Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được từ gà bệnh và gà khỏe đều thuộc type A phù hợp với nhiều nghiên cứu đã công bố trên thế giới. Các chủng C. perfringens phân lập từ gà thuộc type A, có nghĩa là chúng mang gene cpa mã hóa độc tố alpha. Trong những năm trước đây, người ta cho rằng độc tố alpha là yếu tố độc lực chính gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà [23].Tuy nhiên những nghiên cứu gần đầy cho thấy, ngoài độc tố alpha, các các chủng C. perfringens còn mang thêm các gene cpe, netB lần lượt mã hóa enterotoxin và netB toxin, trong đó độc tố netB mới được phát hiện năm 2008 ở các chủng type A phân lập từ gà mắc bệnh NE ở Úc [27]. Trên cở sở đó chúng tôi tiến hành xác định sự hiện diện của các gene mã hóa độc tố netB trong các chủng vi khuẩn C. perfringens lập phân được. Kết quả xác định gen mã hóa netB toxin được thể hiện ở hình 3.8
Hình 3.9. Kết quả điện di xác định gene netB
Từ hình cho thấy, các sản phẩm đều nằm ở vạch 384 bp tương ứng với kích thước mà đoạn gene mã hóa độc tố netB mà nhà thiết kế mồi đưa ra. Kết quả cho thấy 4/22 chủng cho kết quả dương tính với gene netB chiếm tỷ lệ 18,18%. Trong đó có 1 chủng được phân lập từ gà khỏe mạnh và 3 chủng còn lại được phân lập từ gà bị bệnh NE.
Độc tố netB mới được phát hiện năm 2008 ở các chủng type A phân lập từ gà mắc bệnh NE ở Úc theo nghiên cứu của Keyburn và cộng sự [27]. Nghiên cứu của Keyburn đã cho thấy có 31/44 chủng type A phân lập từ gà bệnh NE ở Úc, Bỉ, Đan Mạch và Canada mang gen netB (70%) và chỉ có 2 trong số 55 chủng type A phân lập từ gà khỏe ở Úc và Bỉ mang gene netB (3,6%). Theo A. Tolooe thì tỷ lệ các chủng mang gene mã hóa độc tố netB là 52,80%, trong số đó chủ yếu là các chủng phân lập từ gà có triệu chứng viêm ruột hoại tử [8]. Theo Abildgaard thì không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ các chủng gene netB phân lập từ gà khỏe mạnh và gà bệnh NE, tỷ lệ nàylần lượt là 50,00% và 60,00%. [9]
M P N 4 5 11 16 19 20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Từ những kết quả nghiên cứu chúng tôi đi đến một số kết luận nhau sau: (1) Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang là 57,89%, trong đó tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở gà khỏe là 50,00%, ở gà bệnh NE là 63,67%.
(2) Tất cả các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lâp được đều mang đầy đủ các đặc tính sinh vật hóa học như các tài liệu đã mô tả.
(3) Các chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập là thuộc type A, có duy nhất 1 chủng type A mang thêm gene cpe mã hóa enterotoxin.
(4) Có 4/22 chủng vi khuẩn C. perfringens type A cho kết quả dương tính với gene netB chiếm tỷ lệ 18,18%. Trong đó có 1 chủng được phân lập từ gà khỏe mạnh và 3 chủng được phân lập từ gà bị bệnh NE.
2. Đề nghị
- Nên mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các địa phương khác cũng như tăng số lượng mẫu để thu được kết quả chính xác hơn.
- Các nghiên cứu trong thời gian tới nên tập trung vào vai trò gây bệnh NE của các loại độc tố, nhất là độc tố NetB.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên. 2009. Một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ bò và lợn mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Nội và các vùng phụ cận. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVI, số 4.
2. Lê Lập, Nguyễn Đức Tân. 2006. Phân lập và xác định type độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplx PCR. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn 2007, số 9.
3. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung. 2001. Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyên, Phạm Văn Ty.2000. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục.
5. Võ Thị Hương Lan. 2007. Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng. Nhà xuất bản giáo dục.
6. Thường quy kỹ thuật định lượng C. perfringens trong thực phẩm (Ban hành theo quyết định số 3348/QĐ-BYT ngày 31 thàng 7 năm 2001 của Bộ trưởng bộ y tế).
7. Trần Linh Thước. 2007. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
8. A.Tolooe, B.Shojadoost, S.M.Peighambari and Y. Tamaddon. 2011.
Prevalence of NetB among Clostridium perfringens isolates Obtained from healthy and diseased chicken, Journal of animal and veteriany advantage 10 (1): 106 – 110. 9. Abildgaard L., Sondergaard T.E., Engberg R.M., Schramm A., Hojberg O., 2010. In vitro production of necrotic enteritis toxin B, NetB, by netB- positive and netB-negative Clostridium perfringens originating from healthy and diseased broiler chickens. Vet Microbiol. 29;144(1-2):231-235.
10. Agi Deguchi, Kazuaki Miyamoto, Tomomi Kuwahara, Yasuhiro Miki, Ikuko Kaneko, Jihong Li, Bruce A, McClane, Shigeru Akimoto. Genetic characterization of type A enterotoxingenic Clostridium perfringens strains
http://plosone.org
11. Ahsani MR, Mohammadabadi MR, Shamsaddini MB. 2010.
Clostridium perfringens isolate typing by multiplex PCR . Journal of venomous animals and toxins including tropical diseases, volume 16, number 4, 2010.
12. Anders Johansson. 2006. C. perfringens the causal agent of necrotic enteritis in poultry.Acta Universitatis agriculturae Sueciae, 1652-6880
13. Annamari Heikinheimo.2008. Diagnostic and molecular epidemiology of cpe – positive C. perfringens type A.
14. Anthony L. Keyburn, John D. Boyce, Paola Vaz, Trudi L. Bannam , Mark E. Ford, Dane Parker, Antonio Di Rubbo, Julian I. Rood, Robert J. Moore. 2008. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLOS Pathog., 4: e26-e26. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15. Anthony L. Keyburn; Bannam, T.L.; Moore, R.J.; Rood, J.I. 2010.
NetB, a Pore-Forming Toxin from Necrotic Enteritis Strains of Clostridium perfringens. Toxins2, 1913-1927.
16. Cato, E.P. W.L. Geonge, and S.M. Finegold. 1984. Clostridium, 1141 – 1200.
17. Charles L.Hatheway. 1990. Toxigenic Clostridia. Clinical microbiology review, 66 – 98.
18. Christoph G Baums, Ulrich Schotte1, Gunter Amtsberg, Ralph Goethe. Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolate. Veterinary Microbiology, Volume 100, Issues 1 – 2, 20 May 2004, Pages 11 – 16.
19. Crespo Rocio, Derek J. Fisher, H. L. Shivaprasad,Mariano E. Ferna ´ndez-Miyakawa, Francisco A. Uzal. 2007. Toxinotypes of Clostridium perfringens isolated from sick and healthy avian species. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation May 2007 19: 329-333.
20. Drigo I., Fabrizio Agnoletti, Cosetta Bacchin, Francesca Bettini, Monia Cocchi, Tiziana Ferro, Barbara Marcon, Luca Bano. Toxin genotyping of Clostridium perfringens feld strains isolated from healthy and diseased chickens.
Italian Journal of Animal Science vol. 7, 397-400.
21. Deguchi A, Miyamoto K, Kuwahara T, Miki Y, Kaneko I, et al. 2009.
Genetic Characterization of Type A Enterotoxigenic Clostridium
perfringens Strains. PLoS ONE 4(5): e5598.
22. Effat, M. M1*; Abdallah, Y.A.2, Soheir, M. F.1, and Rady, M3. 2007.
Characterization of Clostridium perfringens feildisolates, implicated in necrotic enteritis outbreaks onprivate broiler farms in Cairo, by Multiplex PCR. African Journal of Microbiology Research pp, 029-032.
23. Fukata T., Y. Hadate, E. Baba, and A. Arakawa. 1991. Influence of bacteria on Clostridium perfringens infections in young chickens. Avian Dis. 35: 224–227.
24. George Tice, BVSc, MMedVet, MRCVS. Clostridial Proliferation and Intestinal Instability. http://poultry-health.com
25. J. Glenn Songer and Dawn Bueschel. 1999. Multiplex PCR Procedure for genotyping Clostridium perfringens. Department of Veterinary Science University of Arizona, Tucson, AZ 85721
26. Hakan Kalender. 2004. Isolate of Clostridium perfringens from chickens and detection of the alpha toxin gene by Polymerase chain reaction. Turk J Vet Anim Sci, 29 (2005), 847 – 851.
27. Keyburn AL, Sheedy SA, Ford ME, Williamson MM, Awad MM, Rood JI, Moore RJ. 2006. Alpha-toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens. Infection and Immunity 74 (11): 6496-6500
28. Leen Timbermont, Anouk Lanckriet, Ahmad R.
Gholamiandehkordi, Frank Pasmans, An Martel,Freddy Haesebrouck, Richard
Ducatelle, Filip Van Immerseel. Origin of Clostridium perfringens isolates
29. Lepp D, Roxas B, Parreira VR, Marri PR, Rosey EL, et al. 2010.
Identification of Novel Pathogenicity Loci in Clostridium perfringens Strains That Cause Avian Necrotic Enteritis. PLoS ONE 5(5): e10795.
30. Long, J.R. 1973. Necrotic enteritis in broiler chickens I.A review of the literature and the prevalence of the disease in Ontario. Canasian Journal of comparative medicine, 37 (3): 302 – 308.
31. McDonel, J. L.1980. C. perfringens toxins (type A, B, C, D, E).
Pharmacol. Ther. 10: 617-655 [6]
32. Quinn P.J., M.E. Cater, B. Markey, G.R. Cater. 1994. Clostridium speciesm Clianl verternary microbiology. Wolfe publishing, 191 – 208.
33. Svobodová I., Steinhauserova I., Nebola M.. 2007. Incidence of C. perfringens in broiler chickens in the Szech Republic. S25-S30. ACTA VET. BRNO,
76: 25–30
34. http://PoultryHub.org 35. http://enhs,umn.edu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
36. http://vi.wikipedia.org/wiki/Clostridium
PHỤ LỤC
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI
1. Fluid Thioglycollate medium
Peptone from casein 15g Yeast extract 5g D (+) Glucose 5,5g L – Cystine 0,5g Sodium Chloride 2,5g Resazurin Sidium 0,001g Agar – agar 0,75g pH 7,1 ± 0,2 Tổng 28,251g
Cân 28,251g hóa chất cho vào bình tam giác, bổ sung 1l nước cất rồi đem hấp 121oC trong 15 phút.
2. Tryptose - Sulfide - Cycloserine (TSC agar)
Tryptose (Difco) 15g
Men thủy phân 5g
Soyton 5g
Sắt ammonium citrate 1g Natri metabisunfit 1g
Agar 20g
pH 7,6 ± 0,2
Cân 47g hóa chất cho vào bình tam giác, bổ sung 900ml nước cất. Hấp ướt tới 1210C trong 15 phút.
3. Brain Heart Broth
Nutrient substrate 27,5g
D (+) Glucose 2g
Sodium Chloride 5g
Di – Sodium Hydrogen Phosphate 2,5g
pH 7,4 ± 0,2
Tổng 37g
Cân 37g hóa chất cho vào bình tam giác, bổ sung 1l nước cất sau đó đem hấp ở 121o
C trong 15 phút.
4. Blood agar:
Cân 37g BHI cho vào 1 l nước cất, bổ sung thêm 16% agar. Sauk hi hấp 121oC trong 15 phút, để nguội khoảng 45 – 60o
C, bổ sung thêm 5 – 10% máu thỏ. Sau đó rót ra đĩa petri.
5. Các môi trƣờng đƣờng
Pepton 10g
NaCl 5g
Phenol red 0,2% 12,5ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Glucose( Maltose, Saccharose, Lactose) 10g
Agar – agar 5g
pH 7,2
Tổng 42,5g
Cân chính xác 42,5g các hóa chất cần thiết cho vào bình tam giác, hòa tan các chất trong 1l nước cất sau đó đem hấp ở 100oC trong 30 phút.
6. Litmus milk
Skim milk powder 100g
Litmus 0,5g
Sodium disulfile 0,5g
pH 6,8 ± 0,2
Tổng 101g
Cân 101g môi trường cho vào bình tam giác, bổ sung 1l nước cất rồi đem hấp ở 121o
C trong 15 phút.
7. Egg yolk agar
Casein enzymic hydrolysate 15g Papaic digest of soyabean meal 5g
Yeast extract 5g Sodium chloride 5g L – Systine 0,4g Hemin 0,005g Vitamin K1 0,01g Agar – agar 20g pH 7,5 ± 0,2 Tổng 50,415g
Cân 50,401 g môi trường cho vào bình tam giác, bổ sung 900ml nước cất rồi đem hấp ở 121oC trong 15 phút. Để nguội đến 50 – 55o
C thêm 100ml lòng đỏ trứng gà lắc đều sau đó rót ra các đĩa petri.