Vector tách dòng pBT/GA20 chứa 2 điểm cắt của enzyme giới hạn SmaI và SacI tại 2 đầu 5’ và 3’ của gen GA20 (gắn đuôi cmyc). Đồng thời, vector pBI101/CAD4::gus cũng chứa điểm cắt của enzyme giới hạn SmaI và SacI tại 2 đầu của gen gus.
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành cắt 2 vector trên với cùng c ặp enzyme giới hạn SmaI và SacI để thu gen GA20 và plasmid pBI101 chứa promoter CAD4. Kết quả phản ứng cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và đƣợc thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm cắt vector pBI101/CAD4::gus và pB T/GA20 bằng enzyme SmaI và SacI
Ghi chú: M: Thang chuẩn DNA 1kb; 1: Sản phẩm cắt vector pBI101/CAD4::gus bằng enzyme SmaI và SacI; 2: Sản phẩm cắt vector pBT/GA20 bằng enzyme SmaI và SacI.
Kết quả điện di ở Hình 3.1 cho thấy sản phẩm cắt plasmid pBT/GA20 gồm có 2 băng DNA rõ ràng: 1 băng DNA có kích thước khoảng 2,7 kb đúng với kích thước của vector pBT; 1 băng DNA có kích thước khoảng 1,2 kb (chính xác là 1176 bp) tương ứng với gen GA20. Sản phẩm cắt plasmid pBI101/CAD4::gus gồm có 2 băng: 1 băng DNA có kích thước kho ảng 12,8 kb tương ứng với vector
30
pBI101/CAD4 và 1 băng DNA có kích thước khoảng 1,8 kb tương ứng với gen gus.
Sản phẩm điện di sau đó đƣợc thôi gel để thu vector pBI101/CAD4::gus đã loại bỏ gen gus và gen GA20 tinh sạch. Gen GA20 sẽ đƣợc gắn vào vector pBI101/CAD4 nhờ enzyme T4 ligase tạo vector chuyển gen tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20. Plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc tách dòng bằng tế bào E.
coli DH5α. Các dòng khuẩn mang vector mong muốn đƣợc chọn bằng phản ứng colony - PCR với cặp mồi F/GA20-SmaI và R/GA20-cmyc. Kết quả ở Hình 3.2 cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đ ặc hiệu khuếch đ ại đoạn gen GA20 của 17 dòng vi khuẩn xuất hiện một băng DNA có kích thước đúng với kích thước gen GA20 (đối chứng dương) là kho ảng 1,2 kb.
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20
Ghi chú: M: Thang chuẩn DNA 1kb; (-): Đối chứng âm của phản ứng colony – PCR; 1- 18: Sản phẩm colony – PCR của các dòng khuẩn E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 1-18 tương ứng; (+): Đối chứng dương - sản phẩm PCR của vector tách dòng pBT/GA20-cmyc.
Để chắc chắn các dòng khuẩn đƣợc chọn mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành tách plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn SacI và SmaI (Hình 3.3).
31
Hình 3.3: Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 bằng enzyme giới hạn SacI và SmaI
Ghi chú: M: Thang chuẩn DNA 1kb; 1: Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 bằng enzyme giới hạn SacI và SmaI.
Kết quả sản phẩm cắt cho 2 băng kích thước khoảng 12,9 kb và 1,2 kb đúng với kích thước tính toán của vector pBI101 mang promoter CAD4 và gen GA20. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen pBI101/CAD4::GA20 (Phụ lục – Hình 2).
Để tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen đã thiết kế, vector pBI101/CAD4::GA20 đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumerfaciens chủng C58 bằng phương pháp xung điện. Cấy trải dịch khuẩn trên đĩa môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc (50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifamycin), nuôi ở 28 ºC sau 48 giờ thu đƣợc các khuẩn lạc tròn đều và mọc riêng rẽ.
Do chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58 đƣợc sử dụng mang gen kháng kháng sinh rifamycin còn vector pBI101 mang gen kháng kháng sinh kanamycin nên những khuẩn lạc sống sót trên môi trường chọn lọc đều là những dòng A.tumefaciens đƣợc biến nạp thành công vector chuyển gen.
Để đảm bảo các khuẩn lạc này đều là những dòng mang gen chọn lọc, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc để tiến hành phản ứng colony - PCR
32
với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen GA20. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% và thu đƣợc kết quả nhƣ Hình 3.4.
Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc các dòng A. tumefaciens C58 mang vector chuyển gen pBI101/CAD4::GA20
Ghi chú: M: Thang chuẩn DNA 1kb; (-): Đối chứng âm của phản ứng colony – PCR;
Cl1-3: Sản phẩm colony – PCR của các khuẩn lạc A.tumefaciens C58 mang vector chuyển gen pBI101/CAD4::GA20 1-3 tương ứng; (+): Đối chứng dương - sản phẩm PCR của vector tách dòng pBT/GA20.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm colony - PCR từ 3 khuẩn lạc đƣợc chọn có kích thước băng DNA khoảng 1,2 kb đúng như kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gen GA20 (1176 bp) cũng như kích thước của đối chứng dương. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tạo đƣợc thành công chủng vi khuẩn A.tumerfaciens mang vector chuyển gen GA20 dưới sự điều khiển của promoter CAD4. Các dòng vi khuẩn này đƣợc giữ chủng trong glycerol ở -85ºC để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.