Multiplex PCR
Dựa vào khả năng sảnsinh các loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon và iota, các nhà khoa học đã chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố khác nhau là A, B, C, D và E. Để xác định các type độc tố của 22 chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng bằng kỹ thuật Multiplex PCR theo phương pháp của Songer [25]. Kết quả điện di được minh họa ở hình 3.7.
Hình 3.8. Kết quả điện di định type vi khuẩn C. perfringens
Theo tài liệu thì mỗi type độc tố có khả năng sản sinh các loại độc tố khác nhau: type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha và beta; type D sản sinh độc tố alpha và epsilon; type E sản sinh độc tố alpha và iota. Từ hình 3.7 cho thấy, các đoạn sản phẩm của PCR đều nằm ở vạch có kích thước 324 bp tương ứng với kích thước của đoạn gene mã hóa độc tố alpha mà nhà thiết kế mồi đưa ra. Ngoài ra, có 1 chủng (chủng số 6) dương tính đồng thời 2 vạch có kích thước 324 bp và 233 bp tương ứng với kích thước của đoạn gene mã hóa độc tố alpha và enterotoxin. Kết quả xác định các type độc tố của 22 chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập được trình bày ở bảng 3.3.
M N P 1 2 3 4 5 6 11 12 13
324bp
Bảng 3.3. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens
Nguồn gốc chủng Số chủng kiểm tra
Type A Type B Type C Type D Type E
+ % + % + % + % + %
Phân gà khỏe 8 8 100 0 0 0 0 0 0 0 0
Phân gà bệnh 14 14 100 0 0 0 0 0 0 0 0
Tổng 22 22 100 0 0 0 0 0 0 0 0
Ghi chú: +: Số chủng dương tính
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy tất cả 22 chủng được kiểm tra đều cho kết quả dương tính với gene cpa mã hóa độc tố alpha, thuộc type A. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã được công bố: Theo Crespo tất cả 31 chủng C. perfringens phân lập từ gà, gà tây, cút, vẹt khỏe mạnh (19 chủng) và mắc bệnh NE (12 chủng) ở California, Mỹ đều thuộc type A (100%) [19]. Theo Svobodová 112/112 chủng C. perfringens phân lập từ gà thịt khỏe mạnh ở Séc đều thuộc type A [33]. Drigo cũng xác định 100% chủng C. perfringens phân lập từ gà khỏe và gà mắc bệnh NE ở Italy thuộc type A.[20]