Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng phản ứng PCR
Các dòng thuốc lá và xoan ta chuyển cấu trúc CAD4::GA20 ra rễ trên môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh cùng với dòng đối chứng được nhân nhanh và trồng ra giá thể đất trong nhà lưới đến khi ra lá mới. Thu lá cây thuốc lá, xoan ta chuyển gen và đối chứng. Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Collins và Symons (1992).
DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.7.
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen
STT Thành phần Thể tớch (àl )
1 Nước khử ion 5,5
2 Master Mix 2X 7,5
3 DNA tổng số tách từ cây chuyển gen 1,0
4 F/GA20-SmaI(10 pmol/àl) 0,5
5 R/GA20(10 pmol/àl) 0,5
Tổng 15àl
Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR nhƣ sau:
94oC: 5 phút, 35 chu kỳ [94oC: 40 giây, 58oC: 40 giây, 72oC: 1 phút], 72oC: 7 phút, 4oC: ∞.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm và chụp ảnh.
27
Kiểm tra biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen ở mức độ dịch mã bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp
Thu thân và lá c ủa các dòng Xoan ta chuyển gen và dòng đối chứng WT.
Nghiền 0,2 g mẫu trong nitơ lỏng, bổ sung 200 àl đệm gồm 50 mM NaHCO3; 50 mM Na2CO3; pH = 9,6. Ly tâm 14000 v/p trong 30 phút ở 4 ºC 2 lần để thu dịch trong. Dịch chiết protein này đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp nhƣ sau: Tra mẫu 100 àl dịch chiết protein vào cỏc giếng của đĩa PVC, mỗi mẫu tra 3 giếng, sử dụng dung dịch đệm làm đối chứng âm, ủ qua đêm ở 4 ºC;
loại bỏ mẫu protein trong giếng, thấm khụ, phủ cỏc giếng với 100 àl sữa tỏch bộo 5% (w/v) trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng (RT); loại bỏ sữa, bổ sung vào cỏc giếng 100 àl khỏng thể 1 anti-c-myc 0,2% (v/v) trong sữa 5%, ủ ở RT trong 2 giờ; loại bỏ kháng thể 1, rửa giếng 5 lần với đệm PBS; bổ sung vào các giếng 100 àl khỏng thể 2 anti-mouse IgG (cú gắn HRP) 0,1% trong sữa 5%, ủ ở RT trong 2 giờ; loại bỏ kháng thể 2, rửa giếng 5 lần với đệm PBS; bổ sung vào các giếng 100 àl cơ chất của enzyme - dung dịch TMB và ủ ở RT trong 30 phỳt để phản ứng màu xảy ra; bổ sung vào cỏc giếng 100 àl HCl 2M để dừng phản ứng màu. Kết quả tín hiệu màu được đo bằng máy đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.
Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý của cây chuyển gen
Năm dòng Xoan ta chuyển gen và dòng đối chứng đƣợc nhân nhanh và cho ra rễ, mỗi dòng gồm 3 cây đem nuôi trồng trong điều kiện nhà lưới trong 3 tháng để đánh giá các chỉ tiêu sinh lý nhƣ sau:
Đánh giá tốc độ sinh trưởng: Đo chiều cao thân cây các dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng tính từ gốc cho đến đỉnh sinh trưởng sau mỗi tháng. Tốc độ sinh trưởng trung bình trong 3 tháng (cm/ngày) được tính bằng công thức:
(Chiều cao thân sau 3 tháng – chiều cao thân ban đầu) /số ngày trồng trong nhà lưới.
Đánh giá khả năng tăng sinh khối thân: Cân trọng lượng tươi của toàn bộ phần thân cây Xoan ta chuyển gen và đối chứng (bỏ cành, lá); đo đường kính vòng thân (phần cách mặt đ ất 5cm).
28
So sánh đặc điểm hình thái giữa cây chuyển gen và đối chứng: Đếm số đốt thân, đo chiều dài ngọn (từ nách lá thứ nhất đến đỉnh sinh trưởng) và chiều dài đốt thân (đốt số 2, 3 tính từ đỉnh sinh trưởng), chiều dài cuống lá (thứ 3 tính từ đỉnh sinh trưởng).
Phương pháp nhuộm xylem và đánh giá thay đổi vùng xylem: Lát cắt ngang ở đốt thứ 6 của các dòng xoan ta chuyển gen và đối chứng đƣợc tẩy màu bằng Javen 5% trong 10 phút, trung hòa javen bằng acid acetic trong 2 phút, rửa lại 5 lần bằng nước cất. Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Đỏ carmine trong 2 giờ, rửa sạch dịch nhuộm bằng nước cất. Bổ sung thuốc nhuộm Xanh methylene, nhuộm trong 1 phút, rửa sạch dịch nhuộm bằng nước cất. Tiêu bản được soi dưới kính hiển vi ở vật kớnh 4X, 10X và chụp ảnh. Độ rộng vựng xylem (àm) và số lƣợng tế bào xylem (tế bào/àm) đƣợc đo bằng phần mềm xử lý hỡnh ảnh ImageJ.
Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.
Giá trị đƣợc thể hiện trong bảng số liệu và biểu đồ là giá trị trung bình của 3 cây/dòng kèm theo sai số.
29
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN