Nghiên cứu chuyển gen GA20 mã hóa enzyme ga20 oxidase dưới sự điều khiển của promoter cad4 biểu hiện đặc hiệu ở xylem vào cây xoan ta ( melia azedarach l)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GA20 MÃ HÓA ENZYME G A20-OXIDASE DƢỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CAD4 BIỂU HIỆN ĐẶC HIỆU Ở XYLEM VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GA20 MÃ HÓA ENZYME G A20-OXIDASE DƢỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CAD4 BIỂU HIỆN ĐẶC HIỆU Ở XYLEM VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Văn Sơn PGS.TS Nguyễn Trung Thành Hà Nội – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Lê Văn Sơn PGS.TS Nguyễn Trung Thành Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức Luận văn có sử dụng thơng tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Nguyễn Hồng Nhung LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài, ln nhận dạy dỗ, bảo tận tình thầy, cô giáo quan tâm, động viên từ gia đình bạn bè Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Sơn – phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Nguyễn Trung Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Xin cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Nghiên cứu chọn tạo đánh giá dòng Xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh có triển vọng” TS Nguyễn Văn Phong - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp - chủ nhiệm hỗ trợ phương diện để thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Bích Ngọc –phịng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học, ThS Bùi Phƣơng Thảo cán bộ, sinh viên phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học ln ln quan tâm, đóng góp lời khuyên, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ mặt suốt thời gian qua Học viên Nguyễn Hồng Nhung MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Xoan ta 1.2 Chất điều tiết sinh trƣởng gibberellin (GA) vai trò GA20oxidase trình tổng hợp GA dạng hoạt động 1.2.1 Giới thiệu chung GA đƣờng sinh tổng hợp GA dạng hoạt động 1.2.2 Vai trị GA20-oxidase q trình sinh tổng hợp GA 1.3 Giới thiệu chung promoter đặc hiệu promoter đặc hiệu xylem CAD4 1.3.1 Promoter đặc hiệu 1.3.2 Promoter đặc hiệu xylem CAD4 10 1.4 Tình hình nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta 14 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu thực vật 16 2.1.2 Chủng vi khuẩn vector 16 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 16 2.1.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 i 2.2.1 Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen mang gen GA20 dƣới điều khiển promoter CAD4 17 2.2.2 Phƣơng pháp tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen CAD4::GA20 20 2.2.3 Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 22 2.2.4 Phƣơng pháp chuyển gen vào Xoan ta thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23 2.2.5 Phƣơng pháp phân tích đánh giá chuyển gen 26 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang gen GA20 dƣới điều khiển promoter CAD4 29 3.2 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20 32 3.2.1 Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào thuốc 32 3.2.2 Kết kiểm tra dòng thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 phản ứng PCR 35 3.3 Tạo Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20 38 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào Xoan ta 38 3.3.2 Kiểm tra dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 phản ứng PCR 40 3.3.3 Đánh giá biểu gen CAD4::GA20 mức độ dịch mã kỹ thuật ELISA gián tiếp 42 3.3.4 Đánh giá sơ tiêu sinh lý dòng xoan chuyển gen CAD4::GA20 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Xoan ta (Melia azedarach L.) Hình 1.2: Con đƣờng sinh tổng hợp GA [64] Hình 1.3: Mức độ biểu CAD4 mô quan khác [41] 12 Hình 3.1: Kết điện di sản phẩm cắt vector pBI101/CAD4::gus pBT/GA20 enzyme SmaI SacI 29 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc dòng khuẩn E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 30 Hình 3.3: Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 enzyme giới hạn SacI SmaI 31 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc dòng 32 Hình 3.5: Hình ảnh thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 đối chứng WT môi trƣờng tái sinh chồi chọn lọc 34 Hình 3.6: Hình ảnh thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20(A) đối chứng (B) môi trƣờng rễ chọn lọc 35 Hình 3.7: Kết kiểm tra dòng thuốc chuyển gen CAD4::GA20 phản ứng PCR nhân đoạn gen GA20 35 Hình 3.8: Kết đánh giá biểu GA20-oxidase dòng thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 kỹ thuật ELISA gián tiếp 37 Hình 3.9: Hình ảnh thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 (A) đối chứng WT (B) sau tuần nuôi điều kiện nhà lƣới 38 Hình 3.10: Hình ảnh Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 đối chứng môi trƣờng chọn lọc 40 Hình 3.11: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ Xoan ta đối chứng (WT) chuyển gen CAD4::GA20 41 Hình 3.12: Kết kiểm tra dịng xoan ta chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen GA20 42 Hình 3.13: Kết đánh giá biểu GA20-oxidase dòng xoan ta chuyển cấu trúc CAD4:: GA20 kỹ thuật ELISA gián tiếp 43 Hình 3.14: Kết so sánh chiều dài thân dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 đối chứng tháng trồng nhà lƣới 44 Hình 3.15: Ảnh hƣởng GA20 đến đƣờng kính khối lƣợng thân 46 Hình 3.16: Hình thái Xoan chuyển cấu trúc CAD4::GA20 đối chứng không chuyển gen (sau tháng trồng nhà lƣới) 48 Hình 3.17: Hình ảnh tiêu cắt lát ngang thân (vùng xylem) Xoan ta sinh trƣởng tháng 49 iii Hình 3.18: Kết ảnh hƣởng CAD4::GA20 đến hình thành xylem thứ cấp (gỗ) 50 Hình 3.19: Sơ đồ cấu tạo hệ mạch dẫn thân gỗ [36] 51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt vector chuyển gen pBI101/CAD4::gus pBT/GA20 enzyme giới hạn 18 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng ghép nối gen GA20 vào vector 18 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp 19 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng colony - PCR 21 Bảng 2.5: Môi trƣờng nuôi chọn lọc thuốc chuyển gen 22 Bảng 2.6: Môi trƣờng sử dụng chuyển gen vào Xoan ta 24 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển chuyển gen 26 Bảng 3.1: Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào thuốc lá…… .……….33 Bảng 3.2: Kết chuyển gen CAD4::GA20 vào Xoan ta 39 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng cấu trúc CAD4::GA20 đến hình thái Xoan ta 47 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens bp Base pair CAD Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GA Gibberellin GA20 Gen mã hóa cho GA20-oxidase P.trichocarpa Populus trichocarpa PCR Polymerase Chain Reaction v/p vòng/phút vi Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Hình 3.18: Kết ảnh hƣởng CAD4::GA20 đến hình thành xylem thứ cấp (gỗ) Ghi chú: WT: Dịng đối chứng khơng chuyển gen; CAD4-GA20 4-18: Dịng chuyển gen CAD4::GA20 4-18 tương ứng Sự sinh trƣởng thứ cấp thân nhờ vào chức hình thành xylem thứ cấp bên phloem thứ cấp bên tầng phát sinh gỗ Quá trình bao gồm bốn bƣớc phân chia tế bào, kéo dài, tăng độ dày thành tế bào chết theo chƣơng trình [23] Tầng sinh gỗ mơ phân sinh bên phát triển phần trƣởng thành cây, phát sinh phloem thứ cấp bên xylem thứ cấp 50 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 (gỗ) bên [35-37; 41] Trong trình hình thành gỗ, vùng phát sinh, mở rộng trƣởng thành đƣợc phân bố thành vùng riêng biệt (Hình 3.20) [36] Hình ảnh nhuộm lát cắt ngang thân dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 cho thấy vùng xylem mở rộng hẳn so với dịng khơng chuyển gen Chúng tơi cho mở rộng vùng xylem có liên quan trực tiếp đến điều khiển biểu GA20 đặc hiệu vùng xylem c promoter CAD4 Cụ thể, đƣờng kính vịng thân c dịng chuyển gen khơng khác biệt rõ rệt so với khơng chuyển gen (Hình 3.14), kích thƣớc vùng xylem tất dịng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 lớn so với dịng đối chứng Dịng chuyển gen 11 có độ rộng vùng xylem tăng gấp 2,31 2,52 lần so với dịng đối chứng WT khơng chuyển gen Kích thƣớc vùng xylem tăng lên tỷ lệ thuận với gia tăng phân chia tế bào biệt hóa xylem (có liên quan đến hình thành xylem thứ cấp) Điều thể qua số lƣợng tế bào xylem tăng lên dòng chuyển gen, số lƣợng tế bào xylem dòng chuyển gen 11 lần lƣợt gấp 2,17 2,70 lần số lƣợng tế bào xylem đối chứng Hình 19: Sơ đồ cấu tạo hệ mạch dẫn thân gỗ [36] GA có vai trị quan trọng q trình biệt hóa xylem ảnh hƣởng đến phát triển xylem thứ cấp [49] Auxin (IAA) GA có tác dụng tƣơng hỗ q trình biệt hóa xylem, tỷ lệ IAA/GA thấp, phloem đƣợc gia tăng 51 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 tổng hợp [36] Sự biểu GA20 cách mức dẫn đến thay đổi tỷ lệ IAA/GA khiến cho trình tổng hợp xylem mô phân sinh gỗ bị ức chế Tuy nhiên, nghiên cứu chúng tôi, GA20 đƣợc biểu đặc hiệu xylem nên tránh đƣợc tình trạng này, chứng dịng chuyển gen có tăng cƣờng tổng hợp xylem thể số lƣợng tế bào xylem tăng lên Từ kết gia tăng kích thƣớc vùng xylem tăng cƣờng hoạt động tổng hợp xylem tầng sinh gỗ thể qua tăng lên số lƣợng tế bào xylem nghiên cứu chúng tơi chứng minh vai trị thiết yếu GA hình thành phát triển xylem 52 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công vector chuyển gen GA20 (gắn đuôi c-myc) dƣới điều khiển promoter CAD4 biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58 Tạo đƣợc 38 dòng Xoan ta chuyển cấu trúc CAD4::GA20 xác nhận phản ứng PCR phân tích ELISA Các dịng Xoan ta chuyển gen có chiều dài tăng từ 1,44 – 3,32 lần, khối lƣợng thân tăng từ 1,55 - 2,67, độ rộng vùng xylem tăng gấp 1,15 – 2,52 lần, số lƣợng tế bào xylem gấp 1,14 - 2,70 lần so với đối chứng WT 53 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 KIẾN NGHỊ Tiếp tục phân tích, đánh giá tốc độ sinh trƣởng khả tạo sinh khối gỗ dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 mức độ cao Sử dụng cấu trúc vector chuyển gen mang gen GA20 để chuyển vào số lồi trồng lâm nghiệp khác nhằm tạo dịng sinh trƣởng nhanh đem lại hiệu kinh tế 54 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực Vật rừng, NXB Nông nghiệp Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà (2011), ―Nghiên cứu chuyển gen mã hóa gibberellin 20-oxidase vào Xoan ta (Melia azedarach L.) Agrobacterium tumefaciens‖, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (2): 217-222 Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007), ―Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta (Melia azedarach L.) phục vụ cho chuyển gen‖, NXB KH&KT, Hội nghị Khoa học toàn quốc Nghiên cứu khoa học sống Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), ―Tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) sinh trƣởng nhanh kỹ thuật chuyển gen‖, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 11-14 Quyết định số 16/2005/QĐ-BNN việc ban hành ―Danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo vùng sinh thái lâm nghiệp‖ TÀI LIỆU TIẾNG ANH Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., Diloreto D S., Yellanki P., Carlson J E.(2009), ―The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and expression‖, BMC PlantBiology, 9(1), 26 Barros J., Serk H., Granlund I., Pesquet E (2015), ―The cell biology of lignification in higher plants‖, Annals of Botany, 115(7), 1053–1074 Biemelt, S (2004), ―Impact of Altered Gibberellin Metabolism on Biomass Accumulation, Lignin Biosynthesis, and Photosynthesis in Transgenic Tobacco Plants‖, Plant Physiology, 135(1), 254–265 Burge C., Lopez M C., Baker H V., Mandel R J., Muzyczka N.(2008), ―Genome-wide analysis of aging and learning-related genes in the hippocampal dentate gyrus‖, Neurobiology of Learning and Memory, 89(4), 379–396 55 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 10 Cantón FR, Suarez MF, Jose-Estanyol M, Cánovas F (1999), ―Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts‖, Plant Molecular Biology 40: 623-634 11 Carrera E., Bou J., Garcia-Martínez, J L., Prat S.(2000),―Changes in GA 20oxidase gene expression strongly affect stem length, tuber induction and tuber yield of potato plants‖, Plant Journal, 22(3), 247–256 12 Chen Z., Wang J., Ye M X., Li H., Ji L X., Li Y., An X M (2013), ―A novel moderate constitutive promoter derived from poplar‖ International Journal of Molecular Sciences, 14(3), 6187–6204 13 Cheng H., Li L., Xu F., Cheng S., Cao F., Wang Y., Wu C (2013), ― Expression patterns of a cinnamyl alcohol dehydrogenase gene involved in lignin biosynthesis and environmental stress in Ginkgo biloba”, Molecular Biology Reports, 40(1), 707–721 14 Collins Graham G., Symons Robert H (1993), ―Polymorphisms in Grapevine DNA detected by the RAPD PCR technique‖, Plant molecular biology reporter, 11(2) 15 Dayan J (2016), Gibberellin transport Annual Plant Reviews,49(49), 95–120 16 Diaga Diouf, 2003 ― Genetic transformation of forest trees‖, African Journal of Biotechnology 2(10), 328-333 17 Do P T., De Tar, J R., Lee, H., Folta, M K., Zhang, Z J (2016 ), ―Expression of ZmGA20ox cDNA alters plant morphology and increases biomass production of switchgrass (Panicum virgatum L.)‖, Plant Biotechnology Journal, 14(7), 1532– 1540 18 Dutt M., Dhekne, Soriano L., Kandel R., Grosser J W.(2014 ), ―Temporal and spatial control of gene expression in horticultural crops‖, Horticulture Research, 1(August) 19 Eom H., Kim H., Hyun K.(2016), ―The cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) gene family in flax (Linum usitatissimum L.): Insight from expression profiling of cads induced by elicitors in cultured flax cells‖, Archives of Biological Sciences, 68(3), 603–612 56 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 20 Eriksson, M E., Israelsson, M Olsson, Moritz T.(2000), ―Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length‖, Nature Biotechnology, 18(7), 784–788 21 FAO (2010), Forest and genetically modified trees 22 Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., Grima-Pettenati J (1995), ―Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants‖, Plant Molecular Biology, 27(4), 651–667 23 Fukuda H.(1996), ―Xylogenesis : Initiation , Progression , and Cell Death‖, 299– 325 24 Gallardo F., Fu J., Jing Z P., Kirby E G., Cánovas F M (2003), ―Genetic modification of amino acid metabolism in woody plants‖, Plant Physiology Biochemistry, 41: 587–594 25 Goellner M (2001), ―Endo-beta-1, 4-Glucanase Expression in Compatible Plant Nematode Interactions‖, The Plant Cell Online, 13(10), 2241–2255 26 Gomi K., Matsuoka M (2003), ―Gibberellin signalling pathway‖, Current opinion in plant biology, 6(5), 489-493 27 Gustavo A., Cabrera J (1998), ―The Agrobacterim tumefaciens gene transfer to plant cell Molecular Microbiology”, 26, 1-14 28 Hai L., Qingyin Z., Yan Ling Z., Sha sheng W., Xiangning J., 2003 ―Xylemspecific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco‖, Plant Growth Regulation, 41(3), 279 - 286 29 Hedden P., Kamiya Y.(1997), ―Gibberellin biosynthesis: Enzymes, Genes and Their Regulation‖, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 48, 31–460 30 Hedden P., Thomas S G.(2012), ―Gibberellin biosynthesis and its regulation Biochemical Journal‖, 444(1), 11–25 31 Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T.(1994) ―Efficient transformation of rice (Oriza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA‖, The Plant Journal, 6, 271-282 32 Hu F., Zhang L., Wang X., Ding J.,Wu D (2005), ―Agrobacterium- mediated transformed transgenic triploid bermudagrass (Cynodon dactylon x C 57 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 transvaalensis) plants are highly resistant to the glufosinate herbicide Liberty‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83(1), 13–19 33 Huang R C., Tadera K., Yagi F., Minami Y., Okamura H., Iwagawa T., Nakatani M (1996) ―Limonoids from Melia azedarach”, Phytochemistry, 43, 581-583 34 Israelsson M (2004), ― Gibberellin Homeostasis and Biosynthesis in Relation to Shoot Growth in Hybrid Aspen‖, Forest Genetics 35 Israelsson M., Mellerowicz E., Chono M., Gullberg J., Moritz T (2004), ―Cloning and overproduction of gibberellin 3-oxidase in hybrid aspen trees Effects on gibberellin homeostasis and development‖, Plant Physiology, 135(1), 221–230 36 Israelsson M., Sundberg B., Moritz T.(2005), ―Tissue-specific localization of gibberellins and expression of gibberellin-biosynthetic and signaling genes in wood-forming tissues in aspen‖, Plant Journal, 44(3), 494–504 37 Jeon H W., Cho J S., Park E J., Han K H., Choi Y I., Ko J H (2016), ―Developing xylem-preferential expression of PdGA201, a gibberellin 20oxidase from Pinus densiflora, improves woody biomass production in a hybrid poplar‖, Plant Biotechnology Journal, 14(4), 1161–1170 38 Ko J H., Kim H T., Hwang I., Han K H.(2012),― Tissue-type-specific transcriptome analysis identifies developing xylem-specific promoters in poplar‖, Plant Biotechnology Journal, 10(5), 587–596 39 Lapierre C., Pollet B., Petit-Conil M., Toval G., Romero J., Pilate G., Jouanin L (1999), ―Structural alterations of lignins in transgenic poplars with depressed Cinnamyl alcohol dehydrogenase or caffeic acid o- methyltransferase activity have an opposite impact on the efficiency of industrial kraft pulping‖, Plant Physiology, 119(1), 153–164 40 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos-Thevenot P., GrimaPettenat J (2002), ―The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species‖, Plant Molecular Biology, 50(3), 497–509 58 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 41 Le Thi Van Anh, T D E (2015), Characterization of poplar metal transporters to improve rehabilitation of metal polluted soils, Institut des Sciences du Végétal 42 Ma Q H (2010), ―Functional analysis of a cinnamyl alcohol dehydrogenase involved in lignin biosynthesis in wheat‖, Journal of Experimental Botany, 61(10), 2735–2744 43 Mansell R L., Gross G G., Stöckigt J., Franke H., Zenk M H (1974), ―Purification and properties of cinnamyl alcohol dehydrogenase from higher plants involved in lignin biosynthesis‖, Phytochemistry, 13(11), 2427–2435 44 Marroni F., Pinosio S., Zaina G., Fogolari F., Felice N., Cattonaro F., Morgante M (2011), ―Nucleotide diversity and linkage disequilibrium in Populus nigra cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD4) gene‖, Tree Genetics and Genomes, 7(5), 1011–1023 45 Ngo Van Thanh, Jiang Xiangning, Ha Van Huan, Nguyen Thi Hau, Ho Van Giang (2010), ―Vector construction and transformation of 4CL gene into Chinaberrytree (Melia azedarach L.)‖, Journal of Science, 26, 205-210 46 Nirsatmanto A., Gyokusen K.(2007), ―Genetic transformation of Melia azedarach L., using Agrobacterium mediated transformation‖, Journal of Forestry Research 4, 1-8 47 Niu S., Li Z., Yuan H., Fang P., Chen X., Li W (2013 ), ―Proper gibberellin localization in vascular tissue is required to regulate adventitious root development in tobacco‖, Journal of Experimental Botany, 64(11), 3411–3424 48 Nugroho W D., Yamagishi Y., Nakaba S., Fukuhara S., Begum S., Marsoem S N, Funada R (2012), ―Gibberellin is required for the formation of tension wood and stem gravitropism in Acacia mangium seedlings‖, Annals of Botany, 110(4), 887–895 49 Olszewski N., Sun T P., Gubler F (2002), ―Gibberellin signaling: biosynthesis, catabolism, and response pathways‖, The Plant Cell, 14 Supplement, 61–80 50 Phillips L., Ward D., Uknes S., Appleford N E., Lange T., Huttl A K., Hedden P (1995), ― Isolation and expression of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones from Arabidopsis‖, Plant Physiology, 108(3), 1049–1057 59 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 51 Ruzika K., Ursache R., Helariutta Y (2015), ―Xylem development - from the cradle to the grave‖, New Phytologist, 207(3), 519–535 52 Ragni L., Nieminen K., Pacheco-Villalobos D., Sibout R., Schwechheimer C., Hardtke C S.(2011),―Mobile gibberellin directly stimulates Arabidopsis hypocotyl xylem expansion‖, The Plant Cell, 23(4), 1322–36 53 Regnault T., Davière J M., Achard P.(2016), ―Long-distance transport of endogenous gibberellins in Arabidopsis”, Plant Signaling & Behavior, 11(1) 54 Roberts K., McCann M C (2000), ―Xylogenesis: The birth of a corpse‖, Current Opinion in Plant Biology, 3(6), 517–522 55 Shi R., Sun Y H., Li Q., Heber S., Sederoff R.,Chiang V L (2010 ), ― Towards a systems approach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa: Transcript abundance and specificity of the monolignol biosynthetic genes ‖, Plant and Cell Physiology, 51(1), 144–163 56 Tang W., Tang A Y (2014), ―Transgenic woody plants for biofuel‖, Journal of Forestry Research, 25(2), 225–236 57 Tanimoto E (2005), ―Regulation of Root Growth by Plant Hormones—Roles for Auxin and Gibberellin‖, Critical Reviews in Plant Sciences, 24(4), 249–265 58 Tobias C M., Chow E K (2005), ―Structure of the cinnamyl-alcohol dehydrogenase gene family in rice and promoter activity of a member associated with lignification‖, Planta, 220(5), 678–688 59 Topping J (1998), ―Tobacco Transformation‖, Plant Virology Protocols, 4(81), 365-372 60 Tzfira T., Citovsky V (2008), Agrobacterium From Biology to Biotechnology, Developmental Biology 61 Van Doorsselaere J., Baucher M., Feuillet C., Boudet A M (1995), ―Isolation of cinnamyl alcohol dehydrogenase cDNAs from two important economic species: alfalfa and poplar Demonstration of a high homology of the gene within angiosperms‖, Plant Physiology and Biochemistry, 33(1), 105–109 62 Wagner A., Tobimatsu Y., Phillips L (2015), ―Syringyl lignin production in conifers: Proof of concept in a Pine tracheary element system‖, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 112(19), 6218–23 60 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 63 Xu Y L., Li L., Wu K., Peeters, A J., Gage, D A., Zeevaart J A (1995), ―The GA5 locus of Arabidopsis thaliana encodes a multifunctional gibberellin 20oxidase: molecular cloning and functional expression‖, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92(14), 6640–4 64 Yamaguchi S (2008), ―Gibberellin Metabolism and its Regulation‖, Annual Review of Plant Biology, 59(1), 225–251 65 Yamaguchi S., Kamiya Y (2000), ―Gibberellin Biosynthesis: Its Regulation by Endogenous and Environmental Signals‖, Plant Cell Physiol, 41(3), 251–257 66 Yaxley J R (2001),―Gibberellin Biosynthesis Mutations and Root Development in Pea‖, Plant Physiology, 125(2), 627–633 67 Zhong P J., Gallardo F., Pascual M B., Sampalo R., Romero J., Navarra A T., Cánovas F M (2004), ―Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase‖, New Phytologist, 164: 137–145 68 http://vafs.gov.vn 61 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 PHỤ LỤC Hình 1: Cấu trúc vector chuyển gen pBI101/CAD4::GUS 62 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Hình 2: Cấu trúc vector chuyển gen pBI101/CAD4::GA20 63 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Trình tự gen GA20-cmyc đƣợc phân tích BioEdit 7.0 Lasergen (DNAstarinc., Madison, WI, USA): CCCGGGATGGCCGTAAGTTTCGTAACAACATCTCCTGAGGAAGA AGACAAACCGAAGCTAGGCCTTGGAAATATTCAAACTCCGTTAA TCTTCAACCCTTCAATGCTTAACCTTCAAGCCAATATCCCAAACC AATTCATCTGGCCTGACGACGAAAAACCTTCCATCAACGTTCTCG AGCTTGATGTTCCTCTCATCGACCTTCAAAACCTTCTCTCTGATC CATCCTCCACTTTAGATGCTTCGAGACTGATCTCTGAGGCCTGTA AGAAGCACGGTTTCTTCCTCGTGGTCAATCACGGCATCAGCGAG GAGCTTATTTCAGACGCTCATGAATACACGAGCCGCTTCTTTGAT ATGCCTCTCTCCGAAAAACAGAGGGTTCTTAGAAAATCCGGTGA GAGTGTTGGCTACGCAAGCAGTTTCACCGGACGCTTCTCCACCA AGCTTCCATGGAAGGAGACCCTTTCTTTCCGGTTTTGCGACGACA TGAGCCGCTCAAAATCCGTTCAAGATTACTTCTGCGATGCGTTGG GACATGGGTTTCAGCCATTTGGGAAGGTGTATCAAGAGTATTGT GAAGCAATGAGTTCTCTATCACTGAAGATCATGGAGCTTCTGGG GCTAAGTTTAGGCGTAAAACGGGACTACTTTAGAGAGTTTTTCG GAGAAAACGATTCAATAATGAGACTGAATTACTACCCTCCATGT ATAAAACCAGATCTCACACTAGGAACAGGACCTCATTGTGATCC AACATCTCTTACCATCCTTCACCAAGACCATGTTAATGGCCTTCA AGTCTTTGTGGAAAATCAATGGCGCTCCATTCGTCCCAACCCCAA GGCCTTTGTGGTCAATATCGGCGATACTTTCATGGCTCTATCGAA CGATAGATACAAGAGCTGCTTGCACCGGGCGGTGGTGAACAGCG AGAGCGAGAGGAAATCACTTGCATTCTTCTTGTGTCCGAAAAAA GACAGAGTAGTGACGCCACCGAGAGAGCTTTTGGACAGCATCAC ATCAAGAAGATACCCTGACTTCACATGGTCTATGTTCCTTGAGTT CACTCAGAAACATTATAGAGCAGACATGAACACTCTCCAAGCCT TTTCAGATTGGCTCACCAAACCCATCGAACAGAAACTCATCTCA GAAGAGGATCTGTGAGAGCTC 64 ... NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GA20 MÃ HÓA ENZYME G A20 -OXIDASE DƢỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CAD4 BIỂU HIỆN ĐẶC HIỆU Ở XYLEM VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành:... dƣới điều khiển promoter định 35S vào đối tƣợng thực vật Xuất phát từ sở trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen GA20 mã hóa enzyme GA20- oxidase dƣới điều khiển promoter CAD4 biểu đặc hiệu xylem. .. cho nghiên cứu chuyển gen, đặc biệt nghiên cứu chuyển gen GA20 nhằm tạo dòng chuyển gen sinh trƣởng nhanh Để đánh giá biểu gen GA20 dƣới điều khiển promoter CAD4 Xoan ta, lô biến nạp cấu trúc CAD4: :GA20