3.3. Tạo cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20
3.3.4. Đánh giá sơ bộ các chỉ tiêu sinh lý của các dòng xoan chuyển
Năm dòng xoan ta chuyển gen đã đƣợc kiểm tra ở mức độ phân tử và đối chứng được nhân nhanh, cho ra rễ và trồng trong điều kiện nhà lưới. Tiến hành đo
44
chiều cao thân cây sau mỗi tháng bắt đ ầu từ lúc chuyển cây ra bầu đất cho đến khi cây 3 tháng tuổi. Kết quả sinh trưởng của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng đƣợc thể hiện trong Hình 3.14.
Hình 3.14: Kết quả so sánh chiều dài thân c ủa các dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 và đối chứng trong 3 tháng trồng ở nhà lưới
Ghi chú: WT: Dòng đối chứng không chuyển gen; CAD4-GA20 4-18: Dòng chuyển gen CAD4::GA20 4-18 tương ứng
Sau 3 tháng trồng trong nhà lưới, cả 5 dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên đều cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen. Đáng chú ý, hai dòng chuyển gen 4 và 11 cho kết quả chiều dài thân lớn nhất, tương ứng gấp 3,32 và 2,98 lần so với cây WT. Tốc độ tăng trưởng trung bình c ủa 2 dòng chuyển gen 4 và 11 lần lƣợt là 0,295 cm/ngày và 0,252 cm/ngày so với cây đối chứng là 0,058 cm/ngày. Dòng chuyển gen 18 cho thấy sự kéo dài thân ít nhất, chiều dài thân trung bình sau 3 tháng của cây Xoan ta thuộc dòng này chỉ gấp 1,44 lần so với cây đối chứng, với tốc độ tăng trưởng là 0,111 cm/ngày.
45
Để đánh giá ảnh hưởng của GA20 đến sự gia tăng sinh khối gỗ, chúng tôi cân trọng lượng tươi c ủa toàn bộ phần thân và đo đường kính vòng thân (phần cách mặt đất 5cm) của các dòng Xoan chuyển gen và đối chứng. Kết quả đƣợc thể hiện trong Hình 3.15.
Kết quả về trọng lƣợng thân cho thấy sự gia tăng đáng kể sinh khối thân của các dòng Xoan ta chuyển gen so với mẫu đối chứng, gấp từ 1,55 (dòng 18) đến 2,67 lần (dòng 4). Tuy nhiên, đường kính vòng thân của các cây chuyển gen GA20 không khác biệt nhiều so với cây WT.
Từ các kết quả trên, chúng tôi đƣa ra kết luận về mối liên quan trực tiếp giữa sự biểu hiện của GA20 và sự tăng trưởng thân. Cụ thể, khi tăng cường biểu hiện của GA20, cây chuyển gen có chiều dài và khối lƣợng thân tăng lên, kết quả này giống với các nghiên cứu đã công bố trước đây về chuyển gen GA20 vào các đối tượng thực vật khác nhau như khoai tây, thuốc lá, dương, cải dầu…
Israelsson và cộng sự (2000) khi nghiên cứu chuyển gen GA20 vào cây dương đã thu được kết quả tất cả các dòng chuyển gen đều có sự tăng trưởng sơ cấp và thứ cấp lớn hơn so với các dòng đối chứng không chuyển gen.
Carrera và cộng sự (2000) khi chuyển gen GA20 dưới sự điều khiển của promoter cơ định CaMV 35S vào khoai tây đã nhận thấy các dòng chuyển gen có thân dài hơn và chiều dài các đốt thân tăng lên. Chiều cao của cây khoai tây chuyển gen tăng cường biểu hiện GA20 tăng từ 40-70% so với cây không chuyển gen.
Jeon và cộng sự (2016) khi chuyển gen GA20 dưới sự điều khiển của cả promoter cơ định CaMV35S và promoter đặc hiệu xylem DX15 thu đƣợc kết quả là tất cả các dòng dương chuyển gen đều có thân dài hơn và khối lượng lớn hơn so với mẫu đối chứng, trong đó dòng chuyển gen có chiều dài thân cao gấp 2 lần, trọng lƣợng thân gấp 3 lần so với dòng đối chứng [37].
46
Hình 3.15: Ảnh hưởng của GA20 đến đường kính và khối lượng thân
Ghi chú: WT: Dòng đối chứng không chuyển gen; CAD4-GA20 4-18: Dòng chuyển gen CAD4::GA20 4-18 tương ứng
Về mặt hình thái, các cây Xoan ta mang gen chuyển đều có đốt thân và cuống lá dài hơn so với cây đối chứng (Bảng 3.3). Tuy nhiên, kích thước lá cây gần như không có sự khác biệt (Hình 3.16). Điều này chứng tỏ GA20 dưới sự điều khiển của promoter CAD4 chỉ biểu hiện đặc hiệu ở vùng xylem (có mặt ở đốt thân và cuống lá) nên không ảnh hưởng đến sự phát triển của lá. Đây chính là ƣu điểm khi sử dụng promoter đặc hiệu mô, đó là hạn chế sự biểu hiện quá mức của gen khi sử dụng promoter cơ định gây nên những tính trạng bất lợi cho cây.
47
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cấu trúc CAD4::GA20 đến hình thái của cây Xoan ta
Dòng Số đốt thân Chiều dài lóng thân (mm)
Chiều dài cuống lá (mm)
WT 11,00 ± 1,00 10,55 ± 0,94 87,38 ± 4,84
CAD4::GA20 4 16,67 ± 0.58 9,81 ± 0,42 163,51 ± 3,38 CAD4::GA20 11 14,00 ± 1,00 44,20 ± 1,42 170,58 ± 3,36 CAD4::GA20 12 12,67 ± 0,58 32,75 ± 1,05 184,27 ± 1,29 CAD4::GA20 13 11,33 ± 0,58 29,30 ± 0,27 139,37 ± 1,42 CAD4::GA20 18 11,33 ± 0,58 17,78 ± 0,40 91,62 ± 0,70
Jeon và cộng sự (2016) khi so sánh sự điều khiển biểu hiện GA20 của promoter cơ định CaMV35S và promoter đặc hiệu xylem DX15 trên đối tƣợng cây dương cũng đã thu được kết quả tương tự là promoter đặc hiệu xylem DX15 giúp hạn chế các tính trạng không mong muốn hơn so với dùng promoter cơ định 35S. Cụ thể, các dòng dương chuyển gen GA20 dưới sự điều khiển của promoter DX1 đều có kích thước lá lớn hơn nhiều so với các dòng chuyển gen dưới sự điều khiển của promoter 35S (dòng chuyển gen DX15::GA20 có kích thước lá giảm đi kho ảng 21%, dòng chuyển gen 35S::GA20 giảm kích thước lá đến 41% so với cây đối chứng) [37].
48
Hình 3.16: Hình thái cây Xoan chuyển cấu trúc CAD4::GA20 và cây đối chứng không chuyển gen (sau 3 tháng trồng ở nhà lưới)
Ghi chú: A: Cây đối chứng WT; B, C, D, E, F: Dòng CAD4::GA20 4, 13, 11, 12, 18 tương ứng (thanh bar đại diện cho 50 mm).
49
Để khẳng định lại sự biểu hiện đặc hiệu xylem của cấu trúc CAD4::GA20 cũng như đánh giá ảnh hưởng của GA20 đến sự hình thành gỗ, chúng tôi nghiên cứu cấu tạo mô thân của các dòng Xoan ta chuyển gen bằng phương pháp nhuộm tiêu bản. Lát cắt ngang thân ở đốt thứ 6 của các cây chuyển gen và cây đối chứng được nhuộm, quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh (Hình 3.17).
Hình 3.17: Hình ảnh tiêu bản cắt lát ngang thân (vùng xylem) của cây Xoan ta sinh trưởng trong 3 tháng
A: Lát cắt ngang thân cây Xoan ta đối chứng không chuyển gen; B-F: Lát cắt ngang thân cây Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 dòng 4, 11, 12, 13, 18 tương ứng (Thanh bar đại diện cho 10àm).
Kết quả đo kích thước vùng xylem và đếm số lượng tế bào xylem được thể hiện ở Hình 3.18.
50
Hình 3.18: Kết quả ảnh hưởng của CAD4::GA20 đến sự hình thành xylem thứ cấp (gỗ)
Ghi chú: WT: Dòng đối chứng không chuyển gen; CAD4-GA20 4-18: Dòng chuyển gen CAD4::GA20 4-18 tương ứng
Sự sinh trưởng thứ cấp của thân nhờ vào chức năng hình thành xylem thứ cấp bên trong và phloem thứ cấp bên ngoài của tầng phát sinh gỗ. Quá trình này bao gồm bốn bước chính là phân chia tế bào, kéo dài, tăng độ dày thành tế bào và chết theo chương trình [23]. Tầng sinh gỗ là mô phân sinh bên phát triển ở những phần trưởng thành của cây, phát sinh phloem thứ cấp bên ngoài và xylem thứ cấp
51
(gỗ) bên trong [35-37; 41]. Trong quá trình hình thành gỗ, các vùng phát sinh, mở rộng và trưởng thành được phân bố thành các vùng riêng biệt (Hình 3.20) [36].
Hình ảnh nhuộm lát cắt ngang thân dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 cho thấy vùng xylem mở rộng hơn hẳn so với dòng không chuyển gen. Chúng tôi cho rằng sự mở rộng vùng xylem này có liên quan trực tiếp đến sự điều khiển biểu hiện GA20 đặc hiệu vùng xylem của promoter CAD4.
Cụ thể, mặc dù đường kính vòng thân c ủa các dòng chuyển gen không khác biệt rõ rệt so với cây không chuyển gen (Hình 3.14), kích thước vùng xylem của tất cả các dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 đều lớn hơn so với dòng đối chứng. Dòng chuyển gen 4 và 11 có độ rộng vùng xylem tăng gấp 2,31 và 2,52 lần so với dòng đối chứng WT không chuyển gen. Kích thước vùng xylem tăng lên tỷ lệ thuận với sự gia tăng phân chia tế bào và biệt hóa xylem (có liên quan đến sự hình thành xylem thứ cấp). Điều này thể hiện qua số lƣợng tế bào xylem tăng lên ở các dòng chuyển gen, số lƣợng tế bào xylem của dòng chuyển gen 4 và 11 lần lƣợt gấp 2,17 và 2,70 lần số lƣợng tế bào xylem của cây đối chứng.
Hình 3. 19: Sơ đồ cấu tạo hệ mạch dẫn ở cây thân gỗ [36]
GA có vai trò quan trọng đối với quá trình biệt hóa xylem và ảnh hưởng đến sự phát triển của xylem thứ cấp [49]. Auxin (IAA) và GA có tác dụng tương hỗ đối với quá trình biệt hóa xylem, khi tỷ lệ IAA/GA thấp, phloem đƣợc gia tăng
52
tổng hợp [36]. Sự biểu hiện GA20 một cách quá mức có thể dẫn đến thay đổi tỷ lệ IAA/GA khiến cho quá trình tổng hợp xylem của mô phân sinh gỗ bị ức chế. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, GA20 chỉ đƣợc biểu hiện đặc hiệu ở xylem nên đã tránh đƣợc tình trạng này, bằng chứng là các dòng chuyển gen vẫn có sự tăng cường tổng hợp xylem thể hiện ở số lượng tế bào xylem tăng lên.
Từ kết quả về sự gia tăng kích thước vùng xylem và tăng cường hoạt động tổng hợp xylem của tầng sinh gỗ thể hiện qua sự tăng lên của số lƣợng tế bào xylem trong nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh vai trò thiết yếu của GA đối với sự hình thành và phát triển xylem.
53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1. Đã thiết kế thành công vector chuyển gen GA20 (gắn đuôi c-myc) dưới sự điều khiển của promoter CAD4 và biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58.
2. Tạo đƣợc 38 dòng Xoan ta chuyển cấu trúc CAD4::GA20 xác nhận bằng phản ứng PCR và phân tích ELISA. Các dòng Xoan ta chuyển gen có chiều dài tăng từ 1,44 – 3,32 lần, khối lƣợng thân tăng từ 1,55 - 2,67, độ rộng vùng xylem tăng gấp 1,15 – 2,52 lần, số lƣợng tế bào xylem gấp 1,14 - 2,70 lần so với cây đối chứng WT.
54 2. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục phân tích, đánh giá tốc độ sinh trưởng và khả năng tạo sinh khối gỗ của các dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 ở mức độ cao hơn.
2. Sử dụng cấu trúc vector chuyển gen mang gen GA20 để chuyển vào một số loài cây trồng lâm nghiệp khác nhằm tạo các dòng sinh trưởng nhanh đem lại hiệu quả kinh tế.
55