3.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20
3.2.2. Kết quả kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển cấu trúc CAD4:: GA20 bằng phản ứng PCR
Các dòng thuốc lá chuyển gen đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên và 1 dòng đối chứng không chuyển gen được trồng trên giá thể thích hợp. Cây trồng ra nhà lưới sau 6 tuần đƣợc tiến hành thu lá để tách chiết DNA tổng số và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen GA20.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% đƣợc thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7: Kết quả kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen CAD4::GA20 bằng phản ứng PCR nhân đoạn gen GA20
Ghi chú: (-): Đối chứng âm - sản phẩm PCR với thành phần phản ứng không chứa DNA; WT: Sản phẩm PCR với khuôn ban đầu là DNA tổng số tách chiết từ cây WT; 1- 13: Sản phẩm PCR với khuôn ban đầu là DNA tổng số tách chiết từ cây chuyển gen CAD4::GA20 dòng 1-13 tương ứng; (+): Đối chứng dương - sản phẩm colony- PCR vi
36
khuẩn A.tumefaciens C58 mang vector chuyển gen CAD4::GA20; M: Thang chuẩn DNA 1kb.
Kết quả cho thấy cả 15 dòng chuyển gen đều xuất hiện băng DNA sáng rõ, kích thước khoảng 1,2 kb đúng với kích thước lý thuyết của đoạn gen GA20 (1176bp) cũng như kích thước của băng DNA đối chứng dương, trong khi mẫu đối chứng âm và dòng WT không xuất hiện băng này.
Như vậy, bước đầu chúng tôi đã thu được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc quan tâm với tỷ lệ chuyển gen cao.
3.3.3. Đánh giá biểu hiện của gen CAD4::GA20 ở mức độ dịch mã bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp
Để đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ dịch mã, 3 dòng thuốc lá mang c ấu trúc CAD4::GA20 xác nhận bằng phản ứng PCR đƣợc sử dụng để phân tích ELISA gián tiếp. Các nghiên cứu trước đó cho thấy promoter CAD4 có tính đặc hiệu xylem, do đó thân và lá (loại bỏ gân lá) của 3 dòng thuốc lá chuyển gen và dòng đối chứng WT đƣợc dùng để tách chiết protein tổng số. Dịch chiết protein này đƣợc đƣa về cùng nồng độ và nhỏ vào các giếng của đĩa PVC để phân tích khả năng biểu hiện GA20-oxidase. Do gen chuyển GA20 đƣợc thiết kế có gắn đuôi cmyc nên khi biểu hiện ở mức độ dịch mã sẽ tạo thành sản phẩm GA20- oxidase có gắn đuôi protein MYC gồm 10 axit amin có trình tự N- EQKLISEEDL-C. Trong phân tích ELISA, kháng thể 1 đặc hiệu c-MYC đã đƣợc sử dụng để phát hiện sản phẩm protein GA20-oxidase gắn đuôi c-MYC. Kháng thể 2 là anti-mouse IgG tích hợp enzyme HRP có khả năng liên kết miễn dịch với kháng thể 1 (anti-c-MYC).Vì vậy, sau bước loại kháng thể 2, rửa bằng đệm P BS loại bỏ các thành phần không gắn, các giếng có mặt GA20-oxidase sẽ còn lại phức hợp bao gồm GA20-oxidase liên kết với 2 loại kháng thể và gắn với enzyme HRP. Khi cho dung dịch TMB là cơ chất của HRP vào các giếng này sẽ xảy ra phản ứng tạo sản phẩm tetramethylbenzidine dimine có màu xanh. Dừng phản ứng phân giải cơ chất bằng HCl, các mẫu dương tính sẽ có màu vàng. Sản phẩm
37
cuối cùng này hấp thụ bước sóng 450nm, kết quả đo quang phổ hấp thụ (OD 450 nm) của các mẫu thí nghiệm đƣợc thể hiện trong Hình 3.8.
Hình 3.8: Kết quả đánh giá bi ểu hiện GA20-oxidase ở các dòng thuốc lá chuyển cấu trúc CAD4::GA20 bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp
Ghi chú: WT: Protein tổng số tách từ thân dòng thuốc lá đối chứng; 1-3: Protein tổng số tách từ thân các dòng chuyển gen CAD4::GA20 1-3 tương ứng; L: Protein tổng số tách từ lá dòng chuyển gen CAD4::GA20 1.
Kết quả trên cho thấy dịch chiết protein từ thân các dòng thuốc lá chuyển gen đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên đều cho tín hiệu cao hơn rõ rệt so với mẫu đối chứng WT chứng tỏ sự có mặt của GA20-oxidase. Thêm vào đó, mẫu dịch chiết từ lá cây chuyển gen có tín hiệu thấp hơn so với mẫu tách chiết từ thân xác nhận lại sự điều khiển biểu hiện gen đ ặc hiệu ở xylem của promoter CAD4. Vì vậy, có thể kết luận đã tạo thành công các dòng thuốc lá chuyển cấu trúc CAD4::GA20, gen chuyển có khả năng biểu hiện ở mức độ dịch mã. Các dòng chuyển gen đều sinh trưởng và phát triển tốt trong nhà lưới, bước đầu có sự khác biệt về mặt hình thái so với dòng đối chứng nhƣ thân và cuống lá dài hơn (Hình 3.9). Đây là tiền đề quan trọng cho việc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào đối tƣợng chính của đề tài - cây Xoan ta.
38
Hình 3.9: Hình ảnh cây thuốc lá chuyển cấu trúc CAD4::GA20 (A) và đối chứng WT (B) sau 6 tuần nuôi trong đi ều kiện nhà lưới
(thanh bar đại diện cho 50mm)