Nghiên cứu sự lưu hành của gene netb ở các chủng clostridium perfringens type a gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố nha trang

Những năm gần đây, bằng thực nghiệm gây đột biến gene mã hóa độc tố anpha, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng alpha toxin không phải là độc tố quyết định khả năng gây ra bệnh viêm ruột

LỜI CẢM ƠN

Được sự phân công của ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và được sự đồng ý của Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cho phép tôi thực tập tại Bộ môn nghiên cứu Vi trùng từ 2/2012 đến 5/2012

Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, toàn thể quý thầy cô giáo đã tạo điều kiện và truyền đạt rất nhiều kiến thức cho tôi cũng như các thành viên trong lớp 50CNSH trong suốt 4 năm học

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Lập, TS Vũ Ngọc Bội cùng BS Lê Đình Hải đã tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Phân viện Thú y miền Trung, các anh chị trong Bộ môn Vi trùng học đã rất nhiệt tình, tạo một môi trường thuận lợi, học hỏi cao trong suốt thời gian tôi thực tập tại Viện

Xin gửi lời cảm ơn đến nhóm bạn “Tùng – Tiến - Linh - Chi” đã luôn đồng hành chia sẽ khó khăn, niềm vui và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Để hoàn thành đề tài này, ngoài một phần nỗ lực của bản thân thì sự động viên của gia đình và bạn bè là nguồn lực to lớn không thể thiếu với tôi Tôi xin chân thành cảm ơn!

Do trình độ kiến thức còn hạn chế, lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Kính mong nhận được sự thông cảm, góp ý nhiệt tình của Quý thầy

cô giáo, các cô chú, anh chị và toàn thể các bạn để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn Xin được chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 11 tháng 5 năm 2012 Sinh viên thực hiện

Lại Nhật Linh

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

LỜI NÓI ĐẦU 1

1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 4

1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.2 Ở Việt Nam 7

1.2. Vi khuẩn C perfringens [29] 7

1.2.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.2 Đặc tính sinh vật hóa học 8

1.2.3 Đặc tính di truyền 9

1.3 Cơ chế gây bệnh của C perfringens 10

1.4 Các loại độc tố của C perfringens [15] 11

1.4.1 Alpha toxin 11

1.4.2 Beta toxin 12

1.4.3 Epsilon toxin 12

1.4.4 Iota toxin 13

1.4.5 Enterotoxin (CPE) 13

1.4.6 Delta toxin 14

1.4.7 Theta toxin 14

1.5 Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens và khả năng gây bệnh 14

1.6 Phản ứng PCR [3] [5] 18

1.6.1 Nguyên tắc phản ứng 18

1.6.2 Các điều kiện của phản ứng PCR 21

1.6.3 Các hạn chế của phản ứng PCR 22

1.6.4 Phản ứng Multiplex PCR 24

1.7 Điện di [3] [5] 24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu 26

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 26

2.3.2 Hóa chất, môi trường và thuốc thử 26

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 26

2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn C perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học 27 2.4.3 Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi [4] [7] 28

2.4.4 Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn [4] [7] 28

2.4.5 Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học 28

2.4.6 Phương pháp giữ giống vi khuẩn C perfringens 29

2.4.7 Phương pháp định type vi khuẩn C perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR [11] [25] 30

2.4.8 Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR [8] 32

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn C perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang 34

3.1.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang 34

3.1.2 Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C perfringens phân lập được 35

3.1.2.1 Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn C perfringens 35

3.1.2.2 Kết quả kiểm tra khả năng di đông của vi khuẩn C perfringens bằng phương pháp soi tươi 36

3.1.2.3 Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn C perfringens phân lập được trên một số môi trường 36

3.1.2.4 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfringens 37

3.2 Kết quả xác định type độc tố vi khuẩn C perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR 40

3.3 Kết quả xác định gene độc tố netB bằng kỹ thuật PCR 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC BẢNG

BẢNG 1.1 Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C perfringens

BẢNG 1.2 Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens

BẢNG 1.3 Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C perfringens

BẢNG 2.1 Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR định type vi

BẢNG 2.4 Trình tự cặp mồi của gene netB

BẢNG 2.5 Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định gene netB

BẢNG 2.6 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR xác định gene netB

BẢNG 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn C perfringens từ mẫu phân thu được

BẢNG 3.2 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfringens BẢNG 3.3 Kết quả định type độc tố vi khuẩn C perfringens

DANH MỤC CÁC HÌNH

HÌNH 1.1 Vi khuẩn C perfringens gây bệnh NE trên gà

HÌNH 1.2 Các điểm tổn thương ruột gà do vi khuẩn C perfringens

HÌNH 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi PCR

HÌNH 1.4 Các chu kỳ của phản ứng PCR

HÌNH 3.1 Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn C perfringens

HÌNH 3.2 Khuẩn lạc C perfringens trên môi trường TSC agar

HÌNH 3.3 Khuẩn lạc C perfringens trên môi trường thạch máu

HÌNH 3.4 Kết quả kiểm tra lên men đường

HÌNH 3.5 Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk

HÌNH 3.6 Khuẩn lạc C perfringens trên môi trường Egg yolk

HÌNH 3.7 Kết quả CAMP - test

HÌNH 3.8 Kết quả điện di định type vi khuẩn C perfringens

HÌNH 3.9 Kết quả điện di xác định gene netB của vi khuẩn C perfrienges type A

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C perfringens Clostridium perfringens

E coli Escherichia coli

Cpa Gene mã hóa C perfringens alpha toxin

Cpb Gene mã hóa C perfringens beta toxin

Ext Gene mã hóa C perfringens Epsilon toxin

LỜI NÓI ĐẦU

Ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm có vai trò quan trọng trong hệ thống nông nghiệp, góp phần mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi Sản phẩm của ngành chăn nuôi không những là nguồn cung cấp thực phẩm, nguyên liệu cho công nghiệp chế biến mà phế phẩm của nó còn được tận dụng cho các ngành khác… Tại Hội nghị triển khai chiến lược phát triển chăn nuôi tại các tỉnh phía Nam đã đề ra chỉ tiêu tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42% Trong

đó, năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38% Muốn đạt được kế hoạch đó thì phải đầu tư hơn nữa cho ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt chăn nuôi gà mang

một ý nghĩa to lớn

Những người chăn nuôi, đặc biệt là ở nông hộ, khi mà có quá nhiều khó khăn đến từ vốn, con giống, thức ăn thì họ còn phải đối mặt thêm một vấn đề nữa liên quan đến công tác thú y, đó là dịch bệnh Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis

- NE) do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra là một trong những bệnh nguy

hiểm xảy ra ở gia cầm nói chung và loài gà nói riêng, đặc biệt là ở các nước có ngành chăn nuôi gia cầm phát triển như Việt Nam Bệnh rất khó phát hiện các biểu hiện lâm sàng và khi đã phát hiện được thì không có khả năng cứu chữa

Vi khuẩn C perfringens là loại trực khuẩn yếm khí Gram dương, chúng có

thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi đứng song song Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta chia vi khuẩn này thành 5 type là A, B, C, D, E Mỗi type sản sinh ra một độc tố khác nhau

và gây ra các bệnh khác nhau trên các đối tượng động vật khác nhau Type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta và epsilon; type C sản sinh độc

tố alpha và beta; type D sản sinh độc tố alpha và epsilon; type E sản sinh độc tố

alpha và iota Ngoài ra C perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama,

delta, eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…

Khi cơ thể gà gặp các điều kiện bất lợi như thức ăn kém phẩm chất, thay đổi

khẩu phần ăn đột ngột, vi khuẩn C perfringens có mặt ở đường tiêu hóa của gia

cầm sẽ tăng sinh về số lượng và sản sinh độc tố gây bệnh Gà mắc bệnh viêm ruột

hoại tử thường xuất hiện các triệu chứng như ủ rũ, biếng ăn, xù lông và xả cánh Bệnh thường xảy ra ở hai thể cấp tính và mãn tính Thể cấp tính chủ yếu xuất hiện trên gà từ 2- 4 tuần tuổi; con vật mắc bệnh bị mất nuớc, tiêu chảy, phân có màu sẫm

và có mùi thối khắm Bệnh tích bao gồm các điểm hoại tử xuất huyết ở ruột non, đặc biệt là ở ruột chay (jejunum) và ruột hồi (ileum) Thể mãn tính với các bệnh tích hoại tử điểm hoặc hoại tử dạng sợi ở ruột non, nếu con vật còn sống thì tạo thành các đám loét Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ chăn nuôi và các trang trại chăn nuôi có thể lên đến 50%

Những nghiên cứu trước đây cho rằng độc tố alpha do vi khuẩn C perfringens type A sản sinh là nguyên nhân chính gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà

Những năm gần đây, bằng thực nghiệm gây đột biến gene mã hóa độc tố anpha, một

số nghiên cứu đã chứng minh rằng alpha toxin không phải là độc tố quyết định khả năng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử, các tác giả đã phát hiện một loại độc tố mới,

độc tố netB, là tác nhân chính gây ra các bệnh tích điển hình của bệnh viêm ruột

hoại tử ở gà

Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam, đặc

biệt là vai trò gây bệnh viêm ruột hoại tử của các loại độc tố do vi khuẩn C perfringens sản sinh ở mức phân tử Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của

Ban Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh

học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, đã cho tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu sự lưu hành của gene netB ở các chủng Clostridium perfringens

type A gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang”

Nội dung của đề tài:

- Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ mẫu phân của gà khỏe và gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử

- Xác định các type độc tố của Clostridium perfringens bằng kỹ thuật

Multiplex PCR

- Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR

Mục tiêu của đề tài

Để tìm hiểu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang và

sự lưu hành của gene netB trong các chủng vi khuẩn C perfringens phân lập từ gà

mắc bệnh

Phát hiện sự lưu hành của gene mã hóa độc tố netB trong các chủng

Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà từ đó có thể đề xuất các biện pháp điều trị bệnh có hiệu quả và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C perfringens gây ra

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C perfringens và bệnh viêm ruột

Bệnh NE là một bệnh đa yếu tố phức tạp với nhiều yếu tố không rõ ràng ảnh hưởng đến sự xuất hiện của nó và mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh Đặc biệt các dịch lẻ tẻ của NE có thể xảy ra thường xuyên trong các trang trại trong đó thuốc kháng sinh không được sử dụng như kích thích tăng trưởng, thực hành chăn nuôi không nghiêm ngặt và chế độ ăn uống dựa trên các loại ngũ cốc nhớt với các nguồn protein động vật là phổ biến.[9]

Hình 1.1 Vi khuẩn C perfringens gây bệnh NE trên gà

Theo báo cáo của Long J.R (1973) bệnh NE được biết đến lần đầu tiên vào năm 1961, bệnh xảy ra trên gà trống non từ 6 – 7 tuần tuổi tại Anh, sau đó xuất hiện tại Australia, Canada, Mỹ và Thụy Điển [25]

Viêm ruột hoại tử đã được đề cập trong các báo cáo ở châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Trung Đông, châu Á và New Zealand Bệnh xảy ra trên gà thịt và gà tây

từ 3 – 7 tuần tuổi Bệnh do vi khuẩn C perfringens gây ra, một loại vi khuẩn khá

phổ biến được tìm thấy trong đất, bụi, rác và một lượng nhỏ trong đường tiêu hóa

của gà khỏe mạnh Vi khuẩn C perfringens chỉ gây bệnh khi số lượng của nó tăng

lên đột ngột và điều kiện sức khỏe vật nuôi không tốt, khi đó lượng độc tố ngoại bào được sinh ra vượt quá mức cho phép sẽ tấn công và gây ra các tổn thương bệnh

lý ở đường tiêu hóa Phần lớn các nghiên cứu về NE đã tập trung vai trò của độc tố mang tính quyết định đối với khả năng gây bệnh Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng

bệnh NE chủ yếu được gây ra bởi C perfringens type A và một số lượng nhỏ gia

cầm bị bệnh là do type C [17] Độc tố alpha được coi là nguyên nhân gây bệnh chính

Tại các trang trại gà ở Cario – Ai Cập bị bệnh NE, Effat và cộng sự (2007)

đã phân lập C perfringens từ các mẫu gà bị bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất

cả những vi khuẩn phân lập được đều là C perfringens, có khuẩn lạc đặc trưng trên

môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh NE ở các trang trại này [14]

Theo nghiên cứu của George Tice về “Sự tồn tại của Clotridia và sự bất ổn

định của đường ruột” đã cung cấp thêm nhiều thông tin có giá trị liên quan đến

nguyên nhân gây bệnh Trong đó ngoài việc chỉ ra rằng sự tồn tại của chủng C perfringens type A sản sinh độc tố alpha có liên quan đến bệnh NE và chế độ ăn

uống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của bệnh Gà được sinh ra với một đường ruột vô trùng và hai tuần đầu tiên sau khi sinh hệ đường ruột có một

lượng lớn oxy đã ức chế sự sinh sản của các vi khuẩn yếm khí Clotridia Sau hai tuần, lượng oxy trong ruột bắt đầu giảm, đồng thời Clotridia sinh sôi nảy nở và dẫn

đến tình trạng bệnh lâm sàng Trong nghiên cứu cũng đề cập đến bệnh lâm sàng không dẫn đến tử vong và được đặc trưng bởi viêm loét đầu mối ở tá tràng và ruột chay.[24]

Hình 1.2 Các điểm tổn thương ruột gà do vi khuẩn C perfringens

Một nghiên cứu của các nhà khoa học Australia đã thử nghiệm vai trò gây bệnh của độc tố alpha sau khi gene này bị gây đột biến Nghiên cứu được tiến hành

ở 3 nhóm gà: nhóm 1 gây bệnh bằng vi khuẩn C perfringens mang gene cpa hoang dại, nhóm 2 gây bệnh bằng C perfringens mang gene cpa đã gây đột biến không có

khả năng biểu hiện gene này nên không thể sản sinh độc tố alpha và nhóm 3 dùng làm đối chứng Kết quả đã chỉ ra rằng biểu hiện bệnh NE ở gà không phụ thuộc vào

vi khuẩn C perfringens sản sinh độc tố alpha Như vậy chắc chắn rằng độc tố alpha

không phải là một tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh NE [18]

Năm 2008, Anthony Keyburn và cộng sự đã có một phát hiện đột phá rằng độc tố alpha không phải là yếu tố chính gây bệnh NE trên gà mà do một loại độc tố

mới, được đặt tên là netB gây ra [13]

Kể từ lần đầu tiên phát hiện ra gene netB năm 2008, sự hiện diện của gene netB đã được sàng lọc trong số nhiều chủng C perfringens phân lập từ Australia,

Canada, Mỹ và một số nước châu Âu Nghiên cứu của A.Tolooe và cộng sự (2011)

đã lần đầu tiên báo cáo sự hiện diện của gene netB giữa chủng C perfringens phân

lập từ châu Á Theo A.Tolooe và cộng sự thì tỷ lệ các chủng mang gene mã hóa

độc tố netB là 52,80%, trong số đó chủ yếu là các chủng phân lập từ gà có triệu

chứng của bệnh NE Trong một cuộc khảo sát ở Bắc Mỹ đã chỉ ra rằng phần lớn các

chủng C perfringens phân lập từ gà có biểu hiệu lâm sàng của bệnh NE mang gene netB (58,30%) trong khi chỉ có một tỷ lệ nhỏ (8,60%) chủng C perfringens phân

lập từ gà khỏe mạnh mang gene này Tỷ lệ cao nhất (>90%) cho kết quả dương tính

với gene netB được tìm thấy từ chủng C perfringens phân lập từ một đàn gà thịt bị

bệnh ở Thụy Điển Tuy nhiên trong cùng một đàn gà, khoảng 25% cũng cho kết quả

dương tính với gene netB ở gà khỏe mạnh.[8]

1.1.2 Ở Việt Nam

Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do vi khuẩn C perferingens vẫn chưa được

nghiên cứu rộng rãi và quy mô ở nước ta Hiện nay mới chỉ có một vài nghiên cứu

về C perfringens gây bệnh trên bò, dê, cừu và lợn Các nghiên cứu chủ yếu xác định sự có mặt và định type độc tố trên các chủng C perfringens được phân lập

Theo TS Lê Lập và cộng sự (2007) khi phân lập và định type độc tố của vi

khuẩn C perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplex PCR Tác giả cho biết những chủng vi khuẩn phân lập từ phân đều thuộc type A mang gene cpa mã

hóa độc tố alpha, những chủng phân lập từ nội tạng của dê, cừu bị bệnh lại thuộc

type D mang gene cpa và etx [2]

Theo tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) hội chứng tiêu chảy ở lợn

đã được nhiều tác giả trong nước nghiên cứu Tuy nhiên các nghiên cứu đầy đủ về

vai trò gây tiêu chẩy ở lợn của vi khuẩn C perfringens so với E.coli và Salmonella chưa có nhiều, tác giả đã kết luận C perfringens đóng vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở lợn Tần suất phân lập được C perfringens ở lợn bị bệnh là

55,60% Khi lợn chết vì tiêu chảy với triệu chứng và bệnh tích đặc trưng thì tỷ lệ

phân lập được vi khuẩn C perfringens ở ruột là 88,91%.[1]

Đặc biệt là các nghiên cứu về gene netB chưa được nghiên cứu ở Việt Nam,

có thể do C perfringens là vi sinh vật kỵ khí nên quá trình nghiên cứu, phân lập gặp

nhiều khó khăn hơn so với các vi sinh vật hiếu khí khác Đồng thời sự hạn chế về các phương tiện nghiên cứu hiện đại cũng khiến cho việc nghiên cứu về nó trở nên khó khăn hơn

1.2 Vi khuẩn C perfringens [29]

C perfringens lần đầu tiên được phát hiện bởi Feser vào năm 1865, sau đó

nhiều nghiên cứu của các tác giả khác về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra

C perfringens phân bố rộng khắp trong môi trường đất, nước, không khí và thường

được tìm thấy trong ruột động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi thì vi khuẩn phát

triển và sản sinh độc tố gây bệnh trong cơ thể vật chủ C perfringens đã được phân

lập bởi Welch và Nuttall (năm 1892) từ vết thương bị hoại tử và được đặt tên là

Baccillus aerogenes capsulatus Sau đó đổi thành Bacillus perfringens, tiếp theo là Clostridium welchii và hiện nay là Clostridium perfringens

Hệ thống phân loại khoa học của C perfringens:

Giới (Regnum): Bacteria

Ngành (Phylum): Firmicutes

Lớp (Class): Clostridia

Bộ (Order): Clostridiales

Họ (Familia): Clostridiaceae

Chi (Genus): Clostridium

Loài (Species): C perfringens

1.2.1 Đặc điểm hình thái

C perfringens là trực khuẩn Gram dương, hình que, yếm khí và có khả năng tạo nha bào C perfringens có kích thước lớn (0,6 – 0,24 x 1,3 – 19 µm), không di động Khuẩn lạc C perfringens trên môi trường thạch máu có dạng tròn, nhẵn,

bóng, được bao bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài không dung huyết hoàn toàn (do độc tố alpha) Người ta gọi hiện tượng này là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường có bổ sung máu động vật

Vi khuẩn C perfringens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 12 - 50oC, phát triển chậm ở 20oC và ở 43 - 47oC vi khuẩn phát triển nhanh cực độ, có thể tạo

ra một thế hệ trong 8 - 10 phút Vi khuẩn phát triển ở pH 5 - 8 và hoạt tính nền của nước là 0,93 – 0,97

C perfringens có thể sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt nhờ sự

biến đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào với khả năng chịu đựng cao và sản sinh nha bào Nha bào có thể sống sót trong những môi trường khắc nghiệt như nóng, khô, acid, chất tẩy rửa

1.2.2 Đặc tính sinh vật hóa học

C perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí không

đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn khác

- Điều kiện nuôi cấy: C perfringens phát triển tốt ở môi trường yếm khí,

thông thường từ 2 - 10% CO2

- Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp là 37 - 42oC

- Vi khuẩn này có thể phát triển trên các môi trường:

Môi trường Fluid Thioglycollate: Sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở 37o

C, vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường

Môi trường SPS agar hoặc TSC agar: Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn, màu đen do vi khuẩn sinh H2S kết hợp với Fe có sẵn trong môi trường tạo thành kết tủa FeS có màu đen

C, thu được

khuẩn lạc C perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng dung huyết

kép (vòng bên trong dung huyết hoàn toàn - do độc tố theta và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn – do độc tố alpha) Đây là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường thạch máu

Môi trường Litmus milk: Vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây điển hình do đường lactose trong môi trường kiềm bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón casein dẫn đến đổi màu môi trường từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị

pH Litmus Sau đó, các đám vẩn acid bị vỡ nứt ra do sự hình thành hơi

Môi trường Egg yolk: Vi khuẩn phát triển sản sinh men lecithinase phân giải lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc

Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C perfringens và S agalactiae trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc thì các khuẩn lạc của S agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố alpha của C perfringens

Môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm đục môi trường

1.2.3 Đặc tính di truyền

Trong các loài có khả năng gây độc của chi Clostridium, C perfringens là

loài điển hình cho các nghiên cứu di truyền vì tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng

thao tác di truyền dễ dàng Năm 2002, cấu trúc genome hoàn chỉnh của chủng C perfringens đã được công bố bởi Shimizu và cộng sự Bộ nhiễm sắc thể của chủng

này gồm 3031430 bp, với 2660 vùng mã hóa cho các protein và 10 loại rRNA, tổng hàm lượng G + C là 28,6%

Khi cấu trúc genome của C perfringens được so sánh với genome của những vi khuẩn không gây bệnh như C acerabutylicum, sự khác biệt rõ ràng nhất

có liên quan đến các gene sinh độc tố của C perfringens Ngoài các gene độc tố đã biết, Shimizu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác kết hợp trong hệ gene của C perfringens Năm gene dung huyết đã được xác định dựa trên sự tương đồng về khả

năng dung huyết đã được mô tả trong các loài vi khuẩn đã phân loại trước đây Hai type có gene quy định protein liên kết với fibronectin là tương đồng với gene của vi

khuẩn Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis đã cho thấy có sự liên quan đến

các yếu tố gây độc

Trình tự genome của C perfringens cho thấy các gene độc lực không có tác

động cộng gộp với nhau Chỉ có một vài yếu tố di truyền di động có thể được phát hiện và những dấu hiệu của gene theo chiều ngang là khó phát hiện trong genome

của C perfringens Do đó, có thể thấy rằng các type độc tố khác nhau của C perfringens được tiến hóa từ type A bằng cách nhiễm vào các yếu tố ngoài nhiễm

sắc thể nhẹ plasmid và gene nhảy

Gene mã hóa độc tố alpha và theta nằm trên nhiễm sắc thể, nhiều gene mã hóa các loại độc tố khác cũng nằm trên plasmid Gene mã hóa độc tố enterotoxin có thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid

Biểu hiện của alpha toxin và theta toxin được quy định bởi một hệ thống dẫn truyền tín hiệu hai thành phần (VirR/ VirS), một bộ cảm biến histidine kinase, VirS và các yếu tố cần thiết cho một phản ứng, VirR Cơ chế điều hòa xảy ra ở cấp

độ phiên mã các các đột biến có thể thay đổi việc sản sinh cả độc tố alpha và theta

1.3 Cơ chế gây bệnh của C perfringens

Vi khuẩn C perfringens có ở khắp nơi trong thiên nhiên và là một phần của

hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của người và động vật Thường có hai dạng

cơ bản hình thành nên bệnh là vi khuẩn có sẵn trong ruột hoặc thức ăn bị nhiễm vi khuẩn này Ngoài ra, những thay đổi về thành phần môi trường, khẩu phần thức ăn thay đổi đột ngột như cho ăn quá nhiều, thức ăn chứa quá nhiều protein và năng lượng cũng là những nguyên nhân gây bệnh Hoặc do vận động quá mức đã làm

chậm nhu động ruột, giữ lại lâu các vi khuẩn trong ruột làm tăng sự hấp thụ của độc

tố Carbonhydrate không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi cho C perfringens

phát triển nhanh chóng

Một số tác giả khác lại cho rằng C perfringens thường xuyên sống cộng

sinh ở dạ dày Bình thường vi khuẩn này cũng có nhiều ở ruột già, nhưng trong những điều kiện thuận lợi thì nó phát triển quá mức, có thể xâm nhập lên ruột non

và sản sinh ra một lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân chính gây bệnh

1.4 Các loại độc tố của C perfringens [15]

Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C perfringens sản sinh ra hơn 17

loại độc tố khác nhau như alpha, beta, epsilon, iota, beta 2… Dựa vào khả năng sản

sinh 4 loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta phân chia vi khuẩn C perfringens thành 5 type độc tố khác nhau là A, B, C, D và E Trong đó type A sản

sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha, iota Gene mã hóa các loại độc tố có thể nằm ở nhiễm sắc thể, ở plasmid hoặc ở cả nhiễm sắc thể/ Plasmid

Bảng 1.1 Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C Perfringens

Đây là loại độc tố gây chết chính, có hoạt tính enzyme phospholipase C Nó

có khả năng thủy phân màng phospholipid của các loại tế bào khác nhau, làm tan màng hoặc tạo ra dạng cytotoxicity Vai trò của độc tố này là gây xuất huyết, hoại

tử với hoạt tính kết dính tiểu cầu và gây ảnh hưởng đến tính thấm của mao mạch

Alpha toxin tinh chế có khối lượng phân tử là 43kDa và pH ở điểm đẳng điện là 5,4 Năm 1989 ba phòng thí nghiệm ở Anh, Mỹ và Nhật Bản đã đồng thời có

báo cáo về việc nhân dòng gene alpha toxin từ C perfringens Titball và cộng sự ở Anh đã chèn đoạn gene mã hóa độc tố alpha của vi khuẩn này vào plasmid của E coli và phát hiện vi khuẩn E coli mang plasmid tái tổ hợp có phản ứng phân giải

lecithinase trên môi trường Egg yolk Các gene mã hóa cho một loại protein có khối lượng 44,5 kDa và dường như giống với alpha toxin cũng được mô tả TSO và Seibel tại Mỹ cũng với phương pháp tương tự đã phát hiện độc tố alpha được sản xuất từ plasmid của các sinh vật có phản ứng dung huyết trên môi trường thạch

máu Họ đã tìm thấy một đoạn gene dài 2 kb chèn vào plasmid của C perfringens

có chứa một chuỗi dài 1197 nucleotide mã hóa cho 399 amino acid với khối lượng phân tử là 43 kDa Okabe và cộng sự ở Nhật Bản đã thành công trong việc nhân

dòng gene vô tính alpha toxin của C perfringens và cũng cho biết chiều dài của

gene cpa và trình tự acid amin trùng với hai gene nói trên

1.4.2 Beta toxin

Đây là loại độc tố gây chết người lớn, được sản xuất bởi cả type B và type

C Beta toxin là một protein mẫn cảm cao với trypsin gây hoại tử tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột Ngoài ra độc tố Beta còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi Ca2+ của màng gây ra rối loạn chức năng thần kinh bình thường Loại độc tố này có thể được thu hồi từ môi trường lỏng và tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng một cột có chứa kẽm nhiệt phân, cột thứ hai bằng nhựa vinyl ưa nước Độc tố Beta tinh chế có trọng lượng phân tử 40 kDa và

pH đẳng điện là 5,6 Gene mã hóa Cpb gồm 1113 nucleotide mã hóa cho 371 amino

acid

Nó có tính chất tương tự alpha toxin, do đó rất khó để tách riêng hai loại độc

tố này Beta toxin có độc tính rất mạnh: Khi tiêm vào chuột gây tăng huyết áp và nhịp tim, liều gây chết LD 50 cho chuột trưởng thành là 310 và 4500 ng/kg và chỉ cần 2 ng độc tố này có thể gây bệnh trên lợn con

1.4.3 Epsilon toxin

Epsilon toxin được sản sinh ra dưới dạng một tiền độc tố và được hoạt hóa bằng men proteolytic ở lượng thấp Đích của nhóm độc tố này là nhóm lipid:

Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của động vật Eukaryote vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận Độc tố gây hoại tử và gây chết

Epsilon toxin được tạo ra bởi vi khuẩn C perfringens type B và type D Nó

là một protein gồm 311 acid amin với trọng lượng phân tử là 34,25 kDa Loại độc tố này chủ yếu làm ảnh hưởng đến ruột bằng việc tăng tính thấm của thành mạch Do

đó, tăng cường sự hấp thu độc tố và đóng vai trò như là một chất độc gây chết người Sau khi lưu thông vào các cơ quan bên trong cơ thể, nó gây sưng thận, phù

nề ở phổi, màng ngoài tím và làm cho lượng chất lỏng dư thừa

Ảnh hưởng của việc tăng tính thấm thành mạch có thể được chứng minh bằng cách tiêm loại độc tố này vào một vị trí sau đó nó sẽ đi vào hệ tuần hoàn Buxton đã đề xuất một cơ chế hoạt động của độc tố Epsilon trực tiếp hoặc gián tiếp liên quan đến hệ thống adenylcyclase ( hệ thống xúc tác tổng hợp AMP mạch vòng

từ ATP) trong các tế bào bị ảnh hưởng Kỹ thuật ELISA đã phát hiện được độc tố Epsilon và được đề xuất này thay thế việc gây chết chuột và thử nghiệm cho việc sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu

1.4.4 Iota toxin

Có 2 vị trí là vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia) Sau khi độc tố được gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào Độc tố làm tăng tính thấm của mao mạch và tác động lên màng tế bào

Độc tố này được tạo ra bởi vi khuẩn C perfringens type E Ia và Ib được

phân cách bởi điểm đẳng điện Ia có pH đẳng điện là 5,2 và khối lượng phân tử 47,5 kDa Ib có pH đẳng điện là 4,2 và khối lượng phân tử là 71,5 kDa Một hỗn hợp gồm cả hai thành phần Ia và Ib cần thiết cho hoạt động sinh học quan trọng được đo bằng việc gây chết Chuỗi nhẹ Ia là một enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp ADP, cơ vân và protein actin không co rút

1.4.5 Enterotoxin (CPE)

Là một độc tố đường ruột được sản xuất bởi chủng vi khuẩn C perfringens

type A Nhiều nghiên cứu cho thấy CPE còn là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy, viêm ruột và viêm ruột hoại tử ở động vật Gene mã hóa cho CPE là cpe nằm

trên cả nhiễm sắc thể và plasmid của vi khuẩn C perfringens CPR là một đoạn

polypeptide mạch đợn nặng 35 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,3 và tồn tại ở pH 5 - 12 Khi bị nhiễm độc CPE các triệu chứng xuất hiện bao gồm: tiêu chảy, nôn mửa, sốt kéo dài trong vòng 1 ngày, thời gian ủ bệnh từ 6 – 24 giờ, thường từ 10 - 12 giờ

1.4.6 Delta toxin

Được sản sinh bởi vi khuẩn C perfringens type B và C Gene mã hóa độc tố

này có trọng lượng phân tử khoảng 42kDa và pI = 7,1 Độc tố Delta là chất gây nên hiện tượng tiêu máu ở cừu, dê và heo Tuy nhiên, độc tố này lại bị ức chế bởi các hạch bào có ở người, ngựa, chuột và các động vật có vú khác

1.4.7 Theta toxin

Được tạo ra bởi tất cả các type của vi khuẩn C perfringens Là yếu tố tạo nên một trong hai vòng dung huyết của khuẩn lạc vi khuẩn C perfringens khi nuôi

cấy chúng trên môi trường thạch máu Độc tố này có khả năng tiêu hủy tế bào và rất

dễ bị biến đổi hoạt tính khi có oxy Gene mã hóa của theta nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn

1.5 Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens và khả năng gây

bệnh

C perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau, người ta dựa vào 4

loại độc tố chính để chia thành 5 type độc tố

Bảng 1.2 Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens

Các chủng C perfringens thuộc type này được tìm thấy nhiều nhất ở ruột,

môi trường sống của những động vật máu nóng và đất Độc tố type A gây nên sự viêm nhiễm các vết thương gây hoại tử và còn là yếu tố chính gây nên các bệnh về đường ruột ở động vật Các chủng type A cũng thường được phân lập từ vùng tai giữa, dạ múi khế ở dê mắc bệnh Triệu chứng thường thấy ở những con vật này là

xuất huyết niêm mạc dạ múi khế Cũng có thể xuất hiện một vài hiện tượng của bệnh tiêu chảy nhưng những thương tổn đường ruột thường không thể nhận thấy vì quá trình tự phân diễn ra rất nhanh

C perfringens type A cũng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà Triệu chứng

đầu tiên khi gà mắc bệnh là giảm cân, sau đó suy nhược, biếng ăn, tiêu chảy Những triệu chứng trên thường diễn ra trong thời gian ngắn, khó quan sát được hiện tượng

và khi phát hiện bệnh thì gà đã chết vi khuẩn type A thường tồn tại trong đường tiêu hóa của gà, đất, bụi cùng những phần thức ăn ôi thiu Chế độ ăn uống không

hợp lý cũng có thể làm gia tăng số lượng vi khuẩn C perfringens trong ruột gà tăng lên, dẫn tới bị bệnh Số lượng gà chết do vi khuẩn C perfringens sẽ là rất ít nếu chúng được tiêm chủng với hai loại vi khuẩn Lactobacillus acidophilus hoặc Enterococcus faecalis Việc phát triển một trong hai loại vi khuẩn này trong đường ruột gà sẽ ngăn chặn khả năng sản sinh độc tố alpha của vi khuẩn C perfringens

Bệnh đường ruột do type A gây nên cũng được phát hiện ở lợn sữa, với những triệu chứng thường thấy như rụng lông hay hoại tử đường ruột dạng nhẹ Hiện tượng trên thường phát triển ở những vùng ruột nhỏ của lợn như ruột chay và ruột hồi Khi nuôi cấy vi khuẩn từ những vùng tổn thương này thì số lượng vi khuẩn

C perfringens thấy được là rất lớn

1.5.2 Type B

C perfringens type B là tác nhân chính gây nên bệnh lị ở cừu non và cả cừu

trưởng thành Cừu non mắc bệnh lị ngay từ những ngày đầu tiên khi mới sinh ra Nguyên nhân là do sự lây nhiễm vi khuẩn này từ cừu mẹ và môi trường sang cừu con Lúc này, vi khuẩn trong đường ruột sẽ tăng lên một cách nhanh chóng, đặc biệt

là khi cừu con bú sữa mẹ Kết quả là ruột cừu sẽ bị loét và xuất huyết rồi chết một cách nhanh chóng Triệu chứng cấp tính có thể nhận thấy là cừu không ăn uống, đau bụng, cộng với hiện tượng tiêu chảy ra máu, nằm nghiêm, hôn mê và chết chỉ trong vòng 24 giờ Tỷ lệ mắc bệnh này ở cừu thường khoảng 30%, trong một vài trường hợp tỷ lệ này có thể lên đến 100% Bệnh mãn tính ở những con cừu trưởng thành cũng kèm theo chứng đau bụng mãn tính nhưng sẽ không bị tiêu chảy Ngoài ra, type B cũng là nguyên nhân gây nên chứng xuất huyết đường ruột ở dê, bê, lừa và ngựa

Vẫn còn rất ít nghiên cứu về khả năng gây bệnh của vi khuẩn type B này đối với động vật Khả năng gây bệnh của chúng là đơn lẻ hay cộng gộp với các loại độc

tố khác vẫn còn là vấn đề đang được tranh cãi

1.5.3 Type C

Vi khuẩn C perfringens type C gây nhiễm độc tố ở heo, cừu, ngựa, gà chó

và cả người Gia súc, gia cầm mới sinh là những đối tượng dễ bị lây nhiễm nhất Vi khuẩn gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ Sự thay đổi thành phần thức ăn đột ngột của những động vật còn nhỏ là một yếu tố

thuận lợi cho sự nhiễm vi khuẩn C perfringens type C vào cơ thể vật chủ Tỷ lệ lây

nhiễm thường khác nhau ở những bày đàn, chuồng trại khác nhau thông thường khoang 30 – 50%, nếu không được chữa trị hay ngăn chặn kịp thời trong vòng 24 giờ thì tỷ lệ đó có thể lên đên 50 – 100% Lơn con là loài dễ bị lây nhiễm hơn cả, bệnh xuất hiện khi lợn con mới chỉ từ 1 đến 2 ngày tuổi Triệu chứng đi kèm là suy nhược cơ thể, tiêu chảy, bệnh lỵ, xuất hiện máu và những tế bào ruột bị hoại tử ở trong phân Đối với lợn được 1 đến 2 ngày tuổi, khi mắc bệnh thời gian điều trị sẽ phải kéo dài, vì lúc này các triệu chứng bệnh đã nặng và phức tạp hơn nhiều như mất nước, tiêu chảy cấp, niêm mạc ruột có màu đỏ sậm sau đó là bị hoại tử Hoại tử không chỉ xuất hiện ở niêm mạc ruột mà nó còn lan rộng đến cả màng cơ nhẵn trong một số tổ hợp màng nhầy khác Triệu chứng bệnh cũng được thấy tương tự ở dê, bò

và cừu như đau bụng, tiêu chảy, kêu rống, điên cuồng, mất phương hướng

Cừu khoảng từ 3 đến 10 tuần tuổi hay những con cừu cái đang cho con bú sẽ rất dễ mắc bệnh do độc tố type D gây ra Cừu non sau khi cai sữa sẽ không sử dụng sữa mẹ như là thức ăn chính nữa mà thay vào đó là những loại cây cỏ hay thức ăn

có hàm lượng tinh bột cao Chính sự thay đổi thành phần, hàm lượng các chất có trong thức ăn làm rối loạn hoạt động của đường ruột trong một thời gian ngắn Vì vậy, đây là lúc mà con vật dễ bị tiêm nhiễm độc tố type D nhất Độc tố này cũng gây nên các bệnh tương tự ở dê, bò, bê, ngựa Tuy nhiên, riêng đối với dê, còn xuất hiện một số triệu chứng khác như viêm chảy, tơ huyết, xuất huyết đường ruột nhưng lại không bị mềm thận như ở cừu

một loại vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều Ngoài khả năng gây nhiễm độc tố đường ruột ở bê, bò, chuột lang và thỏ, thì độc tố này có khả năng gây nên bệnh lỵ ở cừu

Mỗi type độc tố khác nhau gây ra các loại bệnh khác nhau trên các đối tượng khác nhau Các type độc tố gây bệnh được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn

C perfringens

- Viêm ruột hoại tử

- Viêm ruột nhiễm độc máu

α, β, ε - Viêm ruột nhiễm độc máu - Ngựa non, cừu và dê

α, β

- Viêm ruột hoại tử

- Viêm ruột nhiễm độc máu

chuẩn đoán và phân tích di truyền

PCR được sử dụng để thúc đẩy nhanh quá trình khám phá bộ gene người và phát hiện sớm các bệnh virus PCR làm thuận lợi cho việc tạo dòng các trình tự DNA và tạo thành một cơ sở tự nhiên cho việc giải trình tự bằng phương pháp Sanger Ngoài việc để tổng hợp lượng lớn mạch khuôn để giải trình tự, PCR đã được sử dụng để xây dựng bản đồ nhiễm sắc thể và để phân tích những thay đổi lớn nhỏ trong cấu trúc nhiễm sắc thể

1.6.1 Nguyên tắc phản ứng

Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được dùng

để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ số lượng, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’ – 5’ được gọi là primer xuôi (forward primer, ký hiệu là F) Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’ – 3’ được gọi là primer ngược (reverse primer, ký hiệu là R)

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 1.3 Theo đó, từ chu kỹ thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp có khoảng 10 – 20 nucleotide hoặc hơn Nếu biết trình tự của đoạn gene cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di PCR

µg DNA ban đầu có thể khuếch đại lên tới 1µg

Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 bước cơ bản:

Bước 1: Denaturation - biến tính ở 90 – 95o

C Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strainds) Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại

C

Trong gian đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và đứt gãy liên tục giữa các primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn đinh hơn tạo thành một đoạn nhỏ và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng

có thể rất rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide của primer, thông thường khoảng

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuỗi PCR

Hình 1.4 Các chu kỳ của phản ứng PCR

1.6.2 Các điều kiện của phản ứng PCR

- DNA mẫu

DNA mẫu là DNA có chứa đoạn gene cần nhân lên Phản ứng khuếch đại đạt tối ưu nếu DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng theo lý thuyết là một bản copy DNA đủ cho phản ứng PCR, tuy nhiên để phản ứng đạt hiệu quả thì lượng mẫu có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các polymerase Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại DNA tạp tạo những sản phẩm không mong muốn Một ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy tứng phần như trong các vết máu để lâu ngày, tính dịch đã khô, các hóa thạch…

- Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I Vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải thêm enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ thấp khiến sự khuếch đại các sản phẩm phụ cao…) Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng Taq – Thermus aquaticus Enzyme Tap polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính DNA và xúc tác tổng hợp DNA từ đầu đến cuối quá trình phản ứng

Các loại enzyme polymerase cho phản ứng PCR được trình bày ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Các loại enzyme cho phản ứng PCR Enzyme Sinh vật Độ chính

xác

Hiệu suất Độ ổn đinh

+ Taq polymerase hiệu quả cao và thường được sử dụng