Nghiên cứu sự lưu hành của gene netb ở các chủng clostridium perfringens type a gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố nha trang

57 789 2
Nghiên cứu sự lưu hành của gene netb ở các chủng clostridium perfringens type a gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố nha trang

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

i GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội LỜI CẢM ƠN Được sự phân công của ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và được sự đồng ý của Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cho phép tôi thực tập tại Bộ môn nghiên cứu Vi trùng từ 2/2012 đến 5/2012. Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, toàn thể quý thầy cô giáo đã tạo điều kiện và truyền đạt rất nhiều kiến thức cho tôi cũng như các thành viên trong lớp 50CNSH trong suốt 4 năm học. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Lập, TS. Vũ Ngọc Bội cùng BS. Lê Đình Hải đã tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Phân viện Thú y miền Trung, các anh chị trong Bộ môn Vi trùng học đã rất nhiệt tình, tạo một môi trường thuận lợi, học hỏi cao trong suốt thời gian tôi thực tập tại Viện. Xin gửi lời cảm ơn đến nhóm bạn “Tùng – Tiến - Linh - Chi” đã luôn đồng hành chia sẽ khó khăn, niềm vui và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Để hoàn thành đề tài này, ngoài một phần nỗ lực của bản thân thì sự động viên của gia đình và bạn bè là nguồn lực to lớn không thể thiếu với tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Do trình độ kiến thức còn hạn chế, lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học. Kính mong nhận được sự thông cảm, góp ý nhiệt tình của Quý thầy cô giáo, các cô chú, anh chị và toàn thể các bạn để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Xin được chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 11 tháng 5 năm 2012 Sinh viên thực hiện Lại Nhật Linh ii GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii LỜI NÓI ĐẦU 1 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 4 1.1.1 Trên thế giới 4 1.1.2 Ở Việt Nam 7 1.2. Vi khuẩn C. perfringens [29] 7 1.2.1. Đặc điểm hình thái 8 1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học 8 1.2.3. Đặc tính di truyền 9 1.3. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens 10 1.4. Các loại độc tố của C. perfringens [15] 11 1.4.1 Alpha toxin 11 1.4.2. Beta toxin 12 1.4.3. Epsilon toxin 12 1.4.4. Iota toxin 13 1.4.5. Enterotoxin (CPE) 13 1.4.6. Delta toxin 14 1.4.7. Theta toxin 14 1.5. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens và khả năng gây bệnh 14 1.6. Phản ứng PCR [3] [5] 18 1.6.1. Nguyên tắc phản ứng 18 1.6.2. Các điều kiện của phản ứng PCR 21 1.6.3. Các hạn chế của phản ứng PCR 22 iii GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội 1.6.4. Phản ứng Multiplex PCR 24 1.7. Điện di [3] [5] 24 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu 26 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 2.3. Vật liệu nghiên cứu 26 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 26 2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 26 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu 26 2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học 27 2.4.3. Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi [4] [7] 28 2.4.4. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn [4] [7] 28 2.4.5. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học 28 2.4.6. Phương pháp giữ giống vi khuẩn C. perfringens 29 2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR [11] [25] 30 2.4.8. Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR [8] 32 2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu 33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang 34 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang 34 3.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens phân lập được 35 3.1.2.1. Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn C. perfringens 35 3.1.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di đông của vi khuẩn C. perfringens bằng phương pháp soi tươi 36 3.1.2.3. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn C. perfringens phân lập được trên một số môi trường 36 3.1.2.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens 37 iv GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội 3.2. Kết quả xác định type độc tố vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR 40 3.3. Kết quả xác định gene độc tố netB bằng kỹ thuật PCR 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 v GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG 1.1. Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 1.2. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 1.3. Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.1. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.2. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.4. Trình tự cặp mồi của gene netB BẢNG 2.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định gene netB BẢNG 2.6. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR xác định gene netB BẢNG 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens từ mẫu phân thu được BẢNG 3.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 3.3. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens vi GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH 1.1. Vi khuẩn C. perfringens gây bệnh NE trên gà HÌNH 1.2. Các điểm tổn thương ruột gà do vi khuẩn C. perfringens HÌNH 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi PCR HÌNH 1.4. Các chu kỳ của phản ứng PCR HÌNH 3.1. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn C. perfringens HÌNH 3.2. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC agar HÌNH 3.3. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch máu HÌNH 3.4. Kết quả kiểm tra lên men đường HÌNH 3.5 Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk HÌNH 3.6. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường Egg yolk HÌNH 3.7. Kết quả CAMP - test HÌNH 3.8. Kết quả điện di định type vi khuẩn C. perfringens HÌNH 3.9. Kết quả điện di xác định gene netB của vi khuẩn C. perfrienges type A vii GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C. perfringens Clostridium perfringens E. coli Escherichia coli Taq Thermus aquaticus SPS agar Perfringens Selective Agar TSC agar Tryptose – Sulfit – Cycloserin Agar PCR Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxynucleotide Triphosphate TBE Tris Boric EDTA DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid M Maker – Thang chuẩn DNA Cpa Gene mã hóa C. perfringens alpha toxin Cpb Gene mã hóa C. perfringens beta toxin Ext Gene mã hóa C. perfringens Epsilon toxin Itx Gene mã hóa C. perfringens iota toxin Cpe Gene mã hóa C. perfringens enterotoxi 1 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội LỜI NÓI ĐẦU Ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm có vai trò quan trọng trong hệ thống nông nghiệp, góp phần mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi. Sản phẩm của ngành chăn nuôi không những là nguồn cung cấp thực phẩm, nguyên liệu cho công nghiệp chế biến mà phế phẩm của nó còn được tận dụng cho các ngành khác… Tại Hội nghị triển khai chiến lược phát triển chăn nuôi tại các tỉnh phía Nam đã đề ra chỉ tiêu tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42%. Trong đó, năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38%. Muốn đạt được kế hoạch đó thì phải đầu tư hơn nữa cho ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt chăn nuôi gà mang một ý nghĩa to lớn. Những người chăn nuôi, đặc biệt là ở nông hộ, khi mà có quá nhiều khó khăn đến từ vốn, con giống, thức ăn thì họ còn phải đối mặt thêm một vấn đề nữa liên quan đến công tác thú y, đó là dịch bệnh. Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis - NE) do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm xảy ra ở gia cầm nói chung và loài gà nói riêng, đặc biệt là ở các nước có ngành chăn nuôi gia cầm phát triển như Việt Nam. Bệnh rất khó phát hiện các biểu hiện lâm sàng và khi đã phát hiện được thì không có khả năng cứu chữa. Vi khuẩn C. perfringens là loại trực khuẩn yếm khí Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta chia vi khuẩn này thành 5 type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra một độc tố khác nhau và gây ra các bệnh khác nhau trên các đối tượng động vật khác nhau. Type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta và epsilon; type C sản sinh độc tố alpha và beta; type D sản sinh độc tố alpha và epsilon; type E sản sinh độc tố alpha và iota. Ngoài ra C. perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,… Khi cơ thể gà gặp các điều kiện bất lợi như thức ăn kém phẩm chất, thay đổi khẩu phần ăn đột ngột, vi khuẩn C. perfringens có mặt ở đường tiêu hóa của gia cầm sẽ tăng sinh về số lượng và sản sinh độc tố gây bệnh. Gà mắc bệnh viêm ruột 2 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội hoại tử thường xuất hiện các triệu chứng như ủ rũ, biếng ăn, xù lông và xả cánh. Bệnh thường xảy ra ở hai thể cấp tính và mãn tính. Thể cấp tính chủ yếu xuất hiện trên gà từ 2- 4 tuần tuổi; con vật mắc bệnh bị mất nuớc, tiêu chảy, phân có màu sẫm và có mùi thối khắm. Bệnh tích bao gồm các điểm hoại tử xuất huyết ở ruột non, đặc biệt là ở ruột chay (jejunum) và ruột hồi (ileum). Thể mãn tính với các bệnh tích hoại tử điểm hoặc hoại tử dạng sợi ở ruột non, nếu con vật còn sống thì tạo thành các đám loét. Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ chăn nuôi và các trang trại chăn nuôi có thể lên đến 50%. Những nghiên cứu trước đây cho rằng độc tố alpha do vi khuẩn C. perfringens type A sản sinh là nguyên nhân chính gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Những năm gần đây, bằng thực nghiệm gây đột biến gene mã hóa độc tố anpha, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng alpha toxin không phải là độc tố quyết định khả năng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử, các tác giả đã phát hiện một loại độc tố mới, độc tố netB, là tác nhân chính gây ra các bệnh tích điển hình của bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là vai trò gây bệnh viêm ruột hoại tử của các loại độc tố do vi khuẩn C. perfringens sản sinh ở mức phân tử. Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Ban Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, đã cho tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự lƣu hành của gene netB ở các chủng Clostridium perfringens type A gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang”. Nội dung của đề tài: - Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ mẫu phân của gà khỏe và gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử. - Xác định các type độc tố của Clostridium perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR. - Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR. Mục tiêu của đề tài 3 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội Để tìm hiểu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang và sự lưu hành của gene netB trong các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà mắc bệnh. Phát hiện sự lưu hành của gene mã hóa độc tố netB trong các chủng Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà từ đó có thể đề xuất các biện pháp điều trị bệnh có hiệu quả và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C. perfringens gây ra. [...]... h a cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh NE ở các trang trại này [14] Theo nghiên cứu c a George Tice về Sự tồn tại c a Clotridia và sự bất ổn định c a đường ruột đã cung cấp thêm nhiều thông tin có giá trị liên quan đến nguyên nhân gây bệnh Trong đó ngoài việc chỉ ra rằng sự tồn tại c a chủng C perfringens type A. .. khác nhau là A, B, C, D và E Trong đó type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha, iota Gene mã h a các loại độc tố có thể nằm ở nhiễm sắc thể, ở plasmid hoặc ở cả nhiễm sắc thể/ Plasmid Bảng 1.1 Vị trí gene mã h a các loại độc tố c a vi khuẩn C Perfringens Độc tố Gene. .. nhiễm sắc thể c a vi khuẩn 1.5 Các type độc tố c a vi khuẩn C perfringens và khả năng gây bệnh C perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau, người ta d a vào 4 loại độc tố chính để chia thành 5 type độc tố Bảng 1.2 Các type độc tố c a vi khuẩn C perfringens Type Alpha Beta Epsilon Iota A + - - - B + + + - C + + - - D + - + - E + - - + 1.5.1 Type A Các chủng C perfringens thuộc type này được... CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 1.1.1 Trên thế giới Kể từ khi lệnh cấm sử dụng chất kháng sinh để thúc đẩy tăng trưởng trong thức ăn chăn nuôi c a Liên minh Châu Âu EU được ban hành, bệnh viêm ruột hoại tử đã trở thành nguyên nhân chính gây tử vong ở gà Viêm ruột hoại tử là một trong những bệnh phổ biến nhất và gây thiệt hại tài... nghiên cứu cũng đề cập đến bệnh lâm sàng không dẫn đến tử vong và được đặc trưng bởi viêm loét đầu mối ở tá tràng và ruột chay.[24] GVHD: TS Lê Lập TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 6 Hình 1.2 Các điểm tổn thƣơng ruột gà do vi khuẩn C perfringens Một nghiên cứu c a các nhà khoa học Australia đã thử nghiệm vai trò gây bệnh c a độc tố alpha sau khi gene này bị gây đột biến Nghiên cứu được tiến hành ở 3... châu Âu Nghiên cứu c a A. Tolooe và cộng sự (2011) đã lần đầu tiên báo cáo sự hiện diện c a gene netB gi a chủng C perfringens phân lập từ châu Á Theo A. Tolooe và cộng sự thì tỷ lệ các chủng mang gene mã h a độc tố netB là 52,80%, trong số đó chủ yếu là các chủng phân lập từ gà có triệu chứng c a bệnh NE Trong một cuộc khảo sát ở Bắc Mỹ đã chỉ ra rằng phần lớn các chủng C perfringens phân lập từ gà có... mạnh và gà bị bệnh tiêu chảy 2.2 Đ a điểm và thời gian nghiên cứu - Đ a điểm lấy mẫu: các hộ chăn nuôi trên đ a bàn thành phố Nha - Đ a điểm nghiên cứu: Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng – Phân viện thú y Trang miền Trung – Km 4, Đường 2/4, Phường Vĩnh H a, Nha Trang, Khánh H a - Thời gian nghiên cứu: 2/2012 – 5/2012 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm - Máy ly tâm, máy PCR - Đ a petri,... vào plasmid c a C perfringens có ch a một chuỗi dài 1197 nucleotide mã h a cho 399 amino acid với khối lượng phân tử là 43 kDa Okabe và cộng sự ở Nhật Bản đã thành công trong việc nhân dòng gene vô tính alpha toxin c a C perfringens và cũng cho biết chiều dài c a gene cpa và trình tự acid amin trùng với hai gene nói trên 1.4.2 Beta toxin Đây là loại độc tố gây chết người lớn, được sản xuất bởi cả type. .. sản sinh ra một lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân chính gây bệnh 1.4 Các loại độc tố c a C perfringens [15] Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau như alpha, beta, epsilon, iota, beta 2… D a vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta phân chia vi khuẩn C perfringens thành 5 type độc... Iota ở C perfringens cũng tương tự như những độc tố ở vi khuẩn C spiroforme, một loại vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều Ngoài khả năng gây nhiễm độc tố đường ruột ở bê, bò, chuột lang và thỏ, thì độc tố này có khả năng gây nên bệnh lỵ ở cừu Mỗi type độc tố khác nhau gây ra các loại bệnh khác nhau trên các đối tượng khác nhau Các type độc tố gây bệnh được trình bày ở bảng 1.3 Bảng 1.3 Các bệnh gây . lƣu hành c a gene netB ở các chủng Clostridium perfringens type A gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang . Nội dung c a đề tài: - Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens. tiêu c a đề tài 3 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh TS. Vũ Ngọc Bội Để tìm hiểu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang và sự lưu hành c a gene netB trong các chủng. gây ra bệnh viêm ruột hoại tử, các tác giả đã phát hiện một loại độc tố mới, độc tố netB, là tác nhân chính gây ra các bệnh tích điển hình c a bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Bệnh viêm ruột hoại

Ngày đăng: 14/08/2014, 13:05

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan