Báo cáo khoa học : Phân lập các hợp chất có khả năng gây độc tố tế bào ung thư tuyến tuỵ panc - i và psn- 1 từ keo ong dú (trigona minor) ở Bến Tre, Việt Nam

ốt loài Trigona minor , trong đó có ba hợp chất mớ trigonol A 5, trigonone A 7 và trigonol B 9 , cùng với 7 hợp chấ 1, mangiferolicacid 2, 23-hydroxymangiferonicacid3, 23-hydroxymangifer

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆTHÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

ThS NGUYỄN XUÂN HẢI

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 09/2014

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

 * 

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 27/09/2014)

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ

Phân lập 10 hợp chất tinh khiết từ keo

ong Trigona minor

Phân lập 10 hợp chất tinh khiế

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

TỔNG QUAN 1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI ONG KHÔNG NGÕI ĐỐT 1

1.1 Giới thiệu về loài ong mật 1

1.2 Các chi chính của loài ong không ngòi đốt 1

1.2.1 Chi Trigona 1

1.2.2 Chi Melipona 2

1.3 Sản phẩm của loài ong không ngòi đốt 2

1.4 Thành phần hóa học của keo ong một số loài ong không ngòi đốt 3

1.4.1 Thành phần hóa học của keo ong loài Trigona spinipes ở Brazil 3

1.4.2 Thành phần hóa học của keo ong loài Tetragonula carbonaria ở Öc 4

1.4.3 Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona subnitida ở Brazil 6

1.4.4 Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona interrupta ở Brazil 6

1.4.5 Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona beecheii ở Mexico 7

1.5 Hoạt tính sinh học của keo ong của một số loài ong không ngòi đốt 7

1.5.1 Hoạt tính kháng ung thư của keo ong loài Trigona laeviceps ở Thái Lan 7

1.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của loài Trigona sp ở Ấn Độ 8

1.5.3 Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của một số loài thuộc chi Melipona 8

1.5.4 Hoạt tính kháng tăng trưởng các dòng tế bào ung thư của keo ong không ngòi đốt loài Melipona scutellaris ở Brazil 9

1.5.5 Một số hoạt tính sinh học của keo ong loài Melipona orbignyi ở Brazil 9

2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ TUYẾN TỤY 9

2.1 Giới thiệu về ung thư tuyến tụy 9

2.1.1 Tụy và ung thư tuyến tụy 9

2.1.2 Phân loại ung thư tuyến tụy 10

2.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư tuyến tụy 11

2.1.3.1 Hóa trị 11

2.1.3.2 Xạ trị 11

2.1.3.3 Phẫu thuật 11

2.1.3.4 Phương pháp hỗ trợ điều trị 12

2.1.4 Một số dòng tế bào ung thư tuyến tụy 12

2.2 Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả năng kháng ung thư tuyến tụy trên dòng tế bào PANC-1 -1 13

2.2.1 13

2.2.2 14

2.2.3 15

2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư tuyến tụy 17

2.3.1 Nguyên tắc 17

2.3.2 Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư 18

2.3.2.1 Khả năng gây độc tế bào ung thư 18

2.3.2.2 Giá trị PC50 và cách xác định giá trị PC50 18

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI THỰC NGHIỆM 3 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 19

3.1 Hóa chất 19

3.2 Dụng cụ 19

3.3 Thiết bị 20

4 QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 20

4.1 Chuẩn bị hóa chất 20

4.2 Nuôi cấy tế bào 21

4.3 Quy trình thử hoạt tính 21

5 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC CÁC HOẠT CHẤT TỪ CAO HEXANE CỦA KEO ONG LOÀI TRIGONA MINOR 21

5.1 Nguyên liệu 21

5.2 Ly trích và điều chế cao thô 21

5.3 Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn cao hexane 22

5.3.1 Phân đoạn B 24

5.3.2 Phân đoạn D 24

5.3.3 Phân đoạn H 24

5.3.4 Phân đoạn I 28

5.3.5 Phân đoạn J 30

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 6 BIỆN LUẬN CẤU TRÖC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 33

6.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập được 33

6.2 Hợp chất 1 34

6.3 Hợp chất 2 36

6.4 Hợp chất 3 39

6.5 Hợp chất 4 41

6.6 Hợp chất 5 43

6.7 Hợp chất 6 47

6.8 Hợp chất 7 49

6.9 Hợp chất 8 53

6.10 Hợp chất 9 55

6.11 Hợp chất 10 59

7 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 61

7.1 Kết quả thử hoạt tính của các mẫu cao 61

7.2 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 8 KẾT LUẬN 63

9 KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

70

ốt loài Trigona minor

, trong đó có ba hợp chất mớ trigonol

A (5), trigonone A (7) và trigonol B (9 , cùng với 7 hợp chấ

(1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23-hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27-

hydroxymangiferolicacid (8), và 27-hydroxyisomangiferolicacid (10

được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC-1

ABSTRACT

From the ethanolic extract of the propolis of Trigona minor, three new

cycloartane-type triterpenes named trigonol A (5),trigonone A (7), and trigonol B (9),

together with seven known cycloartane-type triterpenes, including mangiferonic acid

(1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3),

23-hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6),

27-hydroxymangiferolicacid (8), and 27-hydroxyisomangiferolicacid (10) have been

isolated Their chemical structures were determined by extensive NMR spectroscopic analysis All compounds were tested for preferential cytotoxicity against PANC-1 human pancreatic cell line in the nutrient starvation condition (NDM) Among them,

compounds 3, 5, 7-10 showed potent preferentially cytotoxic candidates with PC50

values of 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 and 31.0 µM, respectively However, compounds

1, 2, 4 and 6displayed weak cytotoxicityagainst both PANC-1 and PSN-1 cells at a

concentration of 100 µM

Keywords: Trigona minor, propolis, cycloartane-type triterpenes, PANC-1,

PSN-1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DMSO-d 6 : deuterated dimetylsufoside

NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

(phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

1H-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 1H

13

C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 13C

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

COSY : COrrelation SpectroscopY (phổ tương quan giữa 1H-1H)

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy

(phổ tương quan giữa 1H-13C qua 1 nối)

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy

(phổ tương quan giữa 1H-13C qua 2, 3 nối)

NOESY : Nuclear Overhause Effect Spectroscopy

(phổ tương quan giữa 1H-1H trong bán kính 5Å)

HR-MS : High Resolution Mass Spectroscopy

(phổ khối lượ )

δH, δC : độ dịch chuyển hóa học của 1

H, 13C

s : singlet (mũi đơn)

d : doublet (mũi đôi)

t : triplet (mũi ba)

m : multiplet (mũi đa)

br : broad (mũi bầu)

J : hằng số ghép

Hz, MHz : hertz, megahertz

ppm : part per million

EC50 : Effective Concentration (nồng độ ức chế 50 % vi khuẩn)

IC50 : Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50 % enzyme)

PC50 : Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 50 % tế bào ung thư)

PC100 : Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 100 % tế bào ung thư) PTLC : Preparative Thin Layer Chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế) CCNP : Column Chromatography Normal Phase (sắc ký cột pha thường) DNA : DeoxyriboNucleic Acid

PBS : Phophates Buffer Saline (đệm phosphate)

HEPES : 4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazinEthanSulfonic acid

MEM : MinimumEssentialMedium (môi trường cần thiết tối thiểu)

MIC : Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ chất ứcchế tối thiểu) MBC : Minimum Bactericidal Concentration (nồng độ diệt khuẩntốithiểu) MFC : Minimum Fungicidal Concentration (nồng độ diệt nấm tối thiểu) TGI : Total Growth Inhibition(tổng nồng độ ức chế tăng trưởng)

TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI ONG KHÔNG NGÒI ĐỐT

Ong mật thuộc giới động vật (Animalia), ngành chân đốt (Arthropoda), phân ngành có khí quản (Tracheata), lớp côn trùng (Insecta), phân lớp có cánh (Pterygota),

bộ cánh màng (Hymenoptera), liên họ ong (Apoidea), họ ong mật (Apidae)

Ong mật là một nhóm ong gồm hơn 1000 loài Đây là nhóm ong được nghiên cứu nhiều nhất trong tất cả các loài ong Phân họ ong mật có bốn tông đáng chú ý là: tông Apini (ong mật), tông Meliponini (ong không ngòi đốt), tông Bombini (ong nghệ)

và tông Euglossini (ong phong lan).1

Tông Meliponini có khoảng 23 chi và 18 phân chi, bao gồm 374 loài (2000).Trong đó có hai chi lớn là TrigonavàMelipona, ngoài ra còn có các chi và phân

chi ít phổ biến hơn như: Meliponula,Oxytrigona, Dectylurina,Lestrimelitta,

Trichotrigona, Hypotrigona, Liotrigona, Lisotrigona, Trigonisca, Austroplebeia, Cephalotrigona, Cleptotrigona, Frieseomelitta, Nannotrigona, Nogueirapis, Paratrigona, Tetragonula, Plebeina, Partamona, Tetragonisca, Scaptotrigona, Paratrigonoides, Plebeia, Meliwillea, Pariotrigona,…Trong đó, ở châu Á có hai chi

phổ biến là Lisotrigona và Trigonabao gồm khoảng 43 loài (2000).2,3

Chi Trigona là chi lớn nhất và phân bố rộng rãi của tông Meliponini, gồm 10 phân chi với khoảng 120 loài (2000) Trong đó, ba phân chi phổ biếnlàHeterotrigona,

Lepidotrigona vàHomotrigona phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Loài

ong không ngòi đốt thuộc chi Trigonađược tìm thấy ở Ấn Độ, Indonesia, Úc và phần lớn ở vùng nhiệt đới châu Mỹ

Phân chi Heterotrigona gồm khoảng 36 loài (2000), là phân chi có số loài lớn nhất và phổ biến nhất của chi Trigona, phân bố trong vùng từ Indonesia đến Thái Bình

Dương, trong đó có 6 loài ở Úc Theo phân loại trước đây của Michener vào năm

2000, phân chi này bao gồm cả phân chi Tetragonula, tuy nhiêntheo hệ thống phân loại sau này, Heterotrigona và Tetragonula được coi là hai phân chi riêng biệt của chi

Trigona Ở miền Trung Việt Nam, 4 trong số 13 loài của phân chi Tetragonula được

tìm thấy là T laeviceps, T gressitti, T pagdeni và T fuscobalteata(1978).

Phân chi Lepidotrigona phân bố rộng rãi ở Indonesia và Úc, Ấn Độ, Thái Lan

và Đài Loan, trong đó loàiTrigona (L.) ventralis là loài phổ biến nhất, gồm 4 phân loài: T (L.) v ventralis, T (L.) v hoozana, T (L.) v flavibasis và T (L.) v doipaensis Loài T ventralis cũng được tìm thấy ở vùng núi của miền Trung Việt Nam (1975).

Phân chi Homotrigona chỉ có một loài là H.fimbriata,được tìm thấy ở Sumatra,

Borneo, Malaysia và Việt Nam (2000)

Có 4 loài mới được tìm thấy thuộc phân chi Lisotrigona, trong đó có 3 loài được tìm thấy ở Việt Nam là L cacciae, L scintillans, L carpenteri và một loài được tìm thấy ở Thái Lan là L furva (1975).4

Chi Melipona có khoảng 40 loài, trong đó loài Melipona favosa phân bố chủ

yếu ở một số quốc gia ở Nam Mỹ như: Guyana, Tobago, Venezuela, Colombia và Panama (1982)

Các loài thuộc chi Meliponacó kích thước lớn hơn hẳn so với các chi khác, hình

dáng gần giống với chi Apis của tông Apini và có khả năng cho mật năng suất cao nên

được thuần hóa để nuôi như: M beecheii, M costaricensis, M yucatanica, M

panamica, M flavolineata, M fasciculate, M fasciata, M subnitida,…4,5

Mật của loài ong thuộc chi Melipona có tác dụng trị bệnh nên ở Brazil, loài ong

thuộc chi này được nuôi để lấy mật Loài ong thuộc chi nàyở Mexico cũng được nuôi

để lấy phấn hoa và thụ phấn cho hoa nhằm tăng năng suất mùa vụ.5

Như các loài ong mật khác, loài ong không ngòi đốt cũng cho các sản phẩm như mật ong, keo ong, phấn hoa, sáp ong,… Vớ , sản phẩm được quan tâm chủ yếu là mật ong, vì nó có kích thước nhỏ, mật độ đàn thấp nên năng suất mật thấp,

do đó rất ít được thuần hóa để nuôi mà chủ yếu lấy mật từ các tổ tự nhiên Theo kinh nghiệm dân gian khi nuôi ong loài này, khoảng một năm mới thu hoạch mật và chia đàn một lần, sản lượng mật rất ít chỉ khoảng 250 mL trên một đàn trong một năm Trong những năm gần đây, mật ong của loài ong này đang được chú ý nhất trong các loại mật ong do sản lượng ít và có dược tính tốt, nó được sử dụng như một loại thuốc dân gian để chữa một số bệnh như đau dạ dày, hen xuyễn, làm lành vết thương, nên giá thành của nó rất cao, khoảng 30 - 40 lần so với giá của mật ong thường

Ở nước ta, loài ong này cũng bắt đầu thuần hóa để nuôi lấy mật ở một sốnhư Tiền Giang, Bến Tre, Ninh Thuận, Bình Thuận,Hà Tĩnh, Hưng Yên,… Người nuôi ong chủ yếu nuôi để kiếm thêm thu nhập và nuôi theo kiểu tự phát, chưa có quy

mô tập trung, nuôi với kinh nghiệm gia đình mà chưa có kỹ thuật nuôi nên sản lượng mật còn rất thấp chưa được cải thiện Bên cạnh đó, nước ta đến nay vẫn chưa có một quy định nào về nghề nuôi ong cũng như chưa có một quy trình kiểm tra, đánh giá chất lượng mật ong

Trong tổ của loài ong không ngòi đốt, ngoài sản phẩm chính là mật ong được chúng dự trữ làm thức ăn thì keo ong cũng là một thành phần quan trọng Keo ong là thành phần chính của tổ được tạo ra để xây dựng và bảo vệ tổ khỏi kẻ thù hay vi khuẩn, đặc biệt với loài ong không ngòi đốt thì đây là vũ khí duy nhất để ngăn cản kẻ thù tấn công tổ của chúng, bằng cách dùng keo ong xây lối vào để làm nhỏ miệng tổ nên keo ong được chúng tạo ra với số lượng nhiều Keo ong được coi là chất “kháng sinh tự nhiên” vì vậy được con người biết đến và sử dụng trong việc ức chế vi khuẩn

và một số bệnh về dạ dày, ruột, nướu răng, các cơ quan trong cơ thể, nâng cao chức năng miễn dịch, chống lão hóa, chống viêm,…

Những năm gần đây, keo ong của loài ong không ngòi đốt đã được một số nhà khoa học trên thế giới tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chúng Tuy nhiên các nghiên cứu chỉ mới khảo sát sơ bộ về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học, kết quả cho thấy nó có thành phần hóa học rất đa dạng và phụ thuộc nhiều vào môi trường sống, bên cạnh đó cũng có một số hoạt tính sinh học rất có giá trị Ở Việt Nam, loài ong không ngòi đốt phân bố rộng khắp cả nước, đa dạng về loài và bước đầu được thuần hóa để nuôi lấy mật Tuy nhiên, keo ong của loài ong này còn chưa được biết đến, do sau khi thu hoạch mật ong, keo ong thường bị bỏ đi hay chỉ dùng để hàn kín các vết nứt của vật dụng mà chưa có bất kỳ một ứng dụng nào, cũng như chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học hay hoạt tính sinh học của keo ong loài này

1.4.1 Thành phần hóa học của keo ong loài Trigona spinipes ở Brazil

Theo nghiên cứu của M O Freitas cùng các cộng sự, mẫu keo ong của loài T

spinipesđược lấy ở miền Bắc Brazil vào năm2008 đã phân lập được 7 hợp chất (hình

1) Đặc trưng là các hợp chất triterpene khung cycloartane, trong đó hai hợp chất

mangiferolic acid (1) và 3β-hydroxy-24-methylencyloartan-26-oic acid (2) lần đầu tiên

được tìm thấy trong trong keo ong loài này(hình 1)

Hình 1 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong T spinipes

Có nhiều nghiên cứu về sự tương quan giữa thành phần hóa học của keo ong với thành phần hóa học nguồn thức ăn của loài ong Các nghiên cứu cho thấy rằng, nguồn gốc thực vật của keo ong ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Tây Á là dịch tiết ra từ nhựa cây vàmậ ạch đàn(Eucalyptus citriodora)gầnnơi ong làm tổ Theo kết quả này cho thấy, thành phần hóa học của nhựa cây loài này có chứa các hợp chất như: 7-methoxyaromadendrin, 7-methoxykaempferol, narigenin, sakuranetin, gallic acid,

aromadendrin, Trong đó, các hợp chất 4,5 và 7 đều được tìm thấy trong keo ong và

trong câybạch đàn.6

Nghiên cứu của C F Massaro vào năm 2008 cho thấy mẫu keo ong lấy ở Đông Nam Queensland, Úc có 34 hợp chất được phân tích bằng sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ, trong đó có 30 hợp chất đã được định danh Các thành phần chính của mẫu keo ong này là gallic acid, 5 hợp chất pimaric acid và 4 hợp chất abietic acid Trong đó,

gallic acid (8), pimaric acid (9) và đồng phân của pimaric acid (10) lần đầu được tìm

thấy ở keo ong loài T carbonaria (hình 2).

Hình 2 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong T carbonaria năm 2008

Cao ethanol của keo ong loài T carbonaria được thử hoạt tính ức chế enzyme

5-lipoxygenase Kết quả cho thấy cao ethanol của keo ong này có giá trị IC50 là 12.8

µg mL-1, nhưng không mạnh bằng gallic acid (8) có giá trị IC50 là 5.6 µg mL-1.7

Theo nghiên cứu của C F Massaro và cộng sự về keo ong của loài ong không

ngòi đốt loài T carbonaria được lấy vào tháng 7 năm 2011 ở vùng Đông Nam nước

Úc đã phân lập được 6 hợp chất, trong đó có 4 hợp chất cryptostrobin (11), stroboponin (12), (2S)-7-methoxycryptostrobin (13), (2S)-desmethoxymatteucinol (16)

(2S)-là các hợp chất flavanonoid bị C-methyl hóa Cùng với 2 hợp chất flavononoid còn lại

là: (2S)-pinostrobin (14) và (2S)-pinocembrin (15) Các hợp chất này được thử hoạt tính kháng khuẩn trên dòng Staphylococcus aureus,kết quả cho thấy các hợp chất 12,

nhất với giá trị MIC là 6.9 µg mL-1(hình 3)

Hình 3 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong T carbonarianăm 2011

Ngoài ra, khi tiến hành sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ đối với nhựa quả của

cây bạch đàn lai (Corymbia torelliana)xác định được các hợp chất 11-16 cho thấy có

sự tương quan trong thành phần hóa học của keo ong loài T carbonaria và nhựa quả

của câybạch đàn lai Đồng thời kết quả cũng cho thấy, keo ong loài này là sự trộn lẫn giữa sáp ong và nhựa quả của câybạch đàn lai theo một tỉ lệ thích hợp.8

1.4.3 Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona subnitidaở Brazil

Hình 4 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong M subnitida

Keo ong loài M subnitida được nghiên cứu bởi Silvana Alves de Souza và các

cộng sự ở vùng Paraiba, Brazil vào năm 2010 đã phân lập được 9 hợp chất, đặc biệt là

hai hợp chất phenylpropanoid acid: 6-O-p-coumaroyl-D-galactopyranose (17),

6-O-cinnamoyl-1-O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (18) và các hợp chất flavonoid: methoxynaringenin (19), 7-methoxyaromadendrin (20), 7,4'-dimethoxyaromadendrin (21), 4'-methoxykaempferol (22), 3-methoxyquercetin (23), 5-methoxyaromadendrin (24), 5'-methoxykaempferol (25), trong đó hợp chất 17 là hợp chất mới lần đầu tiên

7-được công bố trên thế giới (hình 4).9

1.4.4 Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona interrupta ở Brazil

Mẫu keo ong được Ellen Cristina Costa da Silva và cộng sự lấy tại Manaus –

AM, Brazil vào năm 2011 Từ mẫu keo ong của loài M interruptađãphân lập được 4

hợp chất flavonoid: 5,7,4'-trihydroxyflavone (26), 3,5,6,7,4'-pentahydroxyflavone(27),

naringenin-4'-O-β-D-glucopyranoside (28), myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside (29)

(hình 5)

Kết quả thử hoạt tính ức chế DPPH của keo ong loài này cho thấy giá trị EC50

Hình 5 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong M interrupta

Nghiên cứu của J A Pino vào năm 2003 đã xác định được thành phần các hợp

chất dễ bay hơi trong keo ong Apis mellifera và Melipona beecheii ở bang Yucatán,

phía Đông Nam Mexico Kết quả phân tích bằng sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ cho thấy, trong hai mẫu keo ong có khoảng 120 hợp chất, trong đó 99 hợp chất có trong keo ong mật và 92 hợp chất trong keo ong không ngòi đốt

Đặc biệt, thành phần hóa học của keo ong hai loài này có các hợp chất phổ biến

như α-pinene, β-pinene, trans-verbenol, α-copaene, β-bourbonene, β-caryophyllene,

spathulenol và caryophyllene oxide Tuy có sự giống nhau về thành phần nhưng hàm lượng các hợp chất trong hai mẫu là khác nhau, các hợp chất chính trong keo ong của

loài ong mật là α-pinene (11.9 %), hexadecanoic acid (10.9 %) và trans-verbenol (7.0

%), trong khi ở keo ong của loài ong không ngòi đốt có thành phần chính là α-pinene (17.6 %), β-caryophyllene (11.8 %), spathulenol (9.7 %), caryophyllene oxide (9.5 %),

β-bourbonene (9.2 %), β-pinene (6.7 %), α-copaene (4.8 %) và trans-verbenol (4.0 %).

Từ kết quả đó có thể kết luận rằng, thành phần hóa học của keo ong rất đa dạng,

nó có nguồn gốc từ các loài thực vật trong khu vực và có sự khác nhau về thành phần hóa học tùy vào mỗi loài ong, kể cả khi chúng sinh sống trong cùng một môi trường.11

Trigona laeviceps là loài ong bản địa ở Thái Lan cho lượng keo ong tương đối

lớn Keo ong của loài này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư trên 5 dòng tế bào ung thư là ung thư ruột kết (SW620), ung thư vú (BT474), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Chago), ung thư dạ dày (Kato-III) cùng 2 dòng tế bào bình thường là tế bào gan (CH) và các nguyên bào sợi (HS-27)

1

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao ethanol của keo ong của loài T laeviceps có

hoạt tính mạnh trên cả 7 các dòng tế bào thử nghiệm, trong đó hoạt tính mạnh nhất đối với dòng tế bào SW620 có giá trị IC50 là 19.9 µg mL-1, các dòng tế bào còn lại đều có

IC50< 50 µg mL-1 Tuy nhiên, cao hexane của keo ong loài này chỉ có hoạt tính trên dòng tế bào SW620 với giá trị IC50là 16.4µg mL-1mà không có hoạt tính trên 2 dòng tế bào thường

Từ đó có thể kết luận rằng, keo ong của loài T laeviceps của Thái Lan chứa

một số hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng các dòng tế bào ung thư mà không gây hại trên các dòng tế bào bình thường.12

1.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của loài Trigona sp ở Ấn Độ

Keo ong của loài Trigona sp được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian Ấn Độ

để điều trị nhiều loại bệnh Tiến hành phân lập các hợp chất của cao ethanol cho thấy

có chứa 24 hợp chất với 9 chất đã được biết và 15 chất mới chưa được công bố thuộc

họ alkane, thiophilic acid, acid thơm, acid béo, đường, ester và terpene

Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol cho thấy hoạt động kháng khuẩn mạnh đối với cả vi khuẩn gram (–) và gram (+) cũng như đối với nấm men Giá trị MIC trong khoảng 1.2- 9.8 g mL-1trong khi giá trị MBC/MFCtrong khoảng 2.4- 19.5 g mL-1 Thời gian để đạt được hoạt tính khoảng 90 % từ 1.1 đến 3.5 giờ với giá trị MIC tương ứng.13

Cao ethanol của keo ong của ba loài M fasciculata, M compressipes và M

quadrifasciata ở Brazil cho thấy có khả năng kháng vi khuẩn gram (–) với hàm lượng flavonoid cao cho kết quả kháng khuẩn cao Do tác dụng kháng vi khuẩn Candida albicans, Streptococcus mutans, Lactobacillus sp và Glucosyl transferases nên keo

ong của các loài này đã được đề nghị như là một chất hỗ trợ để phòng ngừa các bệnh truyền nhiễm của khoang miệng, đặc biệt là bệnh sâu răng Ngoài ra, các nghiên cứu

của keo ong thuộc chi Melipona ở Brazil còn tìm được các hoạt chất có khả năng

kháng khuẩn trên 2 loài Streptococcus pneumoniae và Staphylococcus aureus.14

1.5.4 Hoạt tính kháng tăng trưởng các dòng tế bào ung thư của keo ong không

ngòi đốt loài Melipona scutellaris ở Brazil

Theo nghiên cứu của Marcos Guilherme da Cunha và các cộng sự, mẫu keo ong được lấy ở miền Bắc Brazil vào năm 2013 được tiến hành chiết với các dung môi ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate thu được các cao tương ứng Tiến hành thử hoạt tính kháng tăng trưởng của các cao này trên 8 dòng tế bào ung thư: u thần kinh đệm (U251), ung thư da (UACC-62), ung thư vú (MCF-7), ung thư buồng trứng kháng

đa thuốc (NCI/ADR-RES), ung thư thận (786-0), ung thư phổi (NCI-H460), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư buồng trứng (OVCAR-3), đều thu được giá trị TGI< 50

µg mL-1đối với cao ethanol và cao hexane Trong đó, cao hexane có hoạt tính mạnh nhất trên tất cả các dòng ung thư với giá trị TGI lần lượt là 7.2, 1.8, 14.1, 14.3, 8.5, 9.6, 6.0, 3.9 µgmL-1

Cao ethanol của keo ong loài này cũng có khả năng kháng khuẩn với giá trị MIC < 50 µg mL-1trên 3 dòng vi khuẩn gram (+) là Streptococcus mutans UA 159,

Staphylococcus aureus ATCC 25923, vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 33592

kháng meticillin (MRSA) và cho khả năng ức chế yếu với dòng vi khuẩn gram (–) như

1.5.5 Một số hoạt tính sinh học của keo ong loài Melipona orbignyiở Brazil

Keo ong loài M orbignyi được lấy ở tiểu bang Mato Grosso do Sul trong khu

vực Trung Tây của Brazil vào năm 2008 Thành phần hóa học của keo ong được xác định chủ yếu là các hợp chất flavonoid Kết quả thử hoạt tính cho thấy khả năng kháng

một số vi khuẩn gram (+) như Staphylococcus aureus, Candida albicans và không có

ảnh hưởng đến các vi khuẩn gram (–) như Escherichia coli Đồng thời, keo ong loài này còn có khả năng ức chế DPPH và gây độc dòng tế bào ung thư máu K562.16

2.1.1 Tụy và ung thư tuyến tụy

Tụy là một tuyến nằm phía sau dạ dày và phía trước cột sống, có chức năng sản xuất ra dịch tiêu hoá và các hormone điều hoà lượng đường huyết trong máu (hình 6)

Tế bào của tuyến tụy ngoại tiết sản xuất ra dịch tiêu hoá thức ăn, còn tế bào của tuyến tụy nội tiết sản xuất insulin và một số hormone khác

Hình 6 Vị trí và cấu tạo của tuyến tụy

Ung thư tuyến tụy có nguồn gốc từ các mô của tuyến tụy, trong đó 75 % ung thư tuyến tụy là xảy ra ở phần đầu tụy, 15 - 20 % ở phần thân, 5 - 10 % ở phần đuôi tụy Ung thư ở đầu tụy có triệu chứng xuất hiện sớm hơn ung thư ở thân và đuôi tụy (triệu chứng do chèn ép đường mật), do đó có tỉ lệ phẫu thuật cắt bỏ cao hơn

Ung thư tuyến tụy thường di căn nhanh và ít khi được phát hiện ở giai đoạn đầu, đó là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các loại bệnh ung thư Mặc dù hiện nay đã có nhiều phương pháp xét nghiệm hiện đại nhưng việc phát hiện các khối

u tụy dưới 2 cm còn rất khó khăn Thường sau khi khối u xuất hiện một thời gian mới

có biểu hiện lâm sàng, vào thời điểm chẩn đoán thì có đến 25 - 30 % bệnh nhân đã có

tế bào ung thư di căn, thường gặp nhất là di căn ra các hạch bạch huyết quanh tụy, phúc mạc, gan và đôi khi di căn đến xương và phổi Chính vì sự di căn lan rộng nên khó chẩn đoán và hầu như phẫu thuật là rất khó khăn.17,18

2.1.2 Phân loại ung thƣ tuyến tụy

Hầu hết ung thư tuyến tụy xuất phát từ phần ngoại tiết của tụy, trong đó 80 % ung thư có nguồn gốc từ biểu mô của tuyến tụy (ung thư ngoại tiết), ngoài ra còn có ung thư nội tiết ít phổ biến hơn

Ung thƣ ngoại tiết (exocrine cancer): các tế bào bị ung thư là những tế bào ở

mặt trong ống tụy giúp sản xuất các dịch tiêu hóa còn được gọi là ung thư biểu mô của tuyến tụy Đây là một loại khối u biểu mô ác tính, loại ung thư có khả năng di căn nhiều nhất Vào thời điểm chẩn đoán, hầu hết các trường hợp ung thư đều đã di căn đến các vị trí khác của cơ thể Loại ung thư này có khả năng đề kháng đối với điều trị

Ung thư nội tiết (endocrine cancer): ung thư hình thành trong các tế bào sản

xuất hormone của tuyến tụy được gọi là ung thư nội tiết hay u tế bào đảo tụy Loại ung thư này rất ít khi gặp Hầu hết các khối u nội tiết hoạt động theo kiểu lành tính

Các bệnh lý ác tính khác của ung thư tụy bao gồm: ung thư nang tuyến (acinar cell carciomas), ung thư mô liên kết của tụy (sarcomas), ung thư mô bạch huyết của tụy (lymphomas),…18

2.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư tuyến tụy

2.1.3.1 Hóa trị

Hóa trị là việc sử dụng thuốc để tiêu diệt các tế bào ung thư Thuốc có vai trò làm gián đoạn quá trình tổng hợp DNA của tế bào ung thư làm cho tế bào ung thư không phân bào được và chết.Phần lớn các thuốc sử dụng để hóa trị đều gây nên những tác dụng phụ bên cạnh khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư như: buồn nôn, rụng tóc, mệt mỏi, giảm bạch cầu và tiểu cầu, sốt thiếu máu, gây vô sinh hay quái thai,…19

2.1.3.2 Xạ trị

Xạ trị là phương pháp điều trị bằng cách sử dụng tia bức xạ có năng lượng cao tác động vào khối u để tiêu diệt các tế bào ung thư hoặc ngăn không cho chúng phát triển Dưới tác dụng bức xạ ion hoá trực tiếp tác động vào DNA làm DNA bị đứt, gãy liên kết làm cho tế bào ung thư không phân bào được và chết Hay bức xạ ion hoá tác dụng gián tiếp lên phân tử nước gây hiện tượng ion hoá, các phân tử nước tạo thành các ion hay các hợp chất có khả năng oxy hoá cao, chúng tác động làm tổn thương DNA.Tia phóng xạ cũng tác động lên chu trình tế bào làm cho tế bào trở nên già yếu

và chết theo chu trình

Bên cạnh đó xạ trị còn làm thay đổi các đặc tính hay phá hủy tế bào thường, tăng sai lệch nhiễm sắc thể, gây rối loạn về chuyển hoá Kết quả cuối cùng là những biểu hiện như: suy nhược, rụng tóc, đục thuỷ tinh thể, xuất huyết, vô sinh, ung thư và thậm chí có thể gây tử vong khi sử dụng bức xạ liều cao.19

2.1.3.3 Phẫu thuật

Phẫu thuật là phương pháp điều trị xuất hiện sớm và đến nay nó vẫn là phương pháp hiệu quả trong điều trị ung thư tuyến tụy Tùy tình trạng bệnh nhân và tình trạng khối u mà phương pháp phẫu thuật sẽ được chọn là cắt bỏ một phần hay hoàn toàn tuyến tụy Trong điều trị ung thư tuyến tụy, phẫu thuật được phân ra 2 kỹ thuật chính:

Giải phẫu khối u ở phần đầu tụy tạng (Whipple): thực hiện khi ung thư ở

phần đầu hoặc phần móc của tuyến tụy Phẫu thuật này loại bỏ đầu và phần móc của tuyến tụy, cùng lúc với tá tràng, túi mật, một phần của dạ dày Sau đó các phần còn lại của tuyến tụy, dạ dày và ruột sẽ được nối với nhau tái lập sự lưu thông của đường mật

và dịch tụy giúp cho sự tiêu hóa

Giải phẫu khối u ở thân và đuôi tụy tạng (Diatt Pancreatectomy): thực hiện

khi ung thư ở thân hoặc ở đuôi tụy Phẫu thuật này loại bỏ phần thân và đuôi của tuyến tụy cùng với lá lách.18,19

2.1.3.4 Phương pháp hỗ trợ điều trị

Phương pháp tốt nhất để điều trị ung thư tuyến tụy là phẫu thuật cắt bỏ, nhưng cũng không thể loại bỏ tất cả các tế bào ung thư và phải sử dụng hóa trị hay xạ trị để giảm khả năng tái phát của ung thư

Do đó, có một nhu cầu cấp bách là phát triển phương pháp trị liệu và tìm kiếm các tác nhân mới nhằm cải thiện kết quả cho các bệnh nhân ung thư tuyến tụy Với sự phát triển của y học giúp hiểu biết thêm về mức độ sinh học phân tử của căn bệnh,

cùng với việc thiết kế mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo sử dụng các tác nhân ức

chế trên các dòng tế bào ung thư tuyến tụy, phản ánh ngày càng đúng hơn về bệnh ung thư tuyến tụy và cho kết quả thử nghiệm chính xác hơn trên cơ thể người.20

2.1.4 Một số dòng tế bào ung thư tuyến tụy

Một số dòng ung thư tuyến tụy thường gặp:

PANC-1: ung thư biểu mô tuyến trên ống tụy

PSN-1: ung thư biểu mô tuyến trên tụy

BxPC-3: ung thư biểu mô tuyến trên tụy

Capan-1: di căn gan của ung thư biểu mô tuyến trên tụy

PL45: chủ yếu ở ung thư biểu mô tuyến trên gốc ống tụy

AsPC-1: do sự ghép mô giữa chuột không lông với tế bào cổ trướng ở

Trong đó, dòng tế bào PANC-1 được tách ra và nuôi dưỡng từ biểu mô của ống dẫn trên tuyến tụy của bệnh nhân bị ung thư tuyến tụy dạng biểu mô Dòng tế bào này

có chu kỳ sống ngoài cơ thể là 52 giờ Các thử nghiệm cho thấy, dòng tế bào PANC-1 vẫn duy trì một số đặc điểm riêng biệt của các tế bào biểu mô ống tụy Đây là yếu tố quan trọng để lựa chọn dòng tế bào PANC-1 cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng của bệnh ung thư tuyến tụy.21

2.2 Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả năng kháng ung thƣ tuyến

2.2.1

Keo ong Mexico: Mẫu keo ong được lấy ở Caborca, bang Sonora, Mexico vào

tháng 5 năm 1999 Feng Li và các cộng sự đã phân lập được 46 hợp chất, trong đó có 5 hợp chất mới thuộc khung flavonoid lần đầu tiên được công bố Tất cả 46 hợp chất được phân lập từ keo ong Mexicođã được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC-1, kết quả cho thấy có 31 hợp chất có giá trị PC50< 100 µM, đặc

biệt hợp chất (2R,3R)-3-O-(2-methylbuthanoyl)-5-hydroxy-7-methoxyflavanone cho

giá trị PC50 thấp nhất là 4.6 µM (hình 7), so với chất đối chứng dương arctigenin (PC50= 0.4 µM).22,23

Hình 7 Cấu trúc của (2R,3R)-3-O-(2-methylbuthanoyl)-5-hydroxy-7-methoxyflavanone

Keo ong đỏ Brazil: Mẫu keo ong đỏ Brazil được lấy từ miền Nam bang

Paraiba, Brazil năm 2005 Suresh Awale cùng các cộng sự đã phân lập được 43 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất mới lần đầu tiên được công bố.Các hợp chất phân lập từ keo ong đỏ Brazil được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC-1, kết quả cho thấy có 7 hợp chất có giá trị PC100< 100 µM, đặc biệt hợp chất

(6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan có giá trị PC100 thấp nhất là 12.5 µM (hình 8), cùng với chất đối chứng dương là arctigenin (PC100=1.0 µM).24

Hình 8 Cấu trúc của (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan

Keo ong Myanmar: Mẫu keo ong được lấy tại làng Ywar Taw, Myanmar vào

năm 2006 Feng Li cùng các cộng sự đã phân lập được 17 hợp chất có trong keo ong này, trong đó có 2 hợp chất mới triterpene khung cycloartane lần đầu tiên được công

bố Tất cả 17 hợp chất này được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng PANC-1, kết quả cho thấy có 10 hợp chất có giá trị PC50< 100 µM, đặc biệt hợp chất

(24E)-27,28-dihydro-3-oxoxycycloart-24-en-26-oic acid cho giá trị PC50 thấp nhất là 4.3 µM (hình 9), cùng với chất đối chứng dương là arctigenin (PC50= 0.4 µM).25,26

Hình 9 Cấu trúc của (24E)-27,28-dihydroxy-3-oxocycloart-24-en-26-oic acid

2.2.2

Hạt tô mộc Việt Nam: Theo nghiên cứu của N T T Mai cùng các cộng sự,

mẫu hạt tô mộc được lấy tại tỉnh An Giang, Việt Nam vào năm 2009 đã phân lập được

3 hợp chất mới diterpene khungcleistanthane lần đầu tiên được công bố Các hợp chất này được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng PANC-1, kết quả cho thấy cả 3 hợp chất đều cho giá trị PC50 < 100 µM, đặc biệt là hợp chất tomocinon cho giá trị PC50 thấp nhất là 34.7 µM(hình 10), so với chất đối chứng dương arctigenin (PC50 = 0.8 µM).27

Hình 10 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ hạt tô mộc

Lá sa kê Việt Nam: Mẫu lá cây sa kê được nghiên cứu bởi N T T Mai và các

cộng sự vào năm 2009 đã phân lập được 12 hợp chất dihydrochalcone, trong đó có 8 hợp chất mới lần đầu tiên được công bố Tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng PANC-1của 7 trong 12 hợp chất, kết quả cho thấy cả 7 hợp chất đều có hoạt tính với giá trị PC50 < 100 µM, đặc biệt là hợp chất sakenin F cho giá trị

PC50 là 8.0 µM(hình 11) so với chất đối chứng dương là arctigenin (PC50 = 0.8 µM).28

Hình 11 Cấu trúc của sakenin F

2.2.3

qianghuo), là một loại thuốc dạng thô truyền thống ở Trung Quốc được sử dụng rộng rãi để giải nhiệt, giảm đau Thành phần của thuốc chủ yếu là thân và rễ dưới mặt đất

của 2 loài Notopterygium incisum Ting ex H.T Chang và Notopterygiumforbesii

Boiss, bao gồm các hợp chất coumarin, polyphenol, monoterpene và sesquiterpene Dịch trích CHCl3 cây qianghuo có khả năng chống lại dòng tế bào ung thư tuyến tụy PANC-1 với giá trị PC50 là 17.5 g mL-1 Từ cao CHCl3 này đã phân lập được 19 hợp chất, trong đó ostruthin(hình 12) cho thấy có khả năng gây độc mạnh nhất với giá trị PC50 trên 2 dòng tế bào PANC-1 và PSN-1 lần lượt là 7.2 M và 7.8 M so vchất đối chứng dương là arctigenin ( PC50 1.5 µM).29

Hình 12 Cấu trúc của ostruthin

Bản (tên khoa học là Arctium lappa) cho thấy có khả năng 100 % dòng tế bào ung thư tuyến tụy trong điều kiện NDM ở nồng độ 50 g mL-1 và không gây độc tế bào trong điều kiện DMEM Phân lập theo hoạt tính sinh học thu được hợp chất arctigenin rất mạnh trên các dòng tế bào PANC-1, PSN-

1, AsPC-1, BxPC-3 cho giá trị PC100 chỉ ở khoảng 0.01 g mL-1 30

Hình 13 Cấu trúc của arctigenin

Garcinia huillensis Công Gô:Dịch trích CHCl3 từ cây Garcinia huillensis (một

loại cây thuốc ở Công Gô) có khả năng dòng tế bào tuyến tụy PANC-1 với

PC50 là 1.8 g mL-1 trong điều kiện NDM Kết quả phân lập cao CHCl3 thu được 12 hợp chất, trong đó hợp chất damnacanthal(hình 14) có hoạt tính mạnh nhất trên dòng PANC-1 và PSN-1 với giá trị PC50 lần lượt là 4.5 M và 3.8 M so v chất đối chứng dương là arctigenin ( PC50 0.5 1.5 µM).31

Hình 14 Cấu trúc của damnacanthal

Bồ quả đác Đông Nam Á:Cao CH2Cl2 của cây bồ quả đác (tên khoa học là

Uvaria dac, thuộc họAnnonaceae, một loại cây thân gỗ đặc hữu ở các quốc gia Đông

Nam Á như Việt Nam, Thái Lan) có khả năng một số dòng tế bào tuyến tụy Trong đó granfloracin(hình 15) là chất có hoạt tính mạnh nhất trên các dòng tế bào PANC-1 (PC50 = 14.5 M), PSN-1 (PC50 = 32.6 M), MIA PaCa-2 (PC50 = 17.5 M), KLM-1 (PC50 = 37.2 M)so v chất đối chứng dương là arctigenin (

PC50 1.5 µM).32

Hình 15 Cấu trúc của granfloracin

2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư tuyến tụy

2.3.1 Nguyên tắc

Trong thử nghiệm invitro ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư tuyến tụycủa các

cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được dựa trên phương pháp trắc quang.Trong môi trường nuôi cấy có dinh dưỡng (DMEM) hay không có dinh dưỡng (NDM), các tế bào cung cấp một điện tử trung gian làm chuyển hóa muối MTT thành MTT formazan có màu tím và có độ hấp thu cực đại tại 570 nm (hình 16) Các mẫu thử khi cho vào dung dịch sẽ làm giảm số lượng tế bào ung thư, do đó hàm lượng MTT formazan cũng giảm và làm giảm cường độ màu của dung dịch Dựa vào cường

độ màu của dung dịch khi có và không có mẫu thử ta sẽ tính được khả năng gây độc tế

bào ung thư của mẫu thử

Hình 16 Phản ứng chuyển hóa MTT thành MTT formazan

Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của các mẫu khảo sát, quy trình này sử dụng chất đối chứng dương là arctigenin, gemcitabine và 5-florouracil (hình 17), trong đó gemcitabine là thuốc đang được dùng để điều trị ung thư tuyến tụy, 5-florouracil là thuốc được dùng để điều trị các bệnh ung thư, còn arctigenin được sử dụng như một chất đối chứng dương trong phòng thí nghiệm.21

Hình 17 Cấu trúc của các hợp chất đối chứng dương

2.3.2 Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ

2.3.2.1 Khả năng gây độc tế bào ung thƣ

Khả năng gây độctế bào ung thư được đánh giá thông qua giá trị phần trăm gây độc(PC %) Giá trị phần trăm gây độc được tính thông qua công thức sau:

Trong đó:

Acontrol: giá trị mật độ quang của dung dịch không chứa mẫu khảo sát

Asample: giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu khảo sát Dựa trên phần trăm gây độc ta có thể đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của mẫu tại nồng độ khảo sát

2.3.2.2 Giá trị PC 50 và cách xác định giá trị PC 50

Mỗi mẫu khảo sát được thử ở 3 nồng độ khác nhau (100, 10, 1 μg mL-1), mỗi nồng độ làm 3 lần, từ đó tính được giá trị phần trăm gây độc (PC %) Lấy trung bình 3 giá trị đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm gây độc ứng với từng nồng độ khảo sát,

từ đó xác định được giá trị PC50

độc được 50 % tế bào ung thư Đây là chỉ số dùng để xem xét đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của mẫu khảo sát, giá trị PC50 càng thấp thì mẫu khảo sát có hoạt tính càng mạnh

Để xác định giá trị PC50 ta tiến hành khảo sát hoạt tính gây độc của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau Dựng đường biểu diễn phần trăm gây độc theo mẫu thử sau đóthay giá trịy = 50 % vào phương trình hồi quy của đồ thị ta sẽ thu được giá trị PC50, đó chính là nồng độ gây độcđược 50 % tế bào ung thư

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng của keo ong loài ong Ý (Apis

mellifera), tuy nhiên keo ong của loài ong không ngòi đốt chỉ có một vài nghiên cứu

với phạm vi nhỏ và hạn chế về phương pháp phân tích Ở Việt Nam, keo ong là một nguồn nguyên liệu tự nhiên còn rất mới mẻ, phần lớn chúng chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được ứng dụng rộng rãi Đối với loài ong Ý, nước ta chủ yếu nuôi công nghiệp để lấy mật ong hay sữa ong chúa, còn loài ong không ngòi đốt chỉ được nuôi với quy mô nhỏ và gia đình, mà keo ong của nó chưa có bất kỳ một nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng kháng ung thư tuyến tụy

Do đó, mục tiêu của đề tài là phân lập các hợp chất có khả năng gây độ ế

- -1 từ keo ong dú (Trigona minor

THỰC NGHIỆM

Silica gel pha thường (Spain)

Bản mỏng silica gel pha thường (Merck)

Phễu lọc thường, áp suất kém

Và các dụng cụ khác như: giấy lọc, bông gòn, đũa thủy tinh, ống nhỏ giọt, hũ

bi, ống vi quản,…

Hệ thống cô quay chân không

Hệ thống đông khô chân không

Máy quang phổ (SHIMADZU UV-1800)

Máy NMR Bruker 500 MHz

Trong đề tài này, hoạt tính ung thư tuyến tụy được thử nghiệm trên dòng tế bào PANC-1 và PSN-1 được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp Chất Tự Nhiên, Viện Nghiên cứu Thuốc từ Tự Nhiên, Trường Đại học Toyama, Nhật Bản

Thành phần môi trường có dinh dưỡng (DMEM): 100 mg L-1 glucose, tùy theo dòng tế bào mà hàm lượng huyết thanh bào thai bò (FBS) được thêm vào với tỷ lệ tương ứng, với dòng PANC-1 - hàm lượng FBS được thêm vào là 10 %

Thành phần môi trường thiếu dinh dưỡng (NDM):265 mg L-1 CaCl2.2H2O, 400

mg L-1 KCl, 200 mg L-1 MgSO4.7H2O, 6400 mg L-1 NaCl, 700 mg L-1 NaHCO3, 125

mg L-1 NaH2PO4.2H2O, 0,1 mg L-1 Fe(NO3)3.9H2O, 15 mg L-1 phenol đỏ, 100000 UL-1penicillin G, 100 mg L-1 streptomycin, 25 mL đệm HEPES (pH = 7.4) và dung dịch vitamin MEM (dung dịch hỗ trợ sự tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy mô), cuối cùng chỉnh pH về 7.4 bằng NaHCO3 10 %

Mẫu thử được pha với các nồng độ là 100 μg mL-1, 10 μg mL-1, 1 μg mL-1 đối

với mẫu cao và 100 μM, 10 μM, 1 μM đối với mẫu chất

Thuốc thử MTT với nồng độ 1 mg mL-1 được pha trong môi trường DMEM

Các tế bào ung thư tuyến tụy PANC-1 -1được cấy trong đĩa nuôi 96 giếng (có khoảng 104 tế bào trong một giếng, một số giếng sẽ không cho tế bào ung thư để làm mẫu trắngcho các mẫu thử) và ủ trong môi trường có dinh dưỡng (DMEM) với 10 % huyết thanh bào thai bò (FBS) tại 370C trong môi trường thiếu khí oxy với tỉ

lệ khí là 5 % CO2 và 95 % không khí trong 24 giờ

Các tế bào sau khi nuôi cấy được rửa với dung dịch đệm phosphate (PBS) đưa vào môi trường DMEM hoặc môi trường NDM,sau đó ủ tế bào trong 24 giờ với mẫu thử.Sau 24 giờ ủ, các tế bào được rửa lại lần nữa với dung dịch đệm PBS và thêm vào các giếng 100 µL dung dịch thuốc thử MTT, ủ tiếp thêm 3 giờ rồi đo độ hấp thu quang của các dung dịch tại bước sóng 570 nm

HEXANE CỦA KEO ONG LOÀI TRIGONA MINOR

Mẫu keo ong lẫn với tổcủa loài ong không ngòi đốtthuộc loài Trigona

minorđược lấy ở xã Long Thới, huyện ChợLách,tỉnh Bến Tre, Việt Namvào tháng 7

năm 2011, với khối lượng khoảng 2 kg và được định danh bởi Tiến sĩ Lê Quang Trung, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Ong, Hà Nội, Việt Nam

Từ 2 kgmẫukeo ong đã được loại mật ong tiến hành trích nguội với dung môi EtOH tại nhiệt độ phòng, đánh siêu âm 12 giờ mỗi lần, lọc lấy phần dung dịch bằng phễu buchner, làm vài lần để trích kiệt Toàn bộ dịch trích thu được đem cô quay áp suất kém, thu được cao EtOH Lấy cao này phân tán vào nước, sau đó chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi hexane vàEtOActhu được các cao phân đoạn tương ứng: cao hexane, cao EtOAc và cao nước còn lại saudịch chiết (sơ đồ 1)

Sơ đồ 1 Sơ đồ điều chế cao của mẫu keo ong

Vì cao hexane có khả năng tế bào ung thư tuyến tụy tính mạnh hơn cao EtOAc và có khả năng tách tốt trên sắc ký bản mỏng nên cao hexane được chọn để tiến hành phân lập và xác định cấu trúc các hoạt chất

Từ 220 g cao hexane được tiến hành cho qua cột sắc ký pha thường với hệ dung môi giải ly là hexane:acetone theo độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100 % acetone Dung dịch giải ly khỏi cột được hứng theo thể tích vàthu hồi dung môi bằng hệ thống cô quay chân không thu được nhiều phần Sau đó tiến hành sắc ký bản mỏng với các mẫu này kết hợp với khả năng hấp thu tia tử ngoại của các hợp chất tại bước sóng 254 nm cũng như khả năng hiện hình với thuốc thử H2SO4 50 % thu được 14 phân đoạn nhỏ

được ký hiệu lần lượt như sau: 0, A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M (sơ đồ 2)

Sơ đồ 2 Sơ đồ điềuchế cao phân đoạn từ cao hexane

SKC pha thường (hexane:acetone)

5.3.1 Phân đoạn B

Khảo sát phân đoạn B:tiến hành rửa tinh thể phân đoạn B (34.17 g) với dung

môi MeOH, sau đó kết tinh lại trong dung môi CHCl3 thu đượctinh thể là hợp

chất1(518.2 mg) (sơ đồ 3)

Sơ đồ 3 Quá trình phân lập hợp chất của phân đoạn B

5.3.2 Phân đoạn D

Khảo sát phân đoạn D: tiến hành rửa tinh thể phân đoạn D(14.79 g) với dung

môi MeOH, sau đó kết tinh lại trong dung môi CHCl3 thu được tinh thể là hợp

chất2(1.20 g) (sơ đồ 4)

Sơ đồ 4 Quá trình phân lập hợp chất của phân đoạn D

5.3.3 Phân đoạn H

Khảo sát phân đoạn H: phân đoạn H (6.48 g) được tiến hành sắc ký cột với

silica gel pha thường và hệ dung môi giải ly là hexane :acetonetheo độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100 % acetone Dựa trên sắc ký bản mỏng của dung dịch giải ly thu được

RTT (MeOH,CHCl 3 )

D

14.79 g

Dịch rửa 13.59 g

Hợp chất 2 1.20 g

RTT (MeOH,CHCl 3 )

B

34.17g

Dịch rửa 33.65 g

Hợp chất 1 518.2 mg

kèm theo thuốc thử hiện hình, thu được 7 phân đoạn H1, H2, H3, H4, H5,H6,H7

(sơ đồ5)

Khảo sát phân đoạn H3: tiến hành sắc ký cột phân đoạn H3(780.0 mg) với

silica gel pha thườngvà hệ dung môi giải ly làhexane :EtOActheo độ phân cực tăng dần từ 0đến 100 % EtOAc Dựa trên sắc ký bản mỏng của dung dịch giải ly thu

được kèm theo thuốc thử hiện hình, thu được 5 phân đoạn H31, H32, H33, H34,

H35(sơ đồ 5)

Khảo sát phân đoạn H32: tiến hành sắc ký bản mỏng điều chếpha thường

phân đoạn H32(97.0 mg) với hệ dung môi triển khai là CHCl3: MeOH (98 : 2), sau đó mẫu được giải hấp với hệ dung môi giải ly là 30 % MeOH trong CHCl3 thu được hợp

chất3(3.8 mg) và hợp chất 9(4.2 mg)(sơ đồ 5)

Khảo sát phân đoạn H4: tiến hành sắc ký cột phân đoạn H4(2.02 g) với silica

gel pha thườngvà hệ dung môi giải ly là CHCl3 :MeOH theo độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100 % MeOH Dựa trên sắc ký bản mỏng của dung dịch giải ly thu được kèm theo

thuốc thử hiện hình, thu được 7 phân đoạn H41, H42, H43, H44, H45, H46, H47

(sơ đồ6)

Khảo sát phân đoạn H44: tiến hành rửa tinh thể phân đoạn H44(68.0mg) với

dung môi MeOH, sau đó kết tinh lại trong dung môi CHCl3 thu được tinh thể là hợp

chất5(5.0 mg) (sơ đồ 6)

Khảo sát phân đoạn H47: tiến hành rửa tinh thể phân đoạn H44(160.1mg) với

dung môi MeOH, sau đó kết tinh lại trong dung môi CHCl3 thu được tinh thể là hợp

chất4(46.0 mg) (sơ đồ 6)

Hợp chất 9 4.2 mg

Sơ đồ 6 Quá trình phân lập hợp chất của phân đoạn H4

H4

2.02 gSKC pha thường (CHCl3 : MeOH)

Hợp chất 4 46.0 mg