BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM" ppsx

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt qúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom ARNr ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng n

PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ

NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM

TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM

Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Lê

Thanh Hòa, Nguyễn Ngọc Dũng

Viện Công nghệ Sinh học

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000) Một trong những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống

vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992, Berg và cộng sự, 2000) Các chủng pseudomonad sinh

huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc

theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân

gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in)

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt qúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom (ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn ( Woese, 1987) Theo Ludwig và Schleifer ( 2000)

đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi khuẩn

đã được xác định trình tự nucleotid

Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽ được trình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S-ARN ribosom (16S-ARNr)

I NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vi sinh vật:

Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ cây lúa ở Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đối

kháng F oxysporium cao trong điều kiện in vitro (Nguyễn

Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E coli DH5 đã được sử dụng

2 Các phương pháp phân loại:

a Phương pháp phân loại theo kiểu hình:

Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API 20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng Theo nhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loại các nhóm vi khuẩn hình que, Gram âm, không thuộc Họ

Enterobactieraceae Ngoài các đặc tính theo API 20NE,

các đặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclin

đã được xác định Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc được tiến hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môi

trường LB rắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu được ủ ở 30oC và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ

ủ Tính mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến hành theo phương pháp Krieg và Doebereiner (1984) Theo

đó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB rắn, sau đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclin lên trên Chủng E coli DH5 được sử dụng làm đối chứng Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh đĩa giấy thấm sau 24 giờ ủ

b Phương pháp phân loại theo kiểu gen:

-Thu ADN tổng số:

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson

và cộng sự (1985)

-Thu nhận gen 16S-ARNr:

Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen (PCR) với cặp mồi có trình tự như sau Mồi thuận

chiều Prf: 5,-GAGTTTGATCATGGCTAA-3,., tương ứng với các vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E coli;

mồi nghịch chiều Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3,, tương ứng với các vị trí 1540-1524 từ E coli, do Genset-Oligos Singapore, cung cấp Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen có thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion, 2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0

l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0

l dịch ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu, ADN được biến tính ở 95o C trong 1 phút 30 giây, tiếp tục biến tính ở 940 C trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt

độ 520 C và phản ứng kéo dài chuỗi ở 720 C trong 1 phút 20 giây Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơ bản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biến tính một lần ngay ở nhiệt độ 940 C trong 1 phút, tiếp sau pha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72 0 C trong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 40 C Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose 0,8% Sản phẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1 theo chỉ dẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen Vectơ pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào

dòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK và

RUSSELL, 2001) ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit

(QIAGEN Inc.) Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái

tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI

3 Giải trình trình tự chuỗi nucleotit và xử lý số liệu:

Chuỗi ADN chứa gen 16S- ARNr và nột phần plasmid được giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) Mồi xuôi M13F

(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’) và mồi ngược M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) dùng trong giải trình tự

là các chuỗi cố định của vectơ và nằm gần hai đầu biên của ADN tái tổ hợp cần giải trình Trong quá trình giải trình, một mồi khác ký hiệu là Seq16SF

(5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’ của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu khoảng 300-320

nucleotit đã được thiết kế bởi máy không có khả năng đọc

một lần hết chiều dài chuỗi Giải trình được thực hiện nhiều lần với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được kết quả chính xác

Chuỗi được xứ lý nucleotit bằng chương trình SeqEd1.0.3; sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5 (Karl Nicholas, 1997) Giám định các chủng được thực

hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua chương trình BLASTn có tại

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

4 Chọn chuỗi so sánh:

Các chuỗi nucleotit 16S ARNr của một số chủng có trình tự

tương ứng từ Pseudomonas spp tại Ngân hàng Gen được

thu nhận bằng cách truy cập Ngân hàng Gen thông qua số thư mục ngân hàng và được sử dụng để so sánh đối chiếu với trình tự nucleotid từ chủng Ps7-1 (Bảng 1)

Bảng 1 Các chủng Pseudomonas spp được dùng để so sánh

5 Địa điểm tiến hành nghiên cứu:

Công việc tách chiết ADN tổng số, PCR, dòng hoá sản

phẩm và một phần phân tích số liệu được thực hiện tại

phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng máy, Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Công việc giải trình trình tự và xử lý số liệu giám định

phân tử được tiến hành tại Viện nghiên cứu Y học

Queensland (Australia)

II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Phân loại theo kiểu hình:

Như đã nêu, hệ thống phân loại vi khuẩn được chuẩn hóa API 20NE là tập hợp của 21 phản ứng sinh lý sinh hoá dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, không có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ

Enterobacteriaceae Kết quả phân loại chủng Ps7-1 theo hệ

thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ bản, chủng này cho kết quả âm tính với khử nitrat, tạo

indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp -galactosidase; và cho 3 kết quả dương tính là lên men

glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1 không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat,

citrat và phenol-axetat Với những kết quả như vậy, chủng Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534 Đối chiếu Bảng chỉ số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại Tuy vậy, căn cứ vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn, chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc

giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ số ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch

violaceum Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm

cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt

buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml Kết quả xác định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy,

chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng

tetraxyclin ở nồng độ đã nêu Theo Norberto và Palleroni (1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi

Pseudomonas Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được

phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính chọn lọc cao đối với vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang (Gould và cộng sự, 1985) Chính vì vậy, đến đây có thể tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó có thể là một chủng

Chromobacterium

2 Phân loại theo kiểu gen:

Gen 16S-ARNr từ chủng Ps7-1 đã được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen PCR; trình tự của nó cũng đã được xác định và đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với

số thư mục AF521651 Một phần của kết quả giám định

chủng Ps7-1 bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen

thông qua chương trình BLASTn cho thấy chủng Ps7-1 có

đọ tương đồng cao nhất với 332 chủng thuộc Pseudomonas

và một phần kết quả này được trình bày trong bảng 2

Bảng 2 Mức độ tương đồng trình tự nucleotid gen

16S-ARNr của chủng Ps7-1 với một số chủng Pseudomonas

spp

Căn cứ vào các kết quả giám định nhận được từ ngân hàng gen có thể khẳng định rằng chủng Ps7-1 là một chủng

thuộc Chi Pseudomonas, bởi sự so sánh chuỗi trình tự

nucleotid của gen 16S-rARN từ chủng này với trình tự từ các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen cho giá trị tin

cậy cao nhất thuộc về các chủng của Chi Pseudomonas Để

làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của chủng Ps7-1, mối quan hệ di truyền của chủng này được xác định dựa trên sự

thiết lập cây phả hệ với một số chủng Pseudomonas đặc

trưng bằng hệ chương trình máy tính MEGA 2.1 ( Hình 1 )

Hình 1: Cây phả hệ ( không có rễ ) của các chủng

Pseudomonas được thiết lập theo chương trình MEGA 2.1

Pficu: P ficuserectae JCM 2400T, Psyr+gly: P syringae

pv glycinea MAFF 302260,

Pmeli: P meliae MAFF 301463T, Psyr+pha: P syringae

pv phaseolicola MAFF 302282, Pchlor: P chlororaphis DSM 50083T, Pcost: P costantinii

CFBP 5705,

Pman: P mandelii CIP 105273, PfluoATCC: P fluorescens

ATCC 17386, Pfluor: P fluorescens CHAO

Cây phả hệ cho thấy, chủng Ps7-1 cùng với 2 chủng P fluorescent lập nên một nhóm riêng, trong khi đó giữa các chủng còn lại thuộc các loài Pseudomonas khác đều cho

những khoảng cách nhất định Điều này nói lên rằng chủng

Ps7-1 có họ hàng gẫn gũi nhất vỡi loài P fluorescent

Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống API 20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết quả phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc

loài P aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE,

nhưng theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr thì

chủng này thuộc loài P putida (99%) (Lottmann và cộng sự

, 2000) Như vậy, ở đây sự khác nhau chỉ thể hiện ở mức độ loài, không xẩy ra ở định loại chi Nhưng, như đã nêu,

trong trường hợp phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho kết quả cách biệt khá lớn, nếu không nói hoàn toàn khác, so với phương pháp phân loại tự nhiên dựa vào trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr, mặc dù theo nhà cung cấp dịch vụ API 20NE, các chủng thuộc Chi

Pseudomonas là một trong nhũng đối tượng phù hợp của hệ

thống xác định được chuẩn hoá này

Tóm lại, cùng với những đặc tính phân lập có chọn lọc, hiếu khí bắt buộc và kháng tetraxyclin, kết quả phân tích trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr cho thấy chủng

Ps7-1 là một chủng Pseudomonas, chứ không thuộc chi Chromobacterium và có quan hệ họ hàng gần nhất với loài

P fluorescens, cùng các chủng P fluorescens ATCC 17386

và chủng P fluorescens CHAO lập nên một nhóm riêng

Công trình này được tài trợ bởi Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và hỗ trợ bởi Hội đồng Khoa học Tự nhiên, Bộ Khoa học Công nghệ & Môi

trường, tài khóa 2002

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Anzai,Y., Kim,H., Park,J.Y., Wakabayashi,H and

Oyaizu,H (2000) Int J Syst Evol Microbiol 50,

1563-1589

2 Berg, G., Kurze, S., Buchner, A., Wellington, E.M and Smalla, K., 2000 Successful

strategy for the selection of new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic

to Verticillum wilt Can J Microbil., 46, p 1128-1137

3 Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D.,

Pienta,P.A and Gillevet, P.M

(Chưa công bố)

4 Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R and R.M Zablotowicz, 1985 New selective media for Enummeration and recovery of fluorescent Pseudomonads from

Various Habitats Appl Env Microbiol., 49, p 28-32

5 Krieg, N.R and Doebereiner,J., 1984 Genus

Azospirillum In: Krieg, N.R.,

& Holt, J.G (eds): Bergey, s Manual of Systematic

Bacteriology The Williams

and Wilkin Co., Baltimore

6 Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering, K., Wackernagel, W., Smalla, K.,

Berg, G., 2000 Establishment of introduced

antagonistic bacteria in the

rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on the bacterial community

EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49

7 Ludwig, W and Schleifer, K.H., 2000 Phylogeny of Bacteria beyond the 16S-rRNA

Standerd Vermicon http:w.w.w

ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm

8 Masterson, R.V., Prakash, R.K and Arthely, A.G., 1985 Conservation of symbiotic

nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium

japonicum and Bradyrhizobium

japonicum J Bacteriol., 163, 2-25

9 Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C., Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De

Wachter,R and Timmis,K.N.(1996) Syst Appl Microbiol

19, 478-492

10 Munsch, P., Alatossava,T., Marttinen,N., Meyer,J.-M., Christen,R and Gardan,L (2002) Int J Syst Evol

Microbiol đang in

11 Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh, Vũ Thanh,

2000 Vi khuẩn cố định nitơ vi hiếu

khí khu trú trong rễ lúa ở một số địa điểm thuộc đồng bằng sông Hồng Tuyển tập

Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong sinh học Hội Nghị Sinh học quốc gia,

Hà Nội, Nhà XB Đại học quốc gia Hà Nội

12 Norberto, J and Palleroni, 1984 Genus Pseudomonas In: Krieg, N.R & Holt, J.G (eds):

Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology The

Williams and Wilkin, Co.,

Baltimore

13 O.Sullivan, D.J., O.Gara, F., 1992 Traits of fluorescent Pseudomonas spp involved in

suppression of plant root pathogens Microbiol Rev.,

56, 662-672

14 Ramette, A., Moenne-Loccoz,Y and Defa go, G

(2001) Mol Plant Microbe Interact 14 (5), 639-652

15 Sawada, H (1997) Nộp trực tiếp vào Ngân hàng gen

16 Verhille,S., Baida,N., Dabboussi,F., Izard,D and

Leclerc,H (1999) Syst Appl Microbiol 22, 45-58

17 Woese, C.R., 1987 Bacterial evolution Microbiol

Rev., 51, 221-271

SUMMARY

TAXONOMICAL POSITION OF THE ISOLATE

PS7-1 CAPABLE OF ANTAGONISM AGAINST

FUSARIUM OXYSPORUM BASED ON THE

ANALYSIS OF THE 16S-rRNA GENE NUCLEOTIDE SEQUENCE

NGUYEN THI TUYET NHUNG et al

To establishing the taxonomical position of the bacterial strain Ps7-1 which was isolated from the rice rhizosphere soil in Kim Chung, Dong Anh, Ha Noi on the selective