pháp xác định gen mã hóa độc tố và định typ vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 33

2.5.8 Phương pháp điều trị cho gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Cl perfringens 36

2.5.9 Phương pháp xử lý số liệu 37

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả theo dõi tình hình bệnh viêm ruột hoại tử do Cl perfringens gây ra ở đàn gà nuôi tại Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên 38

3.1.1 Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết theo lứa tuổi gà 38

3.1.2 Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết theo giống gà 42

3.1.3 Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết của gà ở các mùa trong năm 46

3.1.5 Tỷ lệ mắc và chết do viêm ruột hoại tử ở gà theo tính biệt 50

3.2 Kết quả theo dõi triệu trứng và bệnh tích đặc trưng của bệnh viêm ruột hoại tử ở đàn gà 51

3.2.1 Tỷ lệ gà có triệu chứng/tổng số gà mắc bệnh 51

3.2.2 Biểu hiện bệnh tích của bệnh viêm ruột hoại tử 53

3.3 Kết quả phân lập và giám định vi khuẩn Cl perfringens từ gà bệnh 55

3.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 55

3.3.2 Xác định số lượng vi khuẩn trong 1 g phân gà 56

3.3.3 Kết quả giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn 58

3.3.4 Kết quả định typ vi khuẩn Cl perfringens bằng kỹ thuật PCR 59

3.4 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 60

3.4.1 Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Cl perfringens 61

3.4.2 Thử nghiệm một số phác đồ điều trị 62

3.4.4 Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh viêm ruột hoại tử cho gà 67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68

1 Kết luận 68

2 Đề nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ARN: Axit ribonucleic

bp: base pair

CAMP: Christie Atkins Munch - Petersen

CRD: Chronic Respiratory Diseases

CW: Clostridium welchii

ADN: Axit deoxyribonucleic

E.coli: Escherichia coli

ELISA: Enzyme - Linked Immuno sorbent Assay EYA: Egg Yolk Agar

FCR: Feed Conversion Rate

NE: Necrotic Enteritis

PCR: Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và động vật 6

Bảng 1.2 Điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn Cl perfringens 7

Bảng 1.3 Các loại độc tố do vi khuẩn Cl perfringens sản sinh ra (Hatheway, 1990) [30] 9

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn 32

Bảng 2.2 Trình tự mồi của phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định gen mã hoá độc tố của các chủng Cl perfringens 34

Bảng 2.3 Thành phần các chất trong phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định gen mã hoá độc tố của các chủng Cl perfringens 35

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định gen mã hoá độc tố của các chủng Cl perfringens 35

Bảng 3.1 Tỷ lệ mắc và chết do bệnh viêm ruột hoại tử theo tuổi gà 38

Bảng 3.2 Tỷ lệ mắc và chết do bệnh viêm ruột hoại tử theo giống gà 43

Bảng 3.3 Tỷ lệ mắc và chết do bệnh viêm ruột hoại tửở các mùa trong năm 46

Bảng 3.4 Tỷ lệ mắc và chết do bệnh viêm ruột hoại tử theo phương thức chăn nuôi 49

Bảng 3.5 Tỷ lệ gà mắc và chết do bệnh viêm ruột hoại tử theo tính biệt 50

Bảng 3.6 Triệu chứng lâm sàng của gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử 51

Bảng 3.7 Bệnh tích của gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử 54

Bảng 3.8 Kết quả phân lập vi khuẩn Cl perfringens 56

Bảng 3.9 Kết quả xác định vi khuẩn trong phân gà 57

Bảng 3.10 Một số đặc tính sinh học của các chủng Cl perfringens 58

Bảng 3.11 Kết quả xác định typ vi khuẩn Cl perfringens bằng PCR 59

Bảng 3.12 Kết quả xác định gen mã hóa độc tố của vi khuẩn

Cl perfringens 60

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 61

Bảng 3.14 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử cho gà trên diện hẹp 63

Bảng 3.15 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử cho gà trên diện rộng 65

Bảng 3.16 Ứng dụng phác đồ có hiệu quả cao trong điều trị bệnh viêm ruột hoại tử cho gà tại trạm 66

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Cl

perfringens 28

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ mắc và chết bệnh viêm ruột hoại tử theo tuổi gà 41

Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ mắc và chết bệnh viêm ruột hoại tử theo giống gà 45

Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ mắc và chết do bệnh viêm ruột hoại tử theo mùa 47

Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ mắc và chết do viêm ruột hoại tử ở gà theo phương thức chăn nuôi 50

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành chăn nuôi cung cấp nguồn thực phẩm quan trọng cho con người, trong đó chăn nuôi gia cầm đóng góp một số lượng thực phẩm lớn do gia cầm

có khả năng sinh trưởng nhanh, thời gian nuôi ngắn Bên cạnh các giống gà nội như gà Ri, gà Mía, gà Hồ, gà Đông Tảo trong những năm qua nước ta

đã nhập thêm một số giống gà có năng suất, chất lượng cao như gà Isa, Sasso SA31L, Lương Phượng, Hubbard Redbro Tuy nhiên, các giống gà nhập nội đòi hỏi cao về điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng

Sự phát triển nhanh chóng của ngành chăn nuôi gia cầm dẫn đến những khó khăn về an toàn sinh học, vệ sinh phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi Để chăn nuôi gia cầm đạt hiệu quả, người chăn nuôi phải nâng cao hơn nữa chất lượng chăn nuôi, tăng cường khả năng phòng chống dịch bệnh Dịch bệnh là nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi và ảnh hưởng đến sức khoẻ cộng đồng Trong số các bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi gia cầm có bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn

Clostridium perfringens (Cl perfringens) gây nên

Bệnh viêm ruột hoại tử trên gà được Parish mô tả lần đầu tiên vào năm

1961, do vi khuẩn có tên là Clostridium welchii (hay Cl perfringens) gây ra Sau đó, bệnh được phát hiện ở hầu hết các nước có nuôi gà Cl perfringens là

trực khuẩn gram dương, yếm khí, sinh nha bào, có khả năng sản sinh độc tố Đến nay, đã xác định được chính xác 14 loại độc tố, có thể gây nên 25 loại bệnh khác nhau, trong đó có bệnh viêm ruột hoại tử trên gà

Ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu về vi khuẩn Cl

perfringens và bệnh do vi khuẩn này gây nên, tuy nhiên các tác giả tập trung

nghiên cứu trên gia súc (trâu, bò, bê, nghé, dê, lợn), chưa có nghiên cứu nào

đầy đủ về tình hình bệnh do vi khuẩn Cl perfringens gây ra trên đàn gà

Theo Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy (2012), viêm ruột hoại tử gây thiệt hại lớn cho sức khỏe của gia cầm Thể bệnh lâm sàng rất ngắn, gà chết nhanh; thường gặp ở gà broiler (2 - 5 tuần tuổi) và gà tây (7 - 12 tuần tuổi), nhưng cũng có thể xảy ra ở gà hậu bị và gà

đẻ Vi khuẩn Cl perfringens cũng có thể gây bệnh cận lâm sàng ở ruột và gan được gọi là: “Bệnh viêm ruột cận lâm sàng và bệnh viêm gan do Cl

perfringens”

Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên, nằm trên địa bàn xã Đắc Sơn, Phổ Yên, Thái Nguyên Những năm gần đây chúng tôi cũng đã gặp nhiều trường hợp gà có những triệu chứng, bệnh tích của bệnh viêm ruột hoại tử, gây ảnh hưởng không nhỏ tới sức sản xuất của đàn gia cầm của trạm

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

bệnh viêm ruột hoại tử ở đàn gà của trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên (thuộc Trung tâm Nghiên cứu gia cầm Thụy Phương) và thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh”

2 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định vai trò gây bệnh của trực khuẩn Cl perfringens trên đàn gà

- Xây dựng biện pháp phòng trị bệnh viêm ruột hoại tử do Cl

perfringens cho đàn gà

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Đây là công trình nghiên cứu tương đối đầy đủ về vi khuẩn Cl

perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử trên đàn gà nuôi tại trạm nghiên cứu

chăn nuôi gà Phổ Yên Là cơ sở khoa học đề xuất các biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả, góp phần phát triển chăn nuôi gà theo phương thức chăn nuôi công nghiệp ở các địa phương

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Hệ thống vi sinh vật trong đường tiêu hoá của gà

Thông thường khi gà mới nở ra cho đến 24 giờ thì không có vi sinh vật trong đường tiêu hoá, nhưng khi gà tiếp xúc với môi trường bên ngoài như thức

ăn, nước uống, không khí thì vi sinh vật bắt đầu xâm nhập vào hệ tiêu hoá của gà

Số lượng vi sinh vật như E coli, cầu trực khuẩn và các vi sinh vật khác

tăng lên rất nhanh trong tá tràng và manh tràng Vài giờ sau khi ăn đã tìm thấy

vi khuẩn Lactobacillus trong đường tiêu hoá, đến 3 ngày tuổi thì số lượng các

vi khuẩn này tăng lên rất nhanh

Bình thường trong hệ tiêu hoá của gà có trạng thái cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn gây bệnh, khi gặp các yếu tố bất lợi như stress (vận chuyển, thay đổi thức ăn đột ngột, quá nóng hoặc quá lạnh, gà đẻ đang ở giai đoạn đẻ nhiều ) làm giảm sức đề kháng của cơ thể, phá vỡ sự cân bằng, các

vi khuẩn gây bệnh tăng nhanh về số lượng và độc lực và gây bệnh cho gà Ngoài yếu tố stress do tiểu khí hậu chuồng nuôi bị ô nhiễm nặng làm cho mầm bệnh phát triển mạnh, thông qua thức ăn, nước uống, không khí vào đường tiêu hoá của gà và gây bệnh, môi trường bị ô nhiễm cũng làm cho nồng

độ các khí độc NH3 và H2S tăng cao trong thời gian dài, làm sức đề kháng cơ thể gà giảm, là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn có hại gây bệnh

Khí Amoniac sinh ra do sự biến đổi của axit uric có trong phân gà dưới

sự tác động của vi khuẩn Bacteria trong vật liệu lót nền, nồng độ khí amoniac lớn hơn 20 ppm có thể kích thích niêm mạc phế quản của gà và dễ gây ra:

- Bệnh đường hô hấp như: ND, CRD, IB

- Tạo cho E coli tăng lên tới mức gây viêm túi khí

- Gà chậm lớn, chỉ số tiêu tốn thức ăn (FCR) tăng

- Viêm mắt gà

Nồng độ Amoniac và H2S cao sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới chỉ tiêu kỹ thuật cũng như chỉ tiêu kinh tế của gà đẻ Từ những nguyên nhân gây dẫn đến hiện tượng loạn khuẩn ở đường ruột gà, dẫn đến ỉa chảy

Các biện pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh:

- Vệ sinh môi trường nuôi sạch sẽ, thoáng mát về mùa hè, kín về mùa đông, tránh gió lùa, vệ sinh thức ăn nước uống, điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm thích hợp

- Không thay đổi khẩu phần ăn và phương thức cho ăn đột ngột

- Tăng cường sức đề kháng cho gà bằng cách thường xuyên bổ sung các vitamin, axit amin, khoáng cần thiết phù hợp

- Sử dụng kháng sinh để điều trị

- Tăng cường tiêu hoá bằng cách bổ sung các men có chứa các enzym

tiêu hoá hoặc các men vi sinh có chứa Lactobacillus

- Sử dụng một số chế phẩm sinh học có lợi cho đường tiêu hoá, ức chế vi khuẩn gây bệnh, tạo điều kiện thuận lợi tối ưu cho vi khuẩn có lợi phát triển

1.1.2 Một số đặc tính của vi khuẩn Clostridium perfringens và bệnh do vi khuẩn này gây ra

1.1.2.1 Giới thiệu chung về giống Clostridium

Giống Clostridium gồm những trực khuẩn yếm khí, bắt màu gram

dương, có kích thước 0,3 - 1,3 x 3 - 10 μm (Quinn và cs, 1999) [36] Vi khuẩn

có khả năng hình thành nha bào và nha bào thường lớn hơn bề ngang của vi

khuẩn Chỉ riêng loài Cl spiroform có hình hơi cong hoặc hình xoắn ốc, còn

tất cả các loài gây bệnh trong giống Clostridium đều có dạng trực khuẩn

thẳng Vi khuẩn sau khi hình thành nha bào hoặc trong canh trùng nuôi cấy lâu thường có xu hướng khó bắt màu Trong khi hầu hết các loài trong giống

Clostridium đều có khả năng di động nhờ lông rung thì Cl perfringens là loài

duy nhất không di động, có hình thành giáp mô, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoặc kiềm, kích thước nha bào lớn hơn chiều ngang thân vi khuẩn nên thường làm biến dạng vi khuẩn, thường nằm ở giữa hoặc gần ở 1 đầu (Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2001) [18] Trong thực tế nha bào của 1 số chủng có sức đề kháng cao với nhiệt độ, đun sôi ở 100oC trong vòng hơn 1 giờ mới bị vô hoạt (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976) [12]

Vi khuẩn Clostridium có khả năng lên men đường, phản ứng oxidase và

catalase âm tính Yêu cầu mức độ yếm khí tuyệt đối thay đổi tuỳ theo loài, nhưng hầu hết đều thích hợp phát triển trong điều kiện môi trường có 2 - 10%

CO2, pH gần trung tính và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC Các môi

trường nuôi cấy vi khuẩn Clostridium thường được bổ sung amino acid,

carbohydrate, vitamin và máu hoặc huyết thanh

Vi khuẩn Clostridium phân bố rộng rãi khắp nơi trên thế giới, thường có

mặt trong đất, nước và cát; một số loài hoặc một số chủng chỉ có ở các vùng địa lý nhất định Nhiều loài gây bệnh tồn tại trong đường tiêu hoá của người

và động vật, chúng thường gây nhiễm trùng từ bên trong Các loài khác phân

bố trong đất và gây nhiễm trùng từ ngoài qua các vết thương hoặc qua đường

tiêu hoá Hiện đã có trên 40 loài Clostridium được công bố là nguyên nhân

gây ra nhiều bệnh ở người, gia súc và gia cầm Đã tóm tắt các bệnh do vi

khuẩn Clostridium gây ra trong bảng 1.1 (Quinn và cs, 1999) [36]:

Bảng 1.1 Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và động vật

Vi khuẩn Clostridium Loài vật mắc bệnh Tên bệnh

CLOSTRIDIUM GÂY ĐỘC TỐ THẦN KINH

Clostridium tetani Ngựa, loài nhai lại và các động vật

Clostridium botulinum (typ

A - F) Nhiều loài động vật và người Trúng độc thịt

Clostridium argentinense (C

CLOSTRIDIUM GÂY ĐỘC MÔ BÀO

Clostridium chauvoei Bò, cừu (lợn) Ung khí thán (blackleg)

Bò và cừu Hoại thư sinh hơi typ B Cừu, (bò) Bệnh đen (Viêm gan hoại tử)

Clostridium haemolyticum

(C novyi typ D) Bò, (cừu) Chứng đái ra huyết sắc tố

Clostridium sordellii Bò, cừu, ngựa Hoại thư sinh hơi

Clostridium colinum Chim cảnh, gà con và gà tây Viêm loét ruột

BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ RUỘT HUYẾT

Bê non và ngựa non Nhiễm độc tố ruột huyết typ C

Cừu trưởng thành Run cơ Lợn choai, cừu, bê, ngựa con Nhiễm độc tố ruột huyết

typ D Cừu (trừ con sơ sinh), dê, bê Bệnh nhũn thận

typ E Bê và cừu (ít gặp) Nhiễm độc tố ruột huyết

BỆNH DO CLOSTRIDIUM GÂY RA SAU KHI SỬ DỤNG KHÁNG SINH

Clostridium spiroform

Thỏ Viêm ruột có màng nhày Thỏ và chuột lang Tiêu chảy sau khi sử dụng kháng sinh Ngựa con và lợn Viêm ruột non

Clostridium difficile Người, chuột hamster, thỏ, chuột lang Viêm ruột non do sử dụng kháng

sinh Chó, ngựa con, lợn, động vật thí nghiệm Tiêu chảy

1.1.2.2 Vi khuẩn Clostridium perfringens

Clostridium perfingens (Cl perfingens) còn có tên là Clostridium welchii

được Welch và Natan phân lập từ năm 1892 trong tổ chức của xác người chết

(Nguyễn Lân Dũng và cs, 1998) [1].Với tên gọi lúc đầu là Bacillus

aerogenescapsulatus Sau này, vi khuẩn được đổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes, Bacillus perfringens, Bacterium welchii và Clostridium welchii

Mặc dù tên gọi không chính thức là C welchii, nhưng được sử dụng từ năm

1939 và hiện nay vẫn có thể tìm thấy trong cách viết của người Anh Từ năm

1980, tên khoa học chính thức của vi khuẩn là Clostridium perfringens (Cl

perfringens) (Hatheway, 1990) [30] Vi khuẩn phân bố rộng rãi trong đường

tiêu hoá của người và gia súc, môi trường (đất, nước, phân, thức ăn ) và là nguyên nhân gây nhiều bệnh như hoại thư sinh hơi, ngộ độc thực phẩm, bệnh nhiễm độc tố ruột huyết, viêm ruột hoại tử và hội chứng đột tử

* Hình thái và tính chất nuôi cấy

Cl perfringens là vi khuẩn yếm khí triệt để, mọc tốt trên các môi trường

yếm khí thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp là 7,2 - 7.6 (Lê Thị Thiều Hoa, 1991) [7]

Vi khuẩn không di động, hình thành giáp mô trong mô bào; là trực khuẩn

to, thẳng, hai đầu tròn, đứng riêng lẻ hoặc thành đôi, có kích thước từ 0,6 - 0,8

x 2 - 4 μm, bắt màu gram dương (Quinn và cs, 1999) [36] Một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn này được tóm tắt trong bảng 1.2 (dẫn theo Annamari Heikinheimo, 2008) [23]

Bảng 1.2 Điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn Cl perfringens

Điều kiện nuôi cấy Tối thiểu Thích hợp Tối đa

Khi nuôi cấy trên các môi trường, tính chất mọc của vi khuẩn có đặc điểm:

- Môi trường nước thịt gan yếm khí: sau 24 giờ nuôi cấy trong điều kiện yếm khí ở 37oC, vi khuẩn phát triển mạnh, làm đục môi trường và sinh hơi

- Môi trường thạch máu trong điều kiện yếm khí ở 37oC: sau khi nuôi

cấy Cl perfringens từ 18 - 24 giờ, lấy đĩa ra khỏi tủ ấm và để ở nhiệt độ

phòng trong 2 giờ để có thể quan sát đầy đủ đặc tính dung huyết của vi khuẩn

Hình thái đặc trưng của vi khuẩn Cl perfringens trên môi trường thạch máu là

hình thành các khuẩn lạc tròn, trơn bóng, lấp lánh, mờ đục, có vùng dung huyết đôi đặc trưng (quan sát rõ hơn khi dùng máu cừu hoặc thỏ)

- Môi trường thạch lòng đỏ trứng (Egg Yolk Agar - EYA): vi khuẩn Cl

perfringens với hoạt tính của men lecithinase sẽ tạo thành một vùng trắng đục

xung quanh khuẩn lạc do men này tác động lên chất lecithin có trong môi

trường Những chủng vi khuẩn Cl perfringens sản sinh men lipase sẽ tạo nên

một lớp sáng như ngọc trai hoặc óng ánh nhiều màu xung quanh khuẩn lạc; trong một số trường hợp còn lan ra cả phần thạch ở xung quanh

- Môi trường Litmus milk: Litmus milk là môi trường dùng để giữ và nuôi cấy vi khuẩn sinh acid lactic Đây là môi trường đặc biệt dùng để xác định một số đặc tính của vi khuẩn: lên men đường lactose, phân giải casein và đông vón casein Chất chỉ thị pH là Litmus được bổ sung vào môi trường Sữa có đường lactose và 3 loại protein chính: casein, lactalbumin và

lactoglobulin Vi khuẩn Cl perfringens có khả năng lên men đường lactose

trong môi trường, sinh acid làm đông vón casein, màu môi trường chuyển sang màu hồng Khi sinh hơi, cục đông vón sẽ bị tan ra

* Độc tố của vi khuẩn Cl perfringens

Qua nghiên cứu, người ta xác định được Cl perfringens có khả năng sản

sinh ra nhiều độc tố và các enzim Mỗi loại độc tố do chúng sinh ra có vai trò

xác định các chủng gây bệnh của Cl Perfringens (Bormann et al, 2002) [24], (Cadman, 1994), (Garmory, 2000) [25] [28]

Đến nay, người ta đã xác định được chính xác 14 loại độc tố của vi khuẩn có thể gây nên 25 loại bệnh khác nhau (Bảng 1.3) (Hatheway, 1990) [30] Có bốn loại độc tố chính thường gặp phổ biến nhất là alpha (α, cpa),

beta (β, cpb), epsilon (ε, etx) và iota (ι, iA)

Bảng 1.3 Các loại độc tố do vi khuẩn Cl perfringens sản sinh ra

Theta Gây dung huyết (không bền với

Độc tố ruột Gây độc ruột, độc tế bào + NT + + NT

Ghi chú: (+): sản sinh bởi tất cả các chủng; (±): sản sinh bởi một số chủng; (-): không chủng nào sản sinh độc tố; (NT): chưa nghiên cứu đầy đủ với các chủng sản sinh độc tố

- Độc tố Alpha (α toxin): có bản chất là một lecithinase (phospholipase C), tấn công vào màng tế bào, làm cho tế bào bị phá huỷ và chết Độc tố α là độc tố gây chết, hoại tử (được coi là nguyên nhân gây hoại tử cơ trong bệnh hoại thư sinh hơi), có khả năng dung huyết, ảnh hưởng đến chức năng tim (gây giảm huyết áp và rối loạn nhịp tim làm cho con vật bị shock) Độc tố α

có kích thước phân tử 43 kDa, được mã hoá bởi gen plc (hay cpa) gồm 399 axit amin, điểm đẳng điện pH 5,4 (Jolivet - Reynaud và cs, 1988) [32] Độc tố

α được sản sinh bởi tất cả các typ Cl perfringens, hình thành vùng dung huyết

không hoàn toàn khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu

- Độc tố Beta (β toxin) (còn được gọi là độc tố β-1): là một trong số 4

độc tố chính có khả năng gây chết và hoại tử được sản sinh bởi vi khuẩn Cl

perfringens typ B và C Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh được độc

tố β là nguyên nhân gây viêm ruột hoại tử xuất huyết Độc tố β có kích thước phân tử 40 kDa, được mã hoá bởi gen cpb, điểm đẳng điện pH 5,6 (Sakurai và Fujii, 1987) [38] Các thông số của độc tố β gần giống với các thông số của độc tố α nên việc phân biệt và tách riêng hai độc tố này rất khó Độc tố β bị phá huỷ bởi trypsin; điều này giải thích tại sao con non dễ mắc bệnh do typ B

và typ C vì trong sữa đầu có anti - trypsin (làm vô hoạt trypsin của dịch tụy) khiến cho độc tố không bị phá huỷ và gây nên bệnh

Hiện nay, người ta quan tâm nhiều đến vai trò gây bệnh của độc tố β-2

có kích thước phân tử 28 kDa, điểm đẳng điện pH từ 5,2 - 5,4; được mã hoá

bởi gen cpb2 và phát hiện lần đầu tiên năm 1997 từ chủng Cl perfringens

CWC245 thuộc typ C gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con (Gibert và

cs,1997) [29] Tất cả 5 typ Cl perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố

này Cũng giống như độc tố β, độc tố β-2 gây hoại tử, xuất huyết Vai trò gây bệnh của độc tố β-2 tuy chưa được hiểu biết đầy đủ, nhưng chắc chắn sự xuất hiện của độc tố sẽ khiến cho bệnh tích của bệnh thêm trầm trọng; đó có thể do hậu quả của sự kết hợp gây bệnh giữa hai độc tố α và β-2 (Ceci và cs, 2006) [26]

- Độc tố Epsilon (ε toxin): do vi khuẩn Cl perfringens typ B và D sản sinh

ra, là một protein kích thước phân tử 34,25 kDa, được mã hoá bởi gene tx, gồm

311 axit amin (trích theo Hatheway, 1990) [30] Độc tố ε được hình thành là một tiền độc tố (prototoxin) tương đối không độc và được hoạt hoá bởi các

protease Khi xử lý độc tố ε của Cl perfringens với protease (ví dụ trypsin,

chymotrypsin), sẽ cắt đứt liên kết peptit tại đầu carboxyl và amino, khiến cho độc tố được hoạt hoá (tuy nhiên, người ta cho rằng việc cắt bỏ peptit đầu carboxyl có vai trò chính cho sự hoạt hoá độc tố (Minami và cs, 1997) [34] Độc tố ε tác động trước tiên đến hệ tiêu hoá làm tăng tính thấm thành mạch, khiến cho sự hấp thu độc tố vào máu tốt hơn Sau khi xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn, độc tố tác động làm thận bị sưng, sung huyết; phổi bị phù thũng; màng bao tim có nhiều dịch; ngoài ra còn gây tổn thương hệ thần kinh trung ương

- Độc tố Iota (ι toxin): độc tố được phát hiện lần đầu tiên từ một con bê

bị chết sau 12 giờ có biểu hiện viêm ruột và trúng độc Độc tố ι không chỉ

được sản sinh bởi Cl perfringens typ E mà còn do Cl spiroforme và Cl

difficile Cấu trúc của độc tố gồm hai tiểu phần protein độc lập gắn với nhau

bởi liên kết đồng hoá trị hoặc cầu nối disulfide: một là tiểu phần kết gắn (iotab - Ib) và tiểu phần kia mang hoạt tính men ADP - ribosylase (iota a - Ia)

Cả hai tiểu phần này đều cần cho hoạt tính sinh học của độc tố Tiểu phần Ia được mã hoá bởi gen iap, kích thước phân tử 47,5 kDa, điểm đẳng điện pH 5,2; tiểu phần Ib được mã hoá bởi gen ibp, kích thước phân tử ~ 100 kDa, điểm đẳng điện pH 4,2 (Stiles và Wilkins, 1986) [40]

- Độc tố ruột (enterotoxin): độc tố ruột của Cl perfringens là một protein

được mã hoá bởi gen cpe, kích thước phân tử 35 kDa, gồm 309 axit amin, điểm đẳng điện pH 4,3 (Richardson và Granum, 1985) [37] Độc tố ruột của

Cl perfringens ( Cl perfringens enterotoxin - CPE) chỉ được sản sinh trong

quá trình vi khuẩn hình thành nha bào Hoạt tính của độc tố ruột sẽ tăng lên gấp 3 lần nếu như được xử lý với trypsin

Độc tố ruột được sản sinh nhiều nhất ở các chủng Cl perfringens typ

A; ngoài ra còn có các chủng typ C và typ D Chỉ một số ít các chủng thuộc typ B và E có khả năng sản sinh độc tố ruột, còn hầu hết âm tính (Mc Donel,1980) [33] Cơ chế tác động của độc tố ruột có liên quan đến sự kết gắn của độc tố với các receptor trên bề mặt tế bào biểu mô ruột Sự gắn kết này giúp cho phân tử độc tố gắn vào màng tế bào (nhưng không xâm nhập vào tế bào) Sự thay đổi các ion sẽ ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và sinh tổng hợp của tế bào Nồng độ ion Ca2+ nội bào tăng lên, làm cho tính thấm thành mạch tăng, nước và các ion khác thoát ra gây ỉa chảy, (Hồ Văn Nam

và cs, 1997) [14]

- Các độc tố phụ của Cl perfringens:

+ Độc tố Delta (δ toxin): là độc tố dung huyết sản sinh bởi các chủng Cl

perfringens typ B và C Kích thước phân tử 42 kDa, điểm đẳng điện pH = 9,1

Độc tố có khả năng dung huyết mạnh hồng cầu cừu, dê và lợn; hầu như không gây dung huyết hồng cầu người, ngựa, thỏ, chuột và các loài động vật có vú khác (Alouf và Jolivet - Reynaud, 1981) [21]

+ Độc tố Theta (θ toxin): hay còn gọi là perfringolysin O, là một độc tố dung giải tế bào phụ thuộc cholesterol (cholesterol - dependent cytolysin), được mã hoá bởi gen pfoA, kích thước phân tử 51 kda Các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng của độc tố này gây nên một vùng dung huyết dạng

β xung quanh khuẩn lạc khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu (Hatheway, 1990) [30] Độc tố θ gây chết chuột, thông thường có LD50 khoảng 1 μg/chuột Nguyên nhân gây chết có thể được giải thích là do suy tim

vì độc tố có khả năng sản sinh ra các chất như yếu tố đông máu (Stevens và cs,1988) [39] Đồng thời, người ta cũng chứng minh được độc tố này là nguyên nhân gây tắc mạch, đông máu, giảm oxy mô bào

+ Neuraminidase: được coi là yếu tố gây bệnh của nhiều loại vi sinh vật Kích thước phân tử của độc tố neuraminidase là 64 kDa, điểm đẳng điện pH dao động từ 4,7 - 5,4 Độc tố có tác dụng gây ngưng kết hồng cầu,

làm tăng độ nhớt của máu, dẫn đến đông máu trong mao mạch (Mainil và

cs, 2006) [31]

+ Ngoài các độc tố đã trình bày ở trên, Cl perfringens còn có khả năng

sản sinh ra một số loại độc tố khác như: lamda-toxin (protease, do gen làm mã hoá); kappa - toxin (collagenase, do gen col A mã hoá); mu-toxin (hyaluronidase, do gen nag mã hoá); các độc tố nu-toxin, eta-toxin, phi-toxin

và urease (Frey và Vilei, 2002) [27] Gần đây nhất, nhóm các nhà khoa học

Nhật Bản đã tìm ra độc tố TpeL (toxin Cl perfringens large cytotoxin) do Cl

perfringens typ C sản sinh ra (Amimoto và cs, 2007) [22]

* Các typ của vi khuẩn Cl perfringens

Năm 1931, Wilson căn cứ vào khả năng trung hoà trên chuột của huyết thanh kháng độc tố với độc tố có trong chất lọc canh trùng nuôi cấy

vi khuẩn, đã chia Cl perfringens thành 4 typ (toxino typ) A, B, C và D

(dẫn theo Hatheway, 1990) [30], trong đó:

Kháng huyết thanh typ A chỉ trung hoà độc tố typ A

Kháng huyết thanh typ B trung hoà độc tố cả 4 typ A, B, C và D

Kháng huyết thanh typ C chỉ trung hoà độc tố typ A, B và C Theo Trần Thị Hạnh và cs (1996) [3] các trường hợp gây viêm ruột hoại tử trên hươu,

nai ở nước ta chủ yếu là do Cl perfringens typ C gây ra

Kháng huyết thanh typ D trung hoà độc tố typ A và D

Năm 1943, typ thứ 5 (typ E) được Bosworth phát hiện khi chủng vi khuẩn phân lập từ bê sản sinh độc tố có khả năng gây chết nhưng không bị trung hoà bởi kháng độc tố của cả 4 typ trên Kháng huyết thanh typ E có khả năng trung hoà độc tố typ A nhưng không trung hoà độc tố của typ B, C và D Ông đã đề nghị gọi độc tố do typ E sản sinh là iota (dẫn theo Hatheway, 1990) [30]

Typ F (được coi là subtyp của typ C) cũng đã được xác định từ chủng vi khuẩn phân lập tại Đức từ một vụ dịch viêm ruột hoại tử ở người Vi khuẩn này sản sinh độc tố α và β; do đó về căn bản có thể xếp loại vào typ C; tuy

nhiên khác các chủng vi khuẩn thuộc typ C ở đặc tính không bền với nhiệt (Vance, 1967) [41] và không sản sinh 3 loại độc tố phụ (delta, theta và kappa) Sự khác biệt này không thể giải thích được và do vậy cũng không được sử dụng để xác định một chủng mới (dẫn theo Hatheway, 1990) [30]

1.1.3 Hiểu biết về bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Cl perfringens gây ra

Viêm ruột hoại tử là một bệnh truyền nhiễm thường xuất hiện kế phát sau

các bệnh nguyên phát hoặc stress do vi khuẩn gram dương Cl perfringens gây nên

Bệnh có tên khoa học: Tiếng Anh là Necrotic Enteritis (NE), tiếng La tinh là Enteritis Necroficans (EN) Bệnh có thể xuất hiện ở gà với mọi lứa tuổi nhưng thường gặp ở gà sau 3 tuần tuổi trở lên

Bệnh gây thất thoát khoảng 4 - 8% số đầu con, giảm khả năng tăng trọng, tiêu tốn thức ăn cho 1kg tăng khối lượng cao

1.1.3.1 Dịch tễ bệnh NE

Vi khuẩn Cl perfringens là một loại vi khuẩn yếm khí sống trong đường

ruột và ít gây bệnh cho gà, nếu không có các yếu tố thúc đẩy

Các yếu tố nguy cơ stress có hại làm thay đổi môi sinh trong đường ruột như cầu trùng, giun sán, rối loạn tiêu hoá do gà quá đói, quá khát, thay đổi đột ngột nguồn thức ăn, nước uống, thức ăn bị ôi thiu, nấm mốc, mật độ gà quá cao, chuồng trại ẩm ướt, chất độn chuồng không sạch không khô, cắt

mỏ,chuyển chuồng san đàn, tiêm phòng rất có lợi cho Clostridium phát triển

và gây bệnh Trong các trường hợp này bệnh chỉ phát ra ở dạng lẻ tẻ

Nguy hiểm hơn là một số chủng Cl perfringens có độc lực lớn sống và ô

nhiễm môi trường bên ngoài chuồng nuôi, khi dùng các dụng cụ thiết bị, con người vì lý do nào đó mang mầm bệnh vào đàn gà thì bệnh xảy ra với quy

mô lớn và bao giờ cũng ở dạng cấp tính

1.1.3.2 Phương thức truyền lây

Cl perfringens có thể tìm thấy trong phân, đất, bụi, rác, chất độn

chuồng, chất chứa đường ruột Trong nhiều vụ dịch viêm ruột hoại tử, thức ăn

và chất thải nhiễm mầm bệnh là nguyên nhân làm lây lan bệnh

1.1.3.3 Cơ chế gây bệnh

Theo kết quả của nhiều nghiên cứu, số lượng vi khuẩn Cl perfringens có

thể phân lập từ chất chứa trong đường tiêu hóa của gà bình thường là khác

nhau Một số nghiên cứu cho rằng Cl perfringens là vi khuẩn yếm khí bắt

buộc chủ yếu trong đường tiêu hóa của gà, trong khi đó các nghiên cứu khác chỉ ra rằng vi khuẩn chỉ chiếm một số lẻ tẻ và ít trong ruột non của gà bình thường từ khi mới nở tới 5 tháng tuổi

Việc điều chỉnh chế độ ăn có thể ảnh hưởng tới số lượng vi khuẩn Cl

perfringens trong đường tiêu hóa và sự xuất hiện bệnh đường tiêu hóa do clostridium ở gà có thể được thúc đẩy bởi bản chất của khẩu phần ăn Khẩu

phần ăn có hàm lượng bột cá, bột mì hoặc bột lúa mạch đen có thể làm cho bệnh viêm ruột hoại tử xảy ra và trầm trọng; nhưng khi khẩu phần ăn của gà được bổ sung thêm chất xơ và các hợp chất carbohydrate, bệnh tích của bệnh viêm ruột hoại tử giảm đi Các báo cáo khác cũng chỉ ra rằng các yếu tố khẩu

phần thức ăn có thể làm tăng lượng vi khuẩn Cl perfringens ở trong phân

Tổn thương niêm mạc đường tiêu hóa cũng là một yếu tố thúc đẩy bệnh viêm ruột hoại tử xảy ra Ngoài ra nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử có thể gồm các yếu tố như chất độn chuồng nhiều chất xơ, các chủng cầu trùng

khác nhau cùng với lượng vi khuẩn Cl perfringens trong đường tiêu hóa cao

hơn bình thường hoặc trong điều kiện mầm bệnh vẫn còn lưu cữu ngoài môi trường, thức ăn nhiễm mầm bệnh Khi hàm lượng các loại nguyên liệu trong thức ăn không cân đối cũng có thể là nguyên nhân khiến cho bệnh viêm ruột hoại tử xảy ra

1.1.3.4 Triệu chứng bệnh NE

- Bệnh thường phát ra ở thể cấp tính hoặc quá cấp tính

- Những gà bị bệnh như cầu trùng, giun, sán hoặc căn nguyên đưa từ môi trường bên ngoài vào bệnh diễn biến rất nhanh, gà chết trong vòng 1 giờ và nhiều trường hợp các cán bộ kỹ thuật bỏ qua bệnh NE và cho đó là gà chết do cầu trùng hoặc tụ huyết trùng

- Những trường hợp bệnh phát ra do các yếu tố stress khác thì thấy lác đác một số gà đột nhiên thâm tím vùng đầu mào, tích và các vùng da không hoặc ít lông ở vùng đầu rồi co dật động kinh, hoặc co cứng lại và chết, thời gian cũng chỉ vài ba giờ

- Diễn biến bệnh rất nhanh nhưng không tạo thành dịch lớn (lẻ tẻ, lác đác)

- Tỷ lệ ốm không cao và tỷ lệ chết cũng không cao (4 - 8%)

1.1.3.5 Bệnh tích

- Hiện tượng nhiễm trùng huyết thể hiện rất rõ

- Bệnh tích tập trung ở đường ruột, gan, lách, thận

- Niêm mạc đường ruột có nhiều đám đỏ tấy, xuất huyết thành vệt, thành mảng, có sự tróc vảy, ăn mòn, phù thũng Rất nhiều trường hợp khi mổ ra đã thấy các vùng viêm hoại tử tạo vết loét, ổ loét hoặc đám loét phủ một lớp màng vàng ngà.Ruột căng chứa đầy hơi

- Gan lách không to nhưng màu sắc lại thay đổi Màu của gan có thể thâm hoặc vàng hơn bình thường Trên bề mặt gan có nhiều điểm lấm tấm hoại tử màu vàng

- Thận và lách sưng to, biến màu, khó quan sát được các điểm hoại tử

1.1.4 Hiểu biết về một số bệnh ở gà thường ghép với NE

1.1.4.1 Bệnh do vi khuẩn Salmonella

Bệnh thương hàn gà (Typhus Avium) là một bệnh truyền nhiễm của gà do

vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum gây ra Bệnh ở thể cấp tính đối với

gà con, mạn tính với gà lớn Đặc điểm chủ yếu của bệnh này là gây viêm, hoại

tử niêm mạc đường tiêu hoá và các cơ quan phủ tạng

Hiện nay người ta thấy khi phân lập căn bệnh từ gà con hay gà lớn ốm đều thấy cả hai loại vi khuẩn này Khi kiểm tra các đặc tính sinh học thấy chúng chỉ khác nhau ở một vài đặc tính chuyển hoá đường Vì vậy mà bệnh được gọi chung là bệnh thương hàn gà (Typhus Avium) và căn bệnh có tên

chung là Salmonella gallinarum pullorum Bệnh có mặt ở khắp nơi trên thế

giới và được coi là một trong những bệnh nguy hiểm ở gà, đặc biệt là chăn nuôi tập trung (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [18]

Dịch tễ học

Có hai phương thức truyền lây chính: Lây truyền trực tiếp từ mẹ sang con qua lòng đỏ trứng và lây truyền gián tiếp qua thức ăn nước uống, qua vật dụng chăn nuôi… Mà vi khuẩn lây từ con gia cầm này sang con gia cầm khác Trong một quần thể gà sự lây truyền bệnh diễn ra theo một chu trình khép kín

mà khởi đầu là những con gà đẻ bố mẹ bị bệnh Gà mẹ bị bệnh, trứng của chúng được đưa vào máy ấp, trong quá trình phát triển của phôi mầm bệnh xâm nhập vào xoang nước ối và phát triển, khi nở mầm bệnh bám vào lông gà con và từ đó xâm nhiễm vào gà con ngay trong máy nở qua đường hô hấp Gà con lớn lên và quá trình lây truyền mầm bệnh lại diễn ra đồng hành với quá trình sinh trưởng của gà (Nguyễn Danh Tuấn, 2004) [20]

Triệu chứng

Triệu chứng ở gà con: đối với đàn gà con nở từ trứng của đàn gà bố mẹ

bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết phôi tăng vào các ngày 4, 11 và cuối ngày 18 Gà sẽ

bị mất sức sống Có thể quan sát thấy gà chết ngay trong máy nở, dính phôi, sát phôi, chết ngạt, chết tắc ở 21 ngày ấp Những con nở ra được thì có trọng lượng nhỏ hơn gà bình thường, yếu ớt, chết yếu Gà con bị bệnh thường bụng trễ do lòng đỏ không tiêu, hoặc chết sau 2 - 3 ngày phát bệnh Gà con biểu hiện ủ rũ, mắt lim dim, yếu ớt, giảm tính thèm ăn, bệnh phát triển mạnh vào lúc 5 - 10 ngày tuổi sau khi nở Gà gầy còm và chết sau 2 - 3 tuần tuổi, gà có biểu hiện mệt mỏi, đứng túm tụm lại với nhau Gà thường lông xù, sã cánh, ngủ gật, gà kêu liếp nhiếp liên tục, chất bài tiết dính bết lại sau lỗ hậu môn, phân có màu trắng đôi khi có màu xanh, nếu để lâu phần nước bốc hơi đi cặn còn lại giống như vôi bột hoặc bột phấn Một vài trường hợp gà thở mạnh, há mồm để thở Trường hợp bệnh quá cấp do nhiễm vi khuẩn với số lượng lớn và

có độc lực cao qua trứng tỷ lệ gà chết ngay 21 ngày ấp (nở) mà không có triệu

chứng của Salmonellosis

Triệu chứng ở gà lớn: Salmonellosis ở gà trưởng thành không biểu hiện

triệu chứng rõ ràng như ở gà con Bệnh thường ở thể ẩn, không có triệu chứng

đặc trưng của bệnh, đôi khi cũng có thể phát hành một bệnh dịch trầm trọng

và làm chết một số con trong đàn Gà bệnh thường có biểu hiện ỉa chảy, khát nước, mào yếm nhợt nhạt, phân loãng màu trắng xanh Gà mái bị bệnh thường

là xoang bụng trương to tích nước do viêm buồng trứng và phúc mạc Gà trống bị bệnh thường thấy viêm ruột ỉa chảy kéo dài, có thể chết đột ngột do viêm và hoại tử đường tiêu hoá, gà không đạp mái

Bệnh tích

Bệnh tích ở phôi: thường thấy viêm túi lòng đỏ, trong có chứa chất nhày màu vàng, gan sưng, mật sưng, thoái hoá

Bệnh tích ở gà con: gan sưng to, cứng, màu vàng có sọc và vệt máu, có

thể có các điểm hoại tử trên mặt gan; túi mật sưng to; túi lòng đỏ không tiêu; phổi viêm, các vùng tổn thương ứ máu; lách sưng to, có các hạt hoặc nốt hoại

tử tạo ra các u cục; thận sưng có ure, đôi khi xuất huyết; cơ tim có những điểm hoại tử như hạt kê; một số trường hợp gà bị viêm bao hoạt dịch của các khớp xương; ruột viêm dày lên, viêm phúc mạc, đôi khi có các u cục ở manh tràng và mề

Bệnh tích ở gà lớn: xác chết gầy; gan sưng có các nốt hoại tử màu trắng

xám; lách sưng to 3 - 5 lần, túi mật sưng to; tim gà lớn bị bệnh có các u, cục hoại tử, đạt đến mức làm thay đổi hình dạng của tim, xoang bao tim tích nước

có fibrin; ruột viêm, hoại tử và loét thành từng vệt trên niêm mạc; buồng trứng viêm và thoái hoá, vòi trứng có thể chứa dịch nhày làm cho trứng to lên, các nang trứng bị biến dạng, bị phủ một lớp dịch màu vàng, xanh hoặc đen, có hiện tượng xơ cứng, nhiều trường hợp noãn nang vỡ, được bao bọc bởi lớp dịch nhày, nhớt, thối; gà trống bị bệnh thì bệnh tích chủ yếu là viêm dịch hoàn

1.1.4.2 Bệnh cầu trùng gà (Eimeria)

Bệnh cầu trùng gà là một bệnh ký sinh trùng truyền nhiễm nguy hiểm thường gặp ở gà và đặc biệt là gà nuôi theo phương thức công nghiệp Bệnh

phổ biến khắp nơi trên thế giới, bệnh do 7 chủng Eimeria gây ra làm thiệt hại

rất lớn cho ngành chăn nuôi gà tập trung theo lối sản xuất công nghiệp, thiệt

hại kinh tế được thể hiện: Tăng số gà còi cọc trong đàn, tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng cao, số đầu con giảm 60 - 80%, sản lượng trứng giảm 15 - 30% Đặc điểm dịch tễ bệnh cầu trùng gà

Bệnh cầu trùng gà rất phổ biến, hầu như không đàn gà nào không bị

nhiễm một trong các chủng Eimeria trên Bệnh xảy ra chủ yếu trên gà con, gà

dò, gà mái trưởng thành Gà ốm và gà khỏi bệnh nhưng mang trùng là nguồn bệnh tiềm tàng lâu dài, nguy hiểm nhất, các yếu tố vệ sinh thú y, chăm sóc nuôi dưỡng kém, thiếu các vitamin, nguyên tố vi lượng đặc biệt là việc nuôi chung gà con với gà lớn sẽ thúc đẩy bệnh càng nặng hơn (TS Lê Văn Năm, 2003) [11]

Ngoài môi trường thiên nhiên bào tử nang cầu trùng tồn tại rất lâu có thể giữ được khả năng gây bệnh sau 5 tháng

Đem sấy khô ở nhiệt độ 400C sau 4 ngày, giữ trong điều kiện thiếu không khí được 30 ngày

Ở Châu Âu và Mỹ bệnh mang tính thời vụ rõ rệt, thường xảy ra từ tháng

5 - 8 Ở Việt Nam bệnh xảy ra quanh năm, mang tính dịch cao, tỷ lệ gà mắc bệnh lớn đặc biệt là vào những tháng mưa ẩm… Phương thức lây truyền bệnh chủ yếu là qua đường miệng

Triệu chứng lâm sàng

Đối với gà bệnh thường xảy ra ở những đàn nằm trong độ tuổi 10 - 90 ngày tuổi, nhưng nặng nhất là ở gà con từ 18 - 45 ngày tuổi Thời gian ủ bệnh ngắn (4 - 7 ngày), phụ thuộc vào chủng loại cầu trùng, nơi cư trú và mức độ nhiễm bệnh, số lượng căn nguyên xâm nhập vào cơ thể và tình trạng sức khoẻ đàn gà Bệnh có 3 thể hiện: cấp tính, mãn tính và không có triệu chứng lâm sàng (mang trùng)

Thể cấp tính: Bệnh chủ yếu xảy ra ở gà con, thời gian phát bệnh nhanh,

những triệu chứng lâm sàng chủ yếu là: Gà ủ rũ, lười vận động, nằm hoặc đứng một chỗ, khi gà đứng thường ngoặt đầu sang một bên, mắt nhắm, hai cánh xã xuống tận nền chuồng, lông xù (gà khoác áo tơi) Gà kém ăn hoặc bỏ

ăn hoàn toàn, nhưng lại uống nước nhiều (khát nước) Lúc đầu phát bệnh gà ỉa khó, có biểu hiện táo bón, sau mấy tiếng đồng hồ thì gà ỉa toàn nước Phân sống, lúc đầu có nhầy màu nâu vàng sau chuyển thành sáp nâu, cuối cùng có

lẫn máu Đặc biệt gà bị nhiễm chủng Eimeria tenella thì ở một số gà hậu môn

chảy máu tươi Xung quanh lỗ hậu môn lấm phân bẩn và máu Tỷ lệ chết có thể tới 90 -95%

Thể mạn tính: Bệnh thường quan sát thấy ở gà lớn từ 45 - 90 ngày

tuổi Cùng với triệu chứng lâm sàng như ở thể cấp tính nhưng mức độ biểu hiện nhẹ hơn, thời gian ốm kéo dài hơn, thường 7 - 15 ngày, tỷ lệ chết khoảng 25 - 45%

Thể không có triệu chứng lâm sàng: Đây còn gọi là thể mang trùng của

những gà lớn trưởng thành Khi quan sát bề mặt ngoài gà hoàn toàn khoẻ mạnh, ăn uống đi lại bình thường Triệu chứng lâm sàng là đôi khi gà bị ỉa chảy, tỷ lệ đẻ không đồng đều, năng suất trứng giảm 15 - 25% Khi xét nghiệm phân gà thấy có rất nhiều noãn nang cầu trùng

Bệnh tích

Bệnh tích gây ra do Eimeria tenella:

Sau khi nhiễm noãn nang 3 ngày mổ thấy thành ruột manh tràng dày lên một chút

Sau khi nhiễm 4 - 5 ngày, manh tràng bị sưng to chứa đầy máu, kéo dài tới 3 tuần

Bệnh tích gây ra do Eimeria necatrix:

Ruột non sưng to quá mức, mất khả năng nhu động

Bề mặt niêm mạc ruột có nhiều điểm trắng, đỏ Ngoài ra trong đường tiêu hoá còn có chứa dịch nhầy với máu

Bệnh tích gây ra do Eimeria acervulina:

Có những vệt trắng ở phần ruột non - tá tràng

Niêm mạc ruột non (kế phần tá tràng) dầy lên, phù và sung huyết đỏ

Có một số điểm trắng và đỏ nhỏ (do bào tử phân chia gây viêm đỏ)

Bệnh tích gây ra do Eimeria maxima:

Có nhiều điểm trắng trên niêm mạc ruột (có thể nhìn thấy qua bề mặt lớp thanh dịch)

Niêm mạc ruột dầy lên

Bệnh tích gây ra do Eimeria brunetti:

Bệnh do E brunetti thường gây bệnh tích ở phần sau của đường tiêu hoá

như ở cổ của manh tràng, kết tràng và trực tràng

Ở kết tràng phần lớn những đám có điểm trắng Nói chung người ta ít thấy triệu chứng của loài này

Những thể phân chia tìm thấy ở lớp biểu mô gần màng đáy Trường hợp bệnh trầm trọng, lớp biểu mô liên kết dưới sẽ bị tấn công do những thể phân chia ở thế hệ thứ 2 phá vỡ biểu mô làm sưng đường tiêu hoá và gây xuất huyết với mức độ khác nhau (xuất huyết điểm)

1.1.4.3 Bệnh viêm đường hô hấp mạn tính (CRD)

Mycoplasmosis còn là tên gọi khác của bệnh Đây là một bệnh truyền

nhiễm của nhiều loại gia cầm, nhưng phổ biến hơn cả là ở gà, gà tây Bệnh thường xảy ra ở mọi lứa tuổi, gà con dưới 2 tháng tuổi bệnh xảy ra ở thể cấp tính, gà lớn trưởng thành bệnh xảy ra ở thể mạn tính, tỷ lệ mắc bệnh trong đàn

gà cao, tỷ lệ chết không cao

Dịch tễ học

Trong tự nhiên gà, gà tây là vật chủ cảm nhiễm tự nhiên của Mycoplasma

galisepticum, người ta cũng đã phân lập được Mycoplasma galisepticum từ gà

lôi, gà gô, công, chim cút, vẹt, gà tây rừng, bồ câu, ngỗng, vịt Gà lớn và gà

đẻ dễ mắc bệnh hơn gà con, gà nuôi theo phương thức công nghiệp dễ mắc hơn gà nuôi theo phương thức gia đình, tỷ lệ mắc bệnh tập trung 4 - 8 tuần tuổi, gà đẻ bói, gà đẻ khi tỷ lệ đẻ cao nhất

Bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung nhiều nhất vào tháng 3, 4, 5 Bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp, lây qua phôi, lây qua đường sinh dục, lây qua đường tiêu hoá Mầm bệnh tồn tại nhiều ở nước mắt, nước mũi, phế quản, túi khí của cơ thể mắc bệnh

gà mái đẻ thì tỷ lệ chết không lớn lắm, nhưng bệnh làm giảm từ 10 - 40% sản phẩm, gà gầy sút, chuyển sang thể mạn tính

Bệnh tích

Xác chết gầy và nhợt nhạt do thiếu máu

- Niêm mạc mũi và các xoang cạnh mũi sưng chứa đầy dịch nhớt màu vàng hay xám: thành các xoang dưới mắt phù, xoang chứa dịch đặc có fibrin, niêm mạc họng sưng, xung huyết, đôi chỗ có xuất huyết phủ nhiều niêm dịch trong

- Phổi phù thũng, mặt phổi phủ fibrin, rải rác một số vùng bị viêm hoại tử

- Thành các túi hơi dày lên, phù thũng: xoang túi hơi nhất là vùng ngực

và bụng chứa đầy một chất dịch màu sữa; nếu bệnh chuyển sang mạn tính thì chất chứa quánh lại, cuối cùng thành một chất khô, bở, màu vàng

- Gà còn bị viêm ngoại tâm mạc, viêm quanh gan và viêm phúc mạc

- Lách có thể hơi sưng

- Gà mái: viêm buồng trứng và ống dẫn trứng

- Gà trống: viêm tinh hoàn, viêm khớp

1.1.5 Cơ chế tác dụng của một số kháng sinh

Theo Trần Nguyên Hữu và cs (1988) [8], Nguyễn Đức Lưu, Nguyễn Hữu

Vũ (2000) [8], [9], cơ chế tác dụng của một số loại kháng sinh như sau:

+ Amikacin

Là kháng sinh bán tổng hợp nhóm aminoglycoside, dẫn xuất từ

Kanamicin, có phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt tốt với vi khuẩn Gram (-) + Amoxicilin

Là dẫn xuất của Ampixilin, tác dụng tốt với vi khuẩn gram (+), một số vi khuẩn gram (-), hấp thu tốt qua đường tiêu hoá và xâm nhập tốt vào dịch tiết đường hô hấp

+ Gentamicin

Là kháng sinh nhóm aminoglycoside, tác dụng mạnh với vi khuẩn Gram

(-) và Gram (+) Khi uống, thuốc nằm tại đường tiêu hoá nên tác dụng

tại chỗ, khi tiêm, thuốc hấp phụ nhanh, sau 30 phút

+ Nofloxacin

Là kháng sinh tổng hợp nhóm Fluoroquinolone thế hệ II có hoạt phổ tác

dụng mạnh với các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) như E coli,

Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium.v.v

Vào cơ thể động vật, Nofloxacin hấp thụ nhanh và đạt nồng độ chữa bệnh trong huyết tương và các cơ quan trong khoảng thời gian ngắn nhất, đồng thời cũng được thải trừ nhanh ra khỏi cơ thể Thuốc có tác dụng ức chế men ADN

- gyrase tạo cấu trúc xoắn của chuỗi ADN của vi khuẩn, phân cắt các sợi nhỏ,

từ đó ức chế quá trình tổng hợp protein và giết chết vi khuẩn

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, các tài liệu nghiên cứu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà gây

ra bởi Cl perfringens còn hạn chế

Theo Lê Thị Thiều Hoa (1991) Cl perfringens là vi khuẩn yếm khí triệt để,

mọc tốt trên các môi trường yếm khí thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC,

pH thích hợp là 7,2 - 7,6 [7]

Theo Nguyễn Như Thanh, và cs (2001) [17] Cl perfringens là trực khuẩn

thẳng, hai đầu tròn, kích thước 0,8 - 1,5 x 3 - 8m Trong tổ chức bệnh, trong canh khuẩn non thấy vi khuẩn ngắn mập, đứng riêng lẻ hoặc ghép đôi thành song trực khuẩn Trong canh khuẩn già có hình dài, uốn cong hoặc sợi dài

Vi khuẩn không có lông, không di động có hình thành giáp mô, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoặc kiềm, kích thước nha bào lớn hơn chiều ngang thân vi khuẩn nên thường làm biến dạng vi khuẩn, thường nằm ở giữa hoặc gần ở 1 đầu

Theo nghiên cứu của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs (2008) [10] cho thấy, các

chủng Cl perfringens phân lập từ gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử đề thuộc typ C,

sản sinh độc tố α và β Độc tố của vi khuẩn được cho là nguyên nhân gây nên hoại

tử niêm mạc ruột - bệnh tích chính của bệnh viêm ruột hoại tử các nghiên cứu

khác chỉ ra rằng, Cl perfringens phân lập từ gà bị bệnh viêm ruột hoại tử có bệnh

tích đặc trưng sẽ sản sinh lượng độc tố α nhiều hơn so với gà không có bệnh tích

Độc tố α thu nhận được từ canh trùng nuôi cấy vi khuẩn Cl perfringens typ A và

C có thể gây bệnh trên gà broiler và gà con giống [10]

Theo Nguyễn Bá Hiên, và cs (2012) [5], ở gà tây, bệnh viêm ruột hoại tử

có liên quan chặt chẽ với bệnh cầu trùng, giun đũa, viêm ruột xuất huyết

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Clostridium perfingens (Cl perfingens) còn có tên là Clostridium welchii

được Welch và Natan phân lập từ năm 1892 Với tên gọi lúc đầu là Bacillus

aerogenescapsulatus Sau này, vi khuẩn được đổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes, Bacillus perfringens, Bacterium welchii và Clostridium welchii

Mặc dù tên gọi không chính thức là Cl welchii, nhưng được sử dụng từ năm

1939 và hiện nay vẫn có thể tìm thấy trong cách viết của người Anh Từ năm

1980, tên khoa học chính thức của vi khuẩn là Clostridium perfringens (Cl

Vi khuẩn Cl perfringens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridia, là vi

khuẩn yếm khí sinh nha bào và sinh H2S Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, phân, không khí) do đó dễ nhiễm vào thức ăn và gây ngộ độc

Qua nghiên cứu, người ta xác định được Cl perfringens có khả năng sản sinh

ra nhiều độc tố và các enzim khác Mỗi loại độc tố do chúng sinh ra có vai trò

xác định các chủng gây bệnh của Cl perfringens (Bormann et al, 2002),

(Cadman, 1994), (Garmory, 2000) [24], [25], [28]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn Cl Perfringens

- Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Cl Perfringens gây ra trên gà

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên

+ Trung Tâm Chẩn Đoán Thú Y Trung Ương

- Thời gian nghiên cứu: từ 5/2016 - 10/2017

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Bệnh phẩm viêm ruột hoại tử và vi khuẩn Cl perfringens gây bệnh ở

gà nuôi tại Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên: toàn bộ chất chứa ruột non của gà nghi mắc bệnh

- Dụng cụ và thiết bị cửa một phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản như nồi hấp tiệt trùng, tủ sấy, tủ ấm, đĩa petri, ống nghiệm và một số thiết bị đặc biệt phục vụ cho phần khảo sát này như: bình nhựa kín dùng để ủ kị khí, máy li tâm lạnh Mikro 22R (Hettich Zentrifugen-Mikro22R)

- Các loại môi trường để phân lập vi khuẩn; thạch máu, thạch Mac Conkey, môi trường thioglycollate (TGC), nước thịt gan yếm khí, nước

peptone, nước tryptone (Oxoid); thạch CW (Clostridium welchii Agar)

- Môi trường giám định vi khuẩn; thạch lòng đỏ trứng, thạch SIM, Limus milk (Oxoid)

- Túi tạo môi trường nuôi yếm khí (Anaerocult P) (Merck)

- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac

- Các loại giấy tẩm kháng sinh

- Thuốc kháng sinh để điều trị

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do Cl perfringens gây

ra tại Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên

- Tỷ lệ mắc bệnh theo lứa tuổi gà

- Tỷ lệ mắc bệnh theo giống gà

- Tỷ lệ mắc bệnh theo các mùa trong năm

- Tỷ lệ mắc bệnh theo phương thức chăn nuôi

- Tỷ lệ mắc bệnh theo tính biệt của gà

2.4.2 Theo dõi triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của bệnh viêm ruột hoại

tử ở đàn gà

- Tỷ lệ có triệu chứng, bệnh tích của bệnh/ tổng số gà mổ khám

- Biểu hiện triệu chứng và bệnh tích đặc trưng

2.4.3 Phân lập và giám định vi khuẩn Cl perfringens từ gà bệnh

- Phân lập vi khuẩn Cl perfringens

- Giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn

- Định typ và xác định gen mã hóa độc tố

2.4.4 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do Cl perfringens gây ra

- Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Cl perfringens

đã phân lập được

- Thử nghiệm một số phác đồ điều trị

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y

Nghiên cứu dịch tễ bệnh theo phương pháp dịch tễ học phân tích (Nguyễn Như Thanh, 2001) [17]

2.5.2 Phương pháp lấy mẫu

- Phát hiện gà nghi mắc bệnh theo phương pháp chẩn đoán lâm sàng: dựa vào kết quả quan sát triệu chứng, bệnh tích, các biến đổi bệnh lý, đặc biệt ở ruột (Phạm Ngọc Thạch, 1996) [15]

- Mổ khám gà có các triệu chứng nghi bị bệnh viêm ruột hoại tử, lấy bệnh phẩm gồm: dịch ruột và phân trong trực tràng Các mẫu bệnh phẩm được chứa trong các túi nilon chuyên dụng và chuyển về Trung Tâm Chẩn Đoán Thú Y Trung Ương để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

2.5.3 Phương pháp, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Cl perfringens

Phân lập vi khuẩn Cl perfringens được tiến hành theo phương pháp

thường quy của Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương (hình 2.1.)

Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng, vùng

môi trường bao xung quanh mờ đục, màu vàng

Đặc tính nuôi cấy Đặc tính sinh học

2.5.4 Xác định số lượng vi khuẩn trong 1g phân

Có nhiều phương pháp xác định số lượng vi khuẩn, nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp xác định số lượng vi khuẩn bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch đĩa, để xác định số

lượng vi khuẩn Cl perfringens có trong các mẫu phân gà bệnh và phân gà khoẻ

* Cách pha loãng mẫu:

Tiến hành pha loãng mẫu phân với nuớc muối sinh lý 0,9% theo cơ số 10: cân 1g phân cho vào cối sứ đã vô trùng, nghiền nát với nuớc sinh lý (nghiền phải kỹ để đảm bảo các vi khuẩn tách rời nhau thì khi cấy, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ) đổ vào bình tam giác và cho thêm nước sinh lý cho đủ nồng độ pha loãng là 1/10 Lắc đều, dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng này sang ống nghiệm đựng 9ml nước sinh lý vô trùng, tiếp tục làm như vậy đến khi có các nồng độ: 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7; 10-8

* Cách lấy mẫu:

Để xác định số lượng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành cấy mẫu ở nồng độ pha loãng cần thiết 10-4 - 10-5 để đảm bảo số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch ở khoảng 50 - 150

Dùng pipet hút 0,2ml dịch pha loãng cấy vào môi trường thạch máu yếm khí Mỗi mẫu phân cấy vào ít nhất 2 - 3 đĩa môi trường, dùng que cấy ria đều dịch nghiên cứu khắp bề mặt môi trường Sau đó xếp các đĩa thạch vào trong tủ chân không/37OC/48 giờ, lấy ra đếm khuẩn lạc

* Cách tính kết quả:

Cấy 0,2ml dịch pha loãng vào môi trường thì số lượng vi sinh vật (X) trong 1g phân đuợc tính theo công thức: X = 5 a  b

Trong đó: a: là số khuẩn lạc trung bình /mẫu

b: là nghịch đảo độ pha loãng

2.5.5 Phương pháp giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được

Sau khi nuôi cấy lần đầu, các khuẩn lạc nghi là vi khuẩn Cl

perfringens được tiến hành giám định đặc tính sinh hóa, bao gồm khả

năng dung huyết trên môi trường thạch máu, đặc tính mọc trên môi trường thạch lòng đỏ trứng, phản ứng CAMP ngược (reverse CAMP test), khả năng đông vón casein trong môi trường Litmus Milk, khả năng sinh Indol, sản sinh H2S và đặc tính di động

- Kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn: các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được ria cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu (có bổ sung 7% máu cừu), nuôi yếm khí ở 37oC Đọc kết quả sau 24 giờ

- Kiểm tra hoạt tính của men lecithinase: cấy chủng Cl perfringens cần

kiểm tra trên môi trường thạch lòng đỏ trứng, nuôi yếm khí ở 37oC/24 giờ

Phản ứng dương tính: quan sát thấy khuẩn lạc của vi khuẩn Cl perfringens

mọc theo đường cấy và xung quanh khuẩn lạc tạo thành một vùng mờ đục

- Kiểm tra đặc tính mọc trên môi trường Litmus Milk (môi trường sữa có 7% chỉ thị Litmus): cho phép kiểm tra đặc tính làm đông vón casein có trong

sữa của vi khuẩn yếm khí Cl perfringens Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra

vào ống môi trường Litmus Milk, nuôi yếm khí ở 37oC/24 giờ Phản ứng dương tính khi môi trường bị đông vón, vẩn mây và chuyển màu (từ màu xanh da trời thành màu hồng)

- Kiểm tra khả năng di động: Cl perfringens là vi khuẩn duy nhất trong giống Clostridium không có khả năng di động, dựa vào đặc tính này có thể phân biệt với các loài vi khuẩn Clostridium khác Sử dụng môi trường SIM để

kiểm tra khả năng di động, đồng thời kiểm tra khả năng sinh H2S và sinh Indol của vi khuẩn Sau khi cấy chích sâu vi khuẩn vào môi trường SIM, nuôi yếm khí ở 37oC/24 giờ Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc theo đường cấy để đánh giá khả năng di động Nếu môi trường có màu đen là vi khuẩn có sinh H2S Để kiểm tra khả năng sinh Indol, trước khi nhỏ thuốc thử Kovac’s,