BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076" pdf

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076 Đỗ Thị Huyền, 2Nguyễn Thành Trung, 2Nguyễn Thị Thu Hằng, 1Phạm Thuý Hồng, 3Trương Văn Dung, Trương Nam Hải, 2Lê Đình Lương 1: Viện Cơng nghệ sinh học, 2: Đại học Quốc gia Hà Nội 3: Viện Thú Y Trung Ương MỞ ĐẦU Salmonella nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn cho người toàn cầu Theo số liệu thống kê Pháp năm 1995, số 7449 bệnh nhân bị nhiễm độc thức ăn có tới 3131 bệnh nhân Salmonella gây Bệnh Salmonella tập trung chủ yếu nước châu Âu, châu Mỹ điển hình Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan [1, 2] S enteritidis xem nguyên nhân gây bệnh quan trọng số chủng Salmonella Ở nước ta, bệnh Salmonella chiếm tỷ lệ chủng gây bệnh chủ yếu S typhimurium, S cholera sau đến S enteritidis Thông thường bệnh không gây triệu chứng nặng người lớn lại gây triệu chứng nghiêm trọng người già, người yếu trẻ em Người bị mắc bệnh ăn phải thức ăn có nguồn gốc từ thịt động vật, gia cầm trứng nhiễm Salmonella Hiện nước có chương trình an tồn thực phẩm khuyến cáo để phịng bệnh Salmonella chưa loại trừ mầm bệnh cách triệt để [1] Một phương pháp để hạn chế lây lan mầm bệnh phải có phương pháp phát nhanh, tiện lợi, xác để phát nguồn gia súc, gia cầm nhiễm bệnh Hiện có nhiều phương pháp phát Salmonella [1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9] Phương pháp sử dụng rộng rãi phương pháp ELISA dùng kháng nguyên để phát tồn kháng thể kháng Salmonella huyết [1, 4, 6, 7, 8] Tuy nhiên, kháng nguyên sử dụng phương pháp kháng ngun tồn vẹn tinh chế phương pháp hố học lý học nên tính đặc hiệu chưa cao Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi mong muốn tạo epitope kháng nguyên H:g,m có khả phát đặc hiệu S enteritidis công nghệ AND tái tổ hợp NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu a, Chủng vi sinh vật - Chủng S enteritidis ATCC13076 chủng vi khuẩn mang nguồn gen gm1 Viện Thú Y Trung Ương cung cấp - Chủng E coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1 lac U169 (80 lacZM15)] sử dụng làm thể nhận thí nghiệm biến nạp, nhân chọn dòng plasmit - Chủng E coli BL21 [F-omp hsd SB (rBmB) gel dcm (DE3) plysS (Caml)] sử dụng làm chủng nhận thí nghiệm biến nạp với vectơ biểu pET22b(+) mang gen gm1 b, Plasmit - Plasmit pCR2.1 mua hãng Invitrogen sử dụng làm vectơ tách dòng gen - Plasmit pET22b(+) sử dụng làm vectơ biểu tế bào E coli BL21 Phương pháp a, Phương pháp biến nạp Tế bào E coli biến nạp theo phương pháp tạo tế bào khả biến muối CaCl2 Seidman C E cộng [10] b, Các phản ứng cắt, nối ghép đoạn ADN, điện di gel agaroza tiến hành theo Sambrook cộng [11] c, Phản ứng PCR Phản ứng làm biến tính ADN khn diễn 940C phút sau với 30 chu kỳ, chu kỳ gồm ba bước: bước 1: biến tính sợi ADN khn 940C phút; bước 2: mồi kết cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng sợi khuôn 490C phút; bước 3: tổng hợp, kéo dài chuỗi 720C 40 giây Phản ứng kết thúc 720C phút ủ mẫu 40C Hai đoạn mồi dùng để nhân gen hãng Amersham Pharmacia Biotech tổng hợp có trình tự sau: gm1f: TCCATggATgAAgCCAAAgCgATAgCTggT NcoI gm1r: ACTCgAggTTTTTggTTTTATCATCAAA XhoI Hình 1: Phân tích ADN hệ gen S enteritidis ATCC13076 gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Hệ gen S enteritidis ATCC13076 Đường chạy 2: Thang ADN chuẩn d, Tách ADN hệ gen S enteritidis Một khuẩn lạc S enteritidis nuôi cấy lắc 10 ml môi trường LB 370C qua đêm Sau tế bào thu lại ly tâm hoà tan vào 567 l TE (10 mM Tris, mM EDTA, pH8) Mẫu tế bào bổ sung thêm 30 l SDS 10%, l proteaza K 1% ủ 370C sau bổ sung thêm 180 l NaCl M ủ 650C 10 phút Protein tế bào loại bỏ Chloroform ADN hệ gen nằm pha tủa lại cồn hoà vào 40 l TE có bổ sung 0,4 l ARNaza1% ADN hệ gen bảo quản 40C KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhân gen gm1 kỹ thuật PCR S enteritidis có kháng nguyên quan trọng sử dụng để phát có mặt chúng huyết kháng nguyên O, H kháng nguyên lông Trong số kháng nguyên này, kháng nguyên H kháng nguyên lông đặc hiệu cho S enteritidis Kháng nguyên H S enteritidis có tính đặc hiệu H:g,m mã hố gen fliC Kháng nguyên H biểu thường xuyên giúp cho Salmonella vận động kết dính vào thành ruột tạo điều kiện cho định khu, nhân bệnh gây bệnh Năm 1995, Van Asten A J A M cộng xác định vùng gen mã hoá cho epitope kháng nguyên H đặc hiệu cho S enteritidis Epitope chuỗi polypeptid ngắn có trình tự axit amin từ 246-382 [2] Trong thí nghiệm mình, chúng tơi đặt tên cho gen mã hố epitope gm1 Để có nguồn gen gm1, tách chiết ADN hệ gen S enteritidis theo quy trình mơ tả phần nguyên liệu phương pháp ADN hệ gen sau tách chiết kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Kết điện di sản phẩm ADN trình bày hình cho thấy ADN hệ gen băng sáng, kích thước lớn, khơng bị đứt gãy Sau ADN hệ gen pha lỗng 200 lần để làm sợi khuôn nhân gen gm1 Cặp mồi dùng để nhân gen thiết kế dựa trình tự gen fliC mã số M 84980 ngân hàng gen quốc tế Với mục đích tạo epitope kháng ngun tái tổ hợp hồn chỉnh, khơng bị lẫn số axit amin nằm vùng đa nối vectơ pET-22b(+), thiết kế mồi đầu 5’ 3’ có chứa thêm trình tự enzyme hạn chế NcoI XhoI tương ứng Protein tái tổ hợp tiết khoang chu chất tế bào nhờ tín hiệu dẫn pelB tinh dễ dàng nhờ axit amin Histidin tận đầu C thiết kế sẵn vectơ pET-22b(+).Gen gm1 nhân lên PCR theo chu trình mô tả phần nguyên liệu phương pháp Sản phẩm phản ứng phát điện di gel agaroza 0,8% Kích thước gen gm1 theo tính tốn dài khoảng 0,3 kb (Hình 2) Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy2: Thang ADN chuẩn Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt dòng pCRgm1 EcoRI gel agaroza 0,8% Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt EcoRI Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu pET22b(+) mang gen gm1 Thiết kế vectơ biểu pETgm1 Với mục đích thu lượng lớn epitope kháng nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát nhanh S enteritidis, chọn chủng biểu E coli BL21 E coli Salmonella có đặc điểm di truyền gần giống nên E coli tổng hợp protein có cấu trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy Salmonella Đoạn gen gm1 sau nhân lên PCR sử dụng Taq polymerase nối trực tiếp với vectơ tách dòng pCR2.1 Sản phẩm lai biến nạp vào E coli DH5 Plasmit thể biến nạp E coli DH5 tách cắt kiểm tra enzyme hạn chế EcoRI Theo tính tốn, vectơ pCR2.1 mang gen gm1 cắt EcoRI cho đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3) Các plasmit đặt tên pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào vectơ biểu pET22b(+), tiến hành cắt vectơ pCRgm1 NcoI XhoI Đoạn gen có kích thước 0,3 kb tinh lại từ gel agarose 0,8% nối vào vectơ pET-22b(+) ADN ligaza Sản phẩm nối biến nạp vào tế bào E coli BL21 Sau kiểm tra dòng plasmit thể biến nạp E coli BL21, chọn dòng pET22b(+) mang đoạn gen gm1 mong muốn Plasmit đặt tên pETgm1 Toàn sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 trình bày hình Biểu gen gm1 Các dòng E coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1 nuôi cấy qua đêm 37 0C 2ml môi trường LB có chứa 100g/ml ampicilin Sau tế bào hồ lỗng vào mơi trường LB có ampicillin đến OD600  0,1 nuôi cấy lắc điều kiện khoảng thời gian để OD600 đạt 0,5 đến 0,8 Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 1mM chuyển sang cấy lắc 280C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein tái tổ hợp Đây nhiệt độ thuận lợi để E coli hình thành cấu trúc protein Sau nuôi cấy cảm ứng, tế bào thu lại phá đệm xử lý mẫu Protein tổng số kiểm tra gel acrylamit 13,3% Kết cho thấy tất thể biến nạp E coli BL21 tổng hợp băng protein lạ có kích thước khoảng 10 kDa tương đương với kích thước gm1 (Hình 5) Hình 5: Phân tích protein thể biến nạp E coli BL21 gel acrylamit 13,3% Đường chạy 1-5: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy điều kiện cảm ứng mM IPTG Đường chạy 6: Protein chuẩn Đường chạy 7: E coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy điều kiện cảm ứng mM IPTG Đường chạy 8: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy điều kiện khơng cảm ứng Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy2: Thang ADN chuẩn Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt dịng pCRgm1 EcoRI gel agaroza 0,8% Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt EcoRI Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu pET22b(+) mang gen gm1 Thiết kế vectơ biểu pETgm1 Với mục đích thu lượng lớn epitope kháng nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát nhanh S enteritidis, chọn chủng biểu E coli BL21 E coli Salmonella có đặc điểm di truyền gần giống nên E coli tổng hợp protein có cấu trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy Salmonella Đoạn gen gm1 sau nhân lên PCR sử dụng Taq polymerase nối trực tiếp với vectơ tách dòng pCR2.1 Sản phẩm lai biến nạp vào E coli DH5 Plasmit thể biến nạp E coli DH5 tách cắt kiểm tra enzyme hạn chế EcoRI Theo tính tốn, vectơ pCR2.1 mang gen gm1 cắt EcoRI cho đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3) Các plasmit đặt tên pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào vectơ biểu pET22b(+), tiến hành cắt vectơ pCRgm1 NcoI XhoI Đoạn gen có kích thước 0,3 kb tinh lại từ gel agarose 0,8% nối vào vectơ pET-22b(+) ADN ligaza Sản phẩm nối biến nạp vào tế bào E coli BL21 Sau kiểm tra dòng plasmit thể biến nạp E coli BL21, chúng tơi chọn dịng pET22b(+) mang đoạn gen gm1 mong muốn Plasmit đặt tên pETgm1 Toàn sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 trình bày hình Biểu gen gm1 Các dòng E coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1 nuôi cấy qua đêm 37 0C 2ml mơi trường LB có chứa 100g/ml ampicilin Sau tế bào hồ lỗng vào mơi trường LB có ampicillin đến OD600  0,1 ni cấy lắc điều kiện khoảng thời gian để OD600 đạt 0,5 đến 0,8 Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 1mM chuyển sang cấy lắc 280C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein tái tổ hợp Đây nhiệt độ thuận lợi để E coli hình thành cấu trúc protein Sau nuôi cấy cảm ứng, tế bào thu lại phá đệm xử lý mẫu Protein tổng số kiểm tra gel acrylamit 13,3% Kết cho thấy tất thể biến nạp E coli BL21 tổng hợp băng protein lạ có kích thước khoảng 10 kDa tương đương với kích thước gm1 (Hình 5) Hình 5: Phân tích protein thể biến nạp E coli BL21 gel acrylamit 13,3% Đường chạy 1-5: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy điều kiện cảm ứng mM IPTG Đường chạy 6: Protein chuẩn Đường chạy 7: E coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy điều kiện cảm ứng mM IPTG Đường chạy 8: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy điều kiện không cảm ứng ... kháng nguyên O, H kháng nguyên lông Trong số kháng nguyên này, kháng nguyên H kháng nguyên lông đặc hiệu cho S enteritidis Kháng nguyên H S enteritidis có tính đặc hiệu H :g,m mã hố gen fliC Kháng. .. kế vectơ biểu pET22b(+) mang gen gm1 Thiết kế vectơ biểu pETgm1 Với mục đích thu lượng lớn epitope kháng nguyên H :g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát nhanh S enteritidis, chọn chủng biểu E coli... epitope kháng nguyên H đặc hiệu cho S enteritidis Epitope chuỗi polypeptid ngắn có trình tự axit amin từ 246-382 [2] Trong thí nghiệm mình, chúng tơi đặt tên cho gen mã hố epitope gm1 Để có nguồn gen