Nghiên cứu chiết tách các hợp chất có hoạt tính ức chế alpha - glucosidase của trái khổ qua và thử nghiệm tác dụng kiểm soát đường huyết sau khi ăn

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH - - BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHCN CẤP SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HCM (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Đề tài: NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE CỦA TRÁI KHỔ QUA VÀ THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KIỂM SOÁT ĐƯỜNG HUYẾT SAU KHI ĂN Cơ quan chủ trì: Viện Cơng nghệ Hóa học Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Ngọc Hạnh ThS Phùng Văn Trung TP HỒ CHÍ MINH 11– 2008 Báo cáo nghiệm thu MỤC LỤC Trang PHẦN TỔNG QUAN I ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA I.1 Mô tả Khổ qua 8 I.2 Phân bố sinh thái I.3 Y học dân gian Khổ qua II CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHỔ QUA II.1 Các công trình nghiên cứu nước II.1.1 Thành phần hóa học II.1.2 Tác dụng dược lý II.2 Các cơng trình nghiên cứu giới II.2.1 Thành phần hóa học II.2.2 Một số hợp chất cô lập từ Khổ qua II.2.3 Tác dụng dược lý III CHARANTIN III.1 Giới thiệu III.2 Qui trình chiết xuất charantin III.3 Hoạt tính kháng đái tháo đường charantin IV SƠ LƯỢC VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG IV.1 Tình hình bệnh đái tháo đường giới Việt Nam IV.2 Bệnh đái tháo đường IV.3 Hóa dược trị đái tháo đường IV.3.1 Ức chế α-Glucosidase IV.3.2 Nhóm Sulfonylurea IV.3.3 Nhóm Meglitinide IV.3.4 Nhóm Biguanide IV.3.5 Nhóm Thiazolidinedione (TZD) IV.3.6 Insulin V PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE V.1 Men α-glucosidase V.2 Vai trò α-glucosidase trình hình thành glucose V.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α- glucosidase NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I NGUYÊN LIỆU 10 12 12 12 12 13 13 14 22 23 23 24 25 25 25 26 27 27 28 28 28 29 29 29 29 30 30 32 Báo cáo nghiệm thu II SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE 32 II.1 Điều chế cao chiết II.2 Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase cao chiết II.2.1 Nguyên tắc II.2.2 Phương pháp tiến hành 32 33 33 33 II.2.3 Chuẩn bị mẫu thử II.2.4 Kết khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase 33 34 a Cao T1 b Cao T2 c Cao T3 34 35 36 d Cao T4 II.2.5 Kết luận 37 37 III PHÂN LẬP CÁC HOẠT CHẤT 38 IV NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 39 45 V KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ  - GLUCOSIDASE CỦA CHARANTIN VI XÂY DỰNG QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT CHARANTIN VÀ TRITERPEN ĐẮNG VI.1 Xây dựng qui trình chiết xuất charantin qui mơ phịng thí nghiệm VI.1.1 Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết VI.1.2 Loại tạp chất làm giàu charantin VI.1.3 Qui trình chiết xuất tinh chế charantin VI.1.4 Áp dụng qui trình chiết xuất charantin VI.1.5 Tiêu chuẩn sở charantin VI.2 Xây dựng qui trình chiết xuất triterpene glycoside đắng từ trái Khổ qua qui mơ phịng thí nghiệm VI.2.1 Khảo sát dung môi chiết xuất VI.2.2 Loại tạp chất nâng cao hàm lượng triterpene VI.2.3 Quy trình chiết xuất triterpen đắng VII.CHIẾT XUẤT CHARANTIN VÀ TRITERPEN ĐẮNG QUY MÔ PILOT VIII KHẢO SÁT TÁC DỤNG KIỂM SOÁT ĐƯỜNG HUYẾT SAU KHI ĂN CỦA CHUỘT (IN VIVO) VIII Nguyên tắc phương pháp VIII Mẫu thử nghiệm 47 47 47 49 51 53 53 53 54 55 55 57 58 58 59 Báo cáo nghiệm thu VIII.3 Kết thử nghiệm VIII.3.1 Khảo sát tác động ức chế α-Glucosidase chuột bình thường 59 VIII.3.2 Khảo sát tác động ức chế α-Glucosidase chuột bị đái tháo đường gây Alloxan 60 VIII.3.2 Kết luận 62 IX THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CẤP DIỄN VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN 62 59 CỦA CHẾ PHẨM IX.1 Nguyên tắc phương pháp IX.2 Mẫu thử nghiệm: IX.3 Kết IX.3.1 Thử nghiệm độc tính cấp diễn bán trường diễn Charantin 01 IX.3.2 Xác định độc tính cấp diễn bán trường diễn MCPE PHẦN KẾT LUẬN DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 63 64 64 64 65 68 69 Báo cáo nghiệm thu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Công thức mẫu thử hoạt tính 34 Bảng 2: Kết đo độ hấp thu tính % I T1 34 Bảng 3: Kết đo độ hấp thu tính % I T2 35 Bảng 4: Kết đo độ hấp thu tính % I T3 36 Bảng 5: Kết đo độ hấp thu tính % I T4 37 Bảng 6: Dữ liệu phổ MC1A 39 Bảng 7: Dữ liệu phổ MC1B 41 Bảng 8: Kết độ hấp thu mẫu ức chế charantin 45 Bảng 9: Kết độ hấp thu mẫu ức chế đối chứng (Acarbose) 46 Bảng 10: Sự biến đổi nồng độ đường huyết tiến trình thực nghiệm pháp dung nạp đường chuột bình thường 59 Bảng 11: Nồng độ đường huyết nhóm chuột uống MCA 600 mg/kg 60 phút thứ 30 Bảng 12: Nồng độ đường huyết nhóm chuột uống MC08 sau uống saccharose 30 phút 60 Bảng 13: Biến thiên đường huyết lơ chuột tiểu đường q trình thử nghiệm 61 Bảng 14: Sự thay đổi đường huyết nhóm chuột tiểu đường 62 trình thử nghiệm Báo cáo nghiệm thu DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1: Cây Khổ qua Hình 2: Var charantia L Hình 3: Var abbreviata Ser Hình 4: Hạt Khổ qua Hình 5: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T1 35 Hình 6: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T2 35 Hình 7: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T3 36 Hình 8: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T4 37 Hình 9: TLC cao T, T50, TW, T1, T2, T3, T4 hệ dung mơi CHCl3_MeOH_H2O(8:2:0.3) 38 Hình 10: Kết thử hoạt tính charantin 45 Hình 11: Kết thử hoạt tính mẫu đối chứng 46 Hình 12: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi chiết 48 Hình 13: TLC Khổ qua chiết dung môi khác 48 CHCl3_MeOH (9:1) Hình 14: TLC số mẫu thí nghiệm loại tạp chất 49 Hình 15: Các hoạt chất phân lập từ trái Khổ qua 54 Hình 16: So sánh khả chiết xuất triterpen dung môi:EtOH 95%, EtOH 50%, BuOH H2O TLC hệ CHCl3_MeOH_H2O(8:2:0.3) 54 Hình 17: Kết kiểm tra trình loại tạp để nâng cao hàm lượng triterpen TLC với hệ CHCl3_MeOH_H2O(8:2:0.3) 55 Hình 18: Hệ thống chiết xuất, cô đặc chân không hệ thống sấy phun 57 Báo cáo nghiệm thu DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ : Vai trò α-glucosidase trình hình thành glucose 30 Sơ đồ : Sơ đồ điều chế cao chiết 32 Sơ đồ : Sơ đồ phân lập hợp chất từ trái Khổ qua 39 Sơ đồ 4: Qui trình chiết xuất tinh chế charantin 52 Sơ đồ 5: Quy trình điều chế triterpen đắng từ trái Khổ qua 56 Báo cáo nghiệm thu DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ gốc B.W Body weight COSY Correlation Spectroscopy Nghĩa tiếng Việt Trọng lượng thể Phổ COSY d dd Doublet (NMR) Double doublet (NMR) Mũi chẻ đôi Mũi chẻ đôi hai lần DEPT DMSO Distortionless Enhancement Polarization Transfer Dimethyl sulfoxide EP EtOAc Ether petroleum Ethyl acetate EtOH, Et glc HMBC Ethanol Glucose Heteronuclear Correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography Heteronuclear Single Quantum Correlation 50% Inhibition Concentration Infrared Coupling constant Multiplet Methanol Melting point Mass Spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance p-nitrophenol p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside Parts per million Reversed Phase Singlet (NMR) Thin Layer Chromatography α-glucosidase Chemical shift HSQC IC50 IR J m MeOH, Me mp MS NMR PNP PNP-Glc ppm RP s TLC α-Glc δ by Phổ DEPT Dung môi DMSO Dung môi ête dầu hỏa Dung môi Ethyl acetat Dung môi Ethanol Đường Glucose Bond Phổ HMBC Multiple Sắc ký lỏng hiệu cao Phổ HSQC Nồng độ ức chế 50% Phổ hồng ngoại Hằng số ghép cặp Mũi đa Dung mơi Methanol Điểm nóng chảy Khối phổ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phần triệu Pha đão Mũi đơn Sắc ký mỏng Độ dịch chuyển hóa học Báo cáo nghiệm thu I ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA I.1 Mô tả Khổ qua Tên khoa học: Momordica charantia L Họ: Bầu bí (Cucurbitaceae) Tên nước ngoài: Bitter melon, bitter gourd (Anh), bitter apple, wild cucumber, bitter cucumber, ampalaya (Philipines), balsam pear (Mỹ), karela (Ấn Độ)… Tên Việt Nam: Khổ qua, Mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi… [13,14] Ngồi cịn có nhiều tên khác mướp mủ, chua hao (Mường - Thanh Hóa), dưa mát, hồng nương, hồng dương, bồ đạt, lại qua [4] Cây Khổ qua thuộc loại dây leo, có đời sống khoảng năm Đường kính dây khoảng 5-10mm, dây bị dài 5-7m, thân màu xanh nhạt có góc cạnh, leo nhờ có nhiều tua cuốn, có lơng tơ [13] Lá đơn, nhám, mọc so le, dài 5-10cm, rộng 4-8cm, phiến mỏng chia làm 5-7 thùy hình trứng, mép có cưa đều, mặt màu xanh nhạt mặt lá, gân rõ mặt dưới, phiến có lơng ngắn [12, 13] Hoa mọc đơn độc kẽ lá, hoa đực hoa gốc, có cuống dài Hoa đực có đài ống ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhị (nhụy) rời Hoa có đài tràng giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2cm [3, 12] Trái hình thoi, dài 8-15cm, gốc đầu thn nhọn Mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ khơng Trái chưa chín có màu xanh xanh vàng nhạt, chín có màu vàng hồng Vì Trung Quốc, Khổ qua cịn có tên hồng dương, hồng nương [5, 10] Khi chín, trái nứt dần từ đầu, tách làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên [13, 14] Hạt dẹt, dài 13-15mm, rộng 7-8mm, hình ngựa, thắt đột ngột hai đầu Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ màng hạt gấc Báo cáo nghiệm thu Hình 1: Cây Khổ qua Hình 2: Var charantia L Hình 3: Var abbreviata Ser Hình 4: Hạt Khổ qua I.2 Phân bố sinh thái [3, 30, 41] Khổ qua phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới khắp châu lục Từ thời xa xưa, Khổ qua trồng lần Đông Ấn Nam Trung Quốc, sử dụng loại rau ăn giàu chất sắt vitamin C Sau du nhập sang châu Phi châu Mỹ Latinh Quần thể Khổ qua trồng trở nên phong phú với giống đa dạng tạo trình chọn giống lai tạo Báo cáo nghiệm thu Bảng 11: Nồng độ đường huyết nhóm chuột uống MCA 600 mg/kg phút thứ 30 n Nồng độ tăng đường huyết (mg/dL) Tween 2% 119,136 ± 8,458 Acarbose 10 mg/kg 10 62,719 ± 7,587 (**) MCA 600 mg/kg 10 105,752 ±8,100 MCA 600 mg/kg trước 30 phút 10 105,495 ±9,016 MCA 1000 mg/kg trước 30 phút 10 86,811± 8,701(*) Nhóm (*) P