- Máy ly tâm, máy PCR..
- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác…
2.3.2. Hóa chất, môi trƣờng và thuốc thử
- Hóa chất cho phản ứng PCR, Multiplex PCR
- Môi trường sử dụng để phân lập, nuôi cấy, giữ giống, test sinh hóa vi khuẩn C. perfringens.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu phân gà ở các hộ chăn nuôi trên địa bàn thành phố Nha Trang. Trong đó mẫu phân được lấy ở gà bị bệnh và gà khỏe mạnh.
- Gà bị bệnh là gà có biểu hiện các triệu chứng: suy nhược, xù lông, biếng ăn, nhắm mắt lại, ủ rũ, tiêu chảy, phân có lẫn máu.
- Gà khỏe mạnh: không có các triệu chứng trên.
Mẫu phân được lấy bằng cách dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào lỗ huyệt rồi cho vào ống eppendorf có chứa môi trường vận chuyển STUART transport medium, bảo quản lạnh, vận chuyển càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
2.4.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học
Sử dụng phương pháp thường quy phân lập của Quinn và cộng sự (1994) - Quy trình
Thuyết minh quy trình:
- Mẫu phân ngay sau khi thu nhận được đem nuôi cấy tăng sinh trên môi trường Fluid Thioglycollate. Lấy kẹp gắp miếng tăm bông có mẫu phân cho vào ống nghiệm đã được chế môi trường Fluid Thioglycollate. Lắc đều cho mẫu hòa tan vào môi trường, rồi gắp miếng tăm bông ra. Sau đó đem ống nghiệm đun ở 70 – 75oC trong 30 phút để loại bớt khí oxy cũng như vi khuẩn tạp không chịu nhiệt. Đem ủ trong tủ ấm ở 37o
C, 10% CO2 trong 6 - 8 giờ.
- Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng canh khuẩn vừa đủ từ môi trường Fluid Thioglycollate cấy ria sang môi trường TSC agar. Đem ủ trong túi yếm khí 90% N2, 10% CO2 ở 37oC trong 24 - 28 giờ.
- Dùng que cấy chọn khuẩn lạc đen, tròn, nhẵn trên môi trường TSC agar cấy ria trên môi trường Blood agar. Đem ủ trong túi yếm khi 90% N2, 10 % CO2 ở 37o
C trong 24 - 28 giờ. Mẫu Phân lập C. perfringens Fluid Thio- glycola te Môi trường đặc hiệu TSC agar Chọn khuẩn lạc đen tăng sinh trên môi trường thạch máu Xác định các đặc tính sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn Định type vi khuẩn
- Tiến hành giám định các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens.
2.4.3. Kiểm tra khả năng di động bằng phƣơng pháp soi tƣơi [4] [7]
Làm tiêu bản giọt treo:
- Sử dụng phiến kính có một mặt cầu lõm và lamen.
- Dùng que cấy vòng lấy một giọt canh khuẩn từ môi trường Fluid Thioglycollate đặt vào giữa lamen.
- Lấy vaselin chấm vào 4 góc lamen và lật ngược thật nhanh lamen xuống để giọt dịch treo dưới lamen.
- Đặt nhẹ nhàng lamen xuống vòm lõm của phiến kính sao cho giọt treo không chạm xuống đáy hoặc thành vòm lõm.
- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính dầu 100X.
2.4.4. Phƣơng pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn [4] [7]
Để kiểm tra hình thái của vi khuẩn chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm Gram, soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100X.
Làm tiêu bản: Dùng que cấy lấy một giọt canh khuẩn, dàn đều canh khuẩn trên một lam kính sạch. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn, hơ mặt dưới của lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, tránh không để tiêu bản quá nóng.
Tiến hành nhuộm: Phủ dung dịch Crystal Violet lên lam kính đã được cố định trong 1 phút, rửa Crystal Violet với nước cất. Phủ dung dịch Lugol trong 1 phút sau đó rửa nhẹ với nước cất. Cầm một đầu lam kính nhỏ từ từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến phết bạc màu đi (thời gian tẩy cồn thông thường khoảng 5 - 10 giây), rửa ngay với nước để dừng công đoạn tẩy cồn. Sau đó phủ dung dịch Fuchsin lên lam kính 1 phút, đổ bỏ dung dịch và rửa nhẹ qua nước.
Để tiêu bản khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm để thấm khô, quan sát hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 100X.
2.4.5. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học
- Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu: dùng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ môi trường Fluid Thioglycolate ria đều lên trên bề mặt thạch máu. Sau đó bỏ trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 37oC, 10% CO2 nuôi cấy trong vòng 24 - 48 giờ, nêu xung quanh khuẩn lạc có 2 vòng dung huyết thì phản ứng dương tính và ngược lại.
- Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, saccarose: Dùng que cấy vô trùng chọn lấy một khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống đáy mỗi ống nghiệm có từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37oC, 10% CO2. Sau 24 - 48 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ snag vàng và ngược lại.
- Kiểm tra khả năng sinh hơi: vi khuẩn có khả năng sinh hơi nếu trên các môi trường đường, thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên và ngược lại.
- Kiểm tra trên môi trường Mannitol – Motility: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy 1 đường chích sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37oC từ 24 – 28 giờ sau đó đọc kết quả. Vi khuẩn có khả năng lên men đường thì sẽ làm môi trường chuyển từ đỏ sang vàng với chỉ thị phenol đỏ. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy, vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy.
- Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Limus milk: dùng que cấy vi trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 10% CO2 sau 24 – 28 giờ kiểm tra. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn lên men lactose làm đông vón casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu sang trắng với chỉ thị pH litmus.
- Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Egg yolk: Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy ria đều trên môi trường Egg yolk. Bỏ đĩa vào trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 37oC, 10% CO2 sau 24 – 28 giờ lấy ra đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men lecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.
2.4.6. Phƣơng pháp giữ giống vi khuẩn C. perfringens
Dùng pipet 1000 µl, hút 1000 µl môi trường nuôi cấy vi khuẩn cho vào ống eppendorf. Tiến hành ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong 5 phút. Bỏ phần nước trong, giữa lại phần cặn. Hút tiếp 500 µl glycol nguyên chất hòa vào phần cặn, sau đó bổ sung thêm 500 µl môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Fluid Thioglycollate). Votex cho hỗn hợp đồng nhất sau đó giữ lạnh ở nhiệt độ - 80oC.
2.4.7. Phƣơng pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR [11] [25]
Xác định type độc tố của vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR theo phương pháp của Songer và cộng sự (1999)
- Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để tách chiết DNA của các chủng C. perfringens đã phân lập theo phương pháp giám định đặc tính sinh vật hóa học
+ Bước 1: hút 200 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn trong môi trường Fluit Thioglycolate) cho vào ống eppendorf. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn có chứa xác vi khuẩn.
+ Bước 2: thêm 200µl nước siêu sạch vào ống chứa cặn, rồi tiến hành đồng nhất mẫu, đun cách thủy ở 100oC trong 10 phút. Làm lạnh nhanh trong ngăn đông tủ lạnh 4 - 8oC trong thời gian 5 phút.
+Bước 3: Ly tâm ở 4o
C tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Thu dịch nổi có chứa DNA dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR. Sau đó DNA được bảo quản ở -20oC.
- Dựa vào việc xác định gene mã hóa các độc tố chính của vi khuẩn đã phân lập được bằng phản ứng Multiplex PCR để xác định các type độc tố vi khuẩn.
Trình tự các mồi được sử dụng trong phản ứng được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens
Gene Mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản
phẩm PCR (bp)
Cpa Cpa – F 5’ GCTAATGTTACTGCCGTTGA 3’ 324
Cpa – R 3’ CCTCTGATACATCGTGTAAG 5’
Cpb Cpb – F 5’ GCGAATATGCTGAATCATCTA 3’ 196
Cpb – R 3’ GCAGGAACATTAGTATATCTTC 5’
Etx Etx – F 5’ GCGGTGATATCCATCTATTC 3’ 655
Etx – R 3’ CCACTTACTTGTCCTACTAAC 5’
iA iA – F 5’ ACTACTCTCAGACAAGACAG 3’ 446
Cpe Cpe-F 5’ GGAGATGGTTGGATATTAGG 3’ 233
Cpe-R 3’ GGACCAGCAGTTGTAGATA 5’
Cpb2 Cpb2-F 5’AGATTTTAAATATGATCCTAACC 3’ 567
Cpb2-R 3’ CATACCCTTCACCAAATACTC 5’
- Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR được thể hiện ở bảng
2.2.
Bảng 2.2. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 Go Taq 2X 12,5 2 Cpa – F 10 pmol 0,25 3 Cpa – R 10 pmol 0,25 4 Cpb – F 10 pmol 0,25 5 Cpb – R 10 pml 0,25 6 Etx – F 10 pml 0,25 7 Etx – R 10 pml 0,25 8 iA – F 10 pml 0.25 9 iA – R 10 pml 0,25 10 Cpe – F 10 pml 0,25 11 Cpe – R 10 pml 0,25 12 Cpb2 – F 10 pml 0,25 13 Cpb2 – R 10 pml 0,25
14 DNase – free water 6,5
15 DNA khuôn 3
Tổng 25
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex PCR
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút)
Giai đoạn 1 1 94 4 Giai đoạn 2 30 94 1 55 1 72 1 Giai đoạn 3 1 72 10
- Điện di sản phẩm PCR điện di: Các bước điện di được tiến hành như sau: Chuẩn bị thạch: Cân 1,5 g agarose cho vào 100 ml đệm TBE rồi cho hỗn hợp vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, lắc đều và cho vào lò vi sóng đun khoảng 5 phút để làm nóng chảy agarose và đảm bảo agarose tan hoàn toàn.
Đổ gel: Chuẩn bị bể điện di đã được cài lược. Để nguội gel ở khoảng 45oC rồi bổ sung 6 – 8 µl thuốc nhuộm Ethydium bromide vào lắc đều. Đổ gel vào bể điện di. Chờ khoảng 30 phút cho gel đông lại, bắt đầu tiến hành tháo lược.
Điện di: Hút 10 µl dung dịch mẫu tra vào các giếng. Theo thứ tự, giếng thứ nhất là Marker, giếng thứ 2 là đối chứng dương, giếng thứ 3 là đối chứng âm (nước siêu sạch) và lần lượt các giếng còn lại là mẫu. Bật công tác tiến hành quá trình chạy điện di.
Đọc kết quả: Sau khoảng 30 – 40 phút, chờ cho quá trình điện di diễn ra hoàn toàn, tắt công tắc. Lấy bản gel ra cho vào máy đọc kết quả.
2.4.8. Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR [8]
- Trình tự cặp mồi của gene mã hóa độc tố netB được thể hiện ở bảng 2.4. Bảng 2.4. Trình tự cặp mồi của gene netB
Gene Mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản
phẩm (bp)
netB netB – F
5’ GCTGGTGCTGGAATAAATGC 3’ 384
- Thành phần tham gia phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định gene netB
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Go Taq 12,5 2 netB – F 0,25 3 netB – R 0,25 4 Water 7 5 DNA khuôn 5 Tổng 25
- Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR xác định gene netB Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
Giai đoạn 1 1 94 2 phút
Giai đoạn 2 35 94 30 giây
55 30 giây
72 1 phút
Giai đoạn 3 1 72 12 phút
2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học. Số mẫu dương tính
Tỷ lệ dương tính = x 100%
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang phố Nha Trang
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang Nha Trang
Để xác định mức độ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên gà ở thành phố Nha Trang, chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở địa bàn nội thành, thành phố Nha Trang. Tổng cộng lấy được 38 mẫu phân gà bao gồm cả gà khỏe mạnh và gà bị bệnh tiêu chảy. Với 38 mẫu phân gà thu nhận được, tiến hành phân lập và giám định một số đặc tính sinh vật hóa học để xác định sự có mặt của vi khuẩn C. perfringens theo phương pháp của Quinn và cộng sự [32]. Kết quả phân lập được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens từ mẫu phân thu đƣợc
Mẫu phân Số mẫu phân lập Số dƣơng tính Tỷ lệ (%)
Gà khỏe mạnh 16 8 50,00
Gà bị bệnh 22 14 63,67
Tổng mẫu 38 22 57,89
Qua bảng 3.1 cho thấy trong số 38 mẫu phân được phân lập thì có 22 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens chiếm tỷ lệ 57,89 %. Trong số 22 mẫu dương tính có 14 mẫu được phân lập từ gà bị bệnh chiếm tỷ lệ 63,67 % (14/22) và 8 mẫu dương tính từ gà khỏe mạnh chiếm tỷ lệ 50,00 % (4/8).
Kết quả này cho thấy tỷ lệ nhiễm C. perfringens ở mẫu phân gà bị bệnh NE (63,67%) cao hơn ở mẫu phân gà khỏe mạnh (50,00%). Khi so sánh với kết quả phân lập của các tác giả nghiên cứu ở ngoài nuớc chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt. Tỷ lệ phân lập C. perfringens ở phân gà khỏe mạnh tại Thổ Nhĩ Kỳ là 5% [27], tại Cộng hòa Séc là 18,39% [33]. Sở dĩ có sự khác nhau về tỷ lệ phân lập C. perfringens ở gà là do người chăn nuôi đã bổ sung các chất kháng sinh vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng hoặc phòng trị các bệnh nhiễm khuẩn. Kháng sinh trong thức ăn, nước uống với các liều lượng khác nhau đã ức chế sự phát triển
của hệ vi sinh vật đường ruột, trong đó có vi khuẩn C. perfringens, vì thế cho nên tỷ lệ phân lập vi khuẩn này sẽ rất thấp. Ở các nước cấm sử dụng kháng sinh bổ sung trong thức ăn chăn nuôi thì tỷ lệ phân lập C. perfringens ở gà khỏe mạnh cũng tăng cao và đồng thời các bệnh về đường tiêu hóa ở gà cũng tăng lên. Vi khuẩn C. perfringens là vi khuẩn thường có mặt trong đường tiêu hóa của gia cầm, bình thường chúng không gây bệnh cho vật chủ, tuy nhiên, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ tăng sinh về số lượng, sản sinh ngoại độc tố và gây bệnh viêm ruột hoại tử cho gà với các triệu chứng và bệnh tích hoại tử xuất huyết ở ruột non.
3.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens phân lập đƣợc perfringens phân lập đƣợc
Để giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ phân của gà khỏe và gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở thành phố Nha Trang, chúng tôi tiến hành kiểm tra hình thái và tính bắt màu của vi khuẩn, tính chất mọc trên các môi trường Fluid Thioglycolate, TSC agar, Thạch máu, Egg yolk, Litmus milk, khả năng lên men đường Glucose, Lactose, Mantose, Saccharose...theo phương pháp của Quinn.[32]
3.1.2.1. Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn C. perfringens
Các chủng vi khuẩn được làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra hình thái và tính bắt màu trên kính hiển vi. Kết quả cho thấy tất cả cá chủng vi khuẩn C. perfringens đều là dạng trực khuẩn bắt màu thuộc nhuộm Gram dương, có thể đứng riêng rẽ hoặc đứng song song, một số kết thành dạng chuỗi ngắn.
3.1.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di đông của vi khuẩn C. perfringens
bằng phƣơng pháp soi tƣơi
Lấy một giọt canh khuẩn nhỏ lên 1 lamen sạch, cố định lamen bằng dầu