II.1.Điều chế các cao chiết
Mục tiêu:
- Nhĩm các nhĩm hợp chất theo độ phân cực của dung mơi
- Tạo các mẫu cao chiết từ khổ qua để sàng lọc hoạt tính ức chế α- glucosidase.
Sơ đồ điều chế các cao chiết:
Sơ đồ 2:Sơ đồ điều chế các cao chiết
BỘT TRÁI
Cao T1
Chiết lắc với EP, lọc, loại dung mơi
Phần khơng
tan trong nước
Cao T2
Chiết lắc với CHCl3, lọc, loại dung mơi
Cao T3
Chiết lắc với BuOH, lọc, loại dung mơi
Cao MC08
Chiết hoàn lưu nĩng với EtOH 95 % lọc, loại dung mơi
BÃCao T 50 Cao T 50
Cao T4
Hịa tan bằng nước cất, lọc, loại dung mơi Chiết hoàn lưu nĩng với
EtOH 50 % lọc, loại dung mơi
II.2. Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao chiết
II.2.1. Nguyên tắc
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside α-glucosidase α-D-glucopyranoside +p-nitrophenol
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside (PNP). Vì vậy, cĩ thểđođộ hấp thu của PNP ở bước sĩng 400nm để
xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu cĩ ức
chế và mẫu khơng ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế
và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50
Điều kiện phản ứng: T = 370
C, pH 6,8, nồng độ enzyme α-Glc 0,031U/ml, nồng
độ chất nền PNP-Glc 0,085mM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
II.2.2. Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị các dung dịch thử chuẩn (enzyme, chất nền, các dung dịch đệm, chất
ức chế)
Trộn lẫn các dung dịch gồm: đệm pH = 6,8, enzyme, chất ức chế với thể tích đãđịnh trước
Hoạt hĩa hỗn hợp ở 370
C trong thời gian 30 phút
Thêm chất nền, duy trì phản ứng ở 370
C, trong thời gian 20 phút
Kết thúc phản ứng bằng đệm pH = 9,6
Đo độ hấp thu A ở λ = 400nm, dựa vào đường chuẩn để xác định lượng
glucose sinh ra, từ đĩ xác định % ức chế (% I) và suy ra chỉ số IC50
Cơng thức tính % ức chế: % I = [ ] [ ] 100 [ ] o i o A A x A Trongđĩ:
[A]0:Độ hấp thu trung bình khi khơng sử dụng chất ức chế
[A]i:Độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i
Chỉ số IC50 được ngoại suy từ phương trình đường biểu diễn giữa % I và nồng độ
II.2.3. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị các mẫu ức chế cĩ nồng độ 2,95mg/ml tương ứng với nồng độ
100μg/ml trong hỗn hợp phản ứng. Pha loãng để cĩ các nồng độ 75, 50, 25, 5 μg/ml. Thực hiện đối với mỗi nồng độ (Ci) của từng mẫu thử theo bảng sau:
Bảng 1: Cơng thức của một mẫu thử hoạt tính
THỂ TÍCH (ml) TÁC CHẤT
Trắng mẫu Mẫu ức chế Mẫu khơng ức chế
Nước khử ion 0,2 0 0,2
Đệm phosphate 5,0 5,0 5,0
Enzyme 0 0,2 0,2
Chất ức chế cĩ nồng độ Ci 0,2 0,2 0
Ủ ở 370
C trong 30 phút, sauđĩ thêm
PNP-Glc 0,5 0,5 0,5
Lắc đều, ủ ở 370
C trong 20 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 2ml mỗi hỗn hợp cho vàoống nghiệm cĩ sẵn 8ml đệm pH = 9,6, lắc đều Đođộ hấp thu ở 400nm, tính kết quả
II.2.4. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase
a. Cao T1
Bảng 2: Kết quả đo độ hấp thu và tính % I của T1
Độ hấp thu A Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Atb % I 0 0,285 0,277 0,286 0,283 ± 0,004 0,00 5 0,283 0,272 0,313 0,289 ± 0,016 -2,36 25 0,269 0,279 0,288 0,279 ± 0,006 1,42 50 0,275 0,285 0,309 0,290 ± 0,013 -2,48 75 0,275 0,282 0,292 0,283 ± 0,006 -0,12
-250 0 25 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 [m g/l] %I
Hình 5: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T1
Nhận xét:
Dựa vào kết quả % ức chế ở các nồng độ, kết luận cao T1 khơng thể hiện hoạt
tínhức chế men α-glucosidase.
b.Cao T2
Bảng 3: Kết quả đo độ hấp thu và tính % I của T2
Độ hấp thu A Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Atb % I 0 0,358 0,343 0,328 0,343 ± 0,010 0,00 5 0,324 0,343 0,303 0,323 ± 0,014 5,73 25 0,303 0,298 0,327 0,309 ± 0,012 9,82 50 0,243 0,293 0,292 0,276 ± 0,022 19,53 75 0,226 0,297 0,268 0,264 ± 0,025 23,13 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120[mg/l] %I
Nhận xét:
Phương trìnhđường chuẩn của cao T2 cĩ dạng nhưsau: y = 10-5x3 - 0,0039x2 + 0,5455x
R2 = 0,9659
Từ đĩ, suy ra giá trị IC50của cao T2 là:IC50= 252,35μg/ml.
c. Cao T3
Bảng 4: Kết quả đo độ hấp thu và tính %ức chế (% I) của T3
Độ hấp thu A Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Atb % I 0 0,285 0,277 0,286 0,283 ± 0,004 0,00 5 0,284 0,289 0,271 0,281 ± 0,007 0,47 25 0,271 0,279 0,280 0,277 ± 0,004 2,12 50 0,267 0,259 0,263 0,263 ± 0,003 6,96 75 0,253 0,256 0,254 0,254 ± 0,001 10,02 100 0,250 0,261 0,246 0,252 ± 0,006 10,73 0 10 20 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 [m g/l] %I
Hình 7: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T3
Nhận xét:
Phương trìnhđường chuẩn của cao T3 cĩ dạng nhưsau: y = 0,1187x
R2 = 0,9626
d. Cao T4
Bảng 5: Kết quả đo độ hấp thu và tính %ức chế (% I) của T4
Độ hấp thu A Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Atb % I 0 0,298 0,303 0,301 0,301 ± 0,002 0,00 5 0,299 0,295 0,313 0,302 ± 0,007 -0,55 25 0,289 0,293 0,297 0,293 ± 0,003 2,55 50 0,304 0,285 0,305 0,298 ± 0,009 0,89 75 0,288 0,292 0,294 0,291 ± 0,002 3,10 -5.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 [m g/l] %I
Hình 8: Đường biểu diễn % I theo nồng độ cao T4
Nhận xét:
Phương trìnhđường chuẩn của cao T4cĩ dạng nhưsau: y = 0,0384x + 0,0061 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
R2 = 0,5825
Từ đĩ, suy ra giá trị IC50của cao T4là: IC50=1301,9 μg/ml
II.2.5. Kết luận
- Cao chiết bằng EP từ trái Khổ qua (T1) khơng thể hiện hoạt tính ức chế men - glucosidase.
- Các cao chiết bằng CHCl3(T2) và BuOH (T3) từ trái Khổ qua cĩ hoạt tính ức
chế men -glucosidase yếu với chỉ số IC50lấn lượt là 252,35μg/ml và 421,23μg/ml.
- Các chất cịn lại trong cao T4 khơng thể hiện hoạt tính ức chế men - glucosidase.
Từ kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase in vitro của các cao chiết,
chúng tơi khảo sát sơbộ thành phần hĩa học bằng sắc ký lớp mỏng.
Hình 9:TLC của cao T, T50, TW, T1, T2, T3, T4
trên hệ dung mơi CHCl3-MeOH-H2O (8:2:0,3 v/v)
Nhận xét: Các hợp chất cĩ chỉ số Rf từ 0,05 đến 0,65 cĩ sự liên hệ với hoạt tính ức chế men -glucosidase.