Nghiên cứu chuyển gen GA20 mã hóa Enzyme Ga20- Oxidase dưới sự điều khiển của Promoter Cad4 biểu hiện đặc hiệu ở Xylem vào cây xoan ta ( Melia Azedarach L)

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GA20 MÃ HÓA ENZYME G A20-OXIDASE DƢỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CAD4 BIỂU HIỆN ĐẶC HIỆU Ở XYLEM VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GA20 MÃ HÓA ENZYME G A20-OXIDASE DƢỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CAD4 BIỂU HIỆN ĐẶC HIỆU Ở XYLEM VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Văn Sơn PGS.TS Nguyễn Trung Thành Hà Nội – 2017 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Lê Văn Sơn PGS.TS Nguyễn Trung Thành Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn có sử dụng thơng tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Nguyễn Hồng Nhung Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài, nhận dạy dỗ, bảo tận tình thầy, cô giáo quan tâm, động viên từ gia đình bạn bè Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Sơn – phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Nguyễn Trung Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Xin cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Nghiên cứu chọn tạo đánh giá dịng Xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh có triển vọng” TS Nguyễn Văn Phong - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp - chủ nhiệm hỗ trợ phương diện để thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Bích Ngọc –phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học, ThS Bùi Phƣơng Thảo cán bộ, sinh viên phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học ln ln quan tâm, đóng góp lời khun, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ mặt suốt thời gian qua Học viên Nguyễn Hồng Nhung Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Xoan ta 1.2 Chất điều tiết sinh trƣởng gibberellin (GA) vai trị GA20oxidase q trình tổng hợp GA dạng hoạt động 1.2.1 Giới thiệu chung GA đƣờng sinh tổng hợp GA dạng hoạt động 1.2.2 Vai trị GA20-oxidase q trình sinh tổng hợp GA 1.3 Giới thiệu chung promoter đặc hiệu promoter đặc hiệu xylem CAD4 1.3.1 Promoter đặc hiệu 1.3.2 Promoter đặc hiệu xylem CAD4 10 1.4 Tình hình nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta 14 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu thực vật 16 2.1.2 Chủng vi khuẩn vector 16 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 16 2.1.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 i Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2.1 Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen mang gen GA20 dƣới điều khiển promoter CAD4 17 2.2.2 Phƣơng pháp tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen CAD4::GA20 20 2.2.3 Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 22 2.2.4 Phƣơng pháp chuyển gen vào Xoan ta thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23 2.2.5 Phƣơng pháp phân tích đánh giá chuyển gen 26 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang gen GA20 dƣới điều khiển promoter CAD4 29 3.2 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20 32 3.2.1 Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào thuốc 32 3.2.2 Kết kiểm tra dòng thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 phản ứng PCR 35 3.3 Tạo Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20 38 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào Xoan ta 38 3.3.2 Kiểm tra dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 phản ứng PCR 40 3.3.3 Đánh giá biểu gen CAD4::GA20 mức độ dịch mã kỹ thuật ELISA gián tiếp 42 3.3.4 Đánh giá sơ tiêu sinh lý dòng xoan chuyển gen CAD4::GA20 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 ii Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Xoan ta (Melia azedarach L.) Hình 1.2: Con đƣờng sinh tổng hợp GA [64] Hình 1.3: Mức độ biểu CAD4 mô quan khác [41] 12 Hình 3.1: Kết điện di sản phẩm cắt vector pBI101/CAD4::gus pBT/GA20 enzyme SmaI SacI 29 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc dòng khuẩn E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 30 Hình 3.3: Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 enzyme giới hạn SacI SmaI 31 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc dòng 32 Hình 3.5: Hình ảnh thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 đối chứng WT môi trƣờng tái sinh chồi chọn lọc 34 Hình 3.6: Hình ảnh thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20(A) đối chứng (B) môi trƣờng rễ chọn lọc 35 Hình 3.7: Kết kiểm tra dòng thuốc chuyển gen CAD4::GA20 phản ứng PCR nhân đoạn gen GA20 35 Hình 3.8: Kết đánh giá biểu GA20-oxidase dòng thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 kỹ thuật ELISA gián tiếp 37 Hình 3.9: Hình ảnh thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20 (A) đối chứng WT (B) sau tuần nuôi điều kiện nhà lƣới 38 Hình 3.10: Hình ảnh Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 đối chứng môi trƣờng chọn lọc 40 Hình 3.11: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ Xoan ta đối chứng (WT) chuyển gen CAD4::GA20 41 Hình 3.12: Kết kiểm tra dòng xoan ta chuyển gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen GA20 42 Hình 3.13: Kết đánh giá biểu GA20-oxidase dòng xoan ta chuyển cấu trúc CAD4:: GA20 kỹ thuật ELISA gián tiếp 43 Hình 3.14: Kết so sánh chiều dài thân dòng Xoan ta chuyển gen CAD4::GA20 đối chứng tháng trồng nhà lƣới 44 Hình 3.15: Ảnh hƣởng GA20 đến đƣờng kính khối lƣợng thân 46 Hình 3.16: Hình thái Xoan chuyển cấu trúc CAD4::GA20 đối chứng không chuyển gen (sau tháng trồng nhà lƣới) 48 Hình 3.17: Hình ảnh tiêu cắt lát ngang thân (vùng xylem) Xoan ta sinh trƣởng tháng 49 iii Footer Page of 126 Header Page of 126 Hình 3.18: Kết ảnh hƣởng CAD4::GA20 đến hình thành xylem thứ cấp (gỗ) 50 Hình 3.19: Sơ đồ cấu tạo hệ mạch dẫn thân gỗ [36] 51 iv Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt vector chuyển gen pBI101/CAD4::gus pBT/GA20 enzyme giới hạn 18 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng ghép nối gen GA20 vào vector 18 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp 19 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng colony - PCR 21 Bảng 2.5: Môi trƣờng nuôi chọn lọc thuốc chuyển gen 22 Bảng 2.6: Môi trƣờng sử dụng chuyển gen vào Xoan ta 24 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển chuyển gen 26 Bảng 3.1: Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20 vào thuốc lá…… .……….33 Bảng 3.2: Kết chuyển gen CAD4::GA20 vào Xoan ta 39 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng cấu trúc CAD4::GA20 đến hình thái Xoan ta 47 v Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens bp Base pair CAD Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GA Gibberellin GA20 Gen mã hóa cho GA20-oxidase P.trichocarpa Populus trichocarpa PCR Polymerase Chain Reaction v/p vòng/phút vi Footer Page 10 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 18 of 126 nở hoa sớm chiều dài thân cao so với đối chứng Trong chuyển gen ức chế hoạt động enzyme cho kết ngƣợc lại [36] Chính vậy, việc sử dụng phƣơng pháp sinh học nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp GA dạng hoạt động loài lâm nghiệp hƣớng nghiên cứu triển vọng việc tạo giống lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh Khi tăng cƣờng biểu gen mã hóa cho GA20-oxidase dƣơng chuyển gen, sinh trƣởng kéo dài lóng thân tăng sinh khối gỗ đƣợc ghi nhận [11, 21, 35-37] Nghiên cứu chi tiết biểu gen trình hình thành gỗ chuyển gen tăng cƣờng tổng hợp GA20-oxidase cho thấy mức độ phiên mã cao xảy giai đoạn đầu q trình biệt hóa xylem [35, 36] Đặc tính kéo dài thân dịng chuyển gen tăng cƣờng mã hóa GA20-oxidase tƣơng quan tỷ lệ thuận với hiệu suất quang hợp [8], hoa sớm giảm kích thƣớc [37] Cụ thể, Dƣơng lai chuyển gen tăng cƣờng mã hóa GA20-oxidase có tốc độ sinh trƣởng tăng lên với hình thành sinh khối gỗ Vùng xylem chuyển gen có chiều dài sợi gỗ tăng lên 8% so với không chuyển gen [20] Do cộng (2015) nghiên cứu chuyển gen GA20 dƣới điều khiển promoter định 35S vào Panicum virgatum L thu đƣợc kết dịng chuyển gen có lá, thân dài hơn, với khối lƣợng khô tăng lên gấp lần so với dịng khơng chuyển gen [17] Tuy nhiên, biểu mức GA20 dƣới điều khiển promoter định gây nên tính trạng bất lợi cho Cây dƣơng chuyển gen mã hóa GA20-oxidase cho thấy biểu rễ gây trở ngại trình chuyển môi trƣờng đất [20] Cũng đối tƣợng này, Jeon cộng (2016) tiến hành chuyển cấu trúc 35S::PdGA20 DX15::GA20 nhận thấy dƣơng chuyển gen điều khiển promoter định 35S có kiểu hình khơng mong muốn nhƣ phát triển, chuyển gen GA20 điều khiển promoter DX15- loại promoter đặc hiệu vùng xylem - không mang kiểu Footer Page 18 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 19 of 126 hình bất lợi [37] Do đó, việc sử dụng promoter đặc hiệu nhằm mục đích kiểm sốt mức độ biểu GA20 số mô, quan định cần thiết 1.3 Giới thiệu chung promoter đặc hiệu promoter đặc hiệu xylem CAD4 1.3.1 Promoter đặc hiệu Mức độ biểu gen sinh vật nhân sơ nhƣ sinh vật nhân chuẩn đƣợc định trình tự DNA upstream đặc hiệu gọi promoter Quá trình phiên mã đƣợc bắt đầu protein nhận biết trình tự DNA đặc hiệu promoter, dẫn đến hoạt động RNA polymerase Promoter điều khiển biểu gen thông qua trình tự nhận biết tƣơng tác với phức hợp khởi đầu phiên mã nhiều nhân tố phiên mã khác Các trình tự nhận biết thƣờng bao gồm promoter lõi với trình tự tăng cƣờng upstream nằm gần với phần cấu trúc gen Phiên mã đƣợc kích hoạt trình tự tăng cƣờng (enhancer) độc lập vị trí, khoảng cách hƣớng chúng promoter Promoter đƣợc chia thành hai vùng: vùng lõi promoter vùng điều khiển upstream Lõi promoter gồm chuỗi 50-100 bp nằm gần điểm khời đầu phiên mã, tƣơng tác với yếu tố phiên mã đảm bảo việc khởi đầu phiên mã xác RNA polymerase II Lõi promoter bao gồm hai yếu tố di truyền quan trọng hộp TATA (hiện diện hầu hết promoter) yếu tố khời đầu (Inr) nằm chồng lên điểm khởi đầu phiên mã Vùng promoter ngƣợc dòng gồm 1-2 kb bao gồm nhiều nhân tố cis đóng vai trị nhƣ vùng gắn cho điều khiển biểu gen đặc hiệu Theo khả biểu hiện, promoter đƣợc chia làm hai loại chính: promoter khơng đặc hiệu hay cịn gọi promoter định promoter đặc hiệu bao gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển promoter cảm ứng Promoter đặc hiệu mô tế bào loại promoter điều khiển gen biểu đặc hiệu mơ thể Có nhiều promoter đặc hiệu với loại mô khác đƣợc phân lập nghiên cứu việc tạo trồng chuyển gen nhƣ promoter biểu đặc hiệu rễ, hoa, hạt mạch dẫn Hormone stress phi Footer Page 19 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 20 of 126 sinh học điều khiển hoạt động promoter đặc hiệu mô tế bào Tuy nhiên số promoter đặc hiệu mơ tế bào hoạt động mức độ thấp đặc hiệu, đặc biệt chúng điều khiển biểu gen loài khác xa di truyền Promoter đặc hiệu mạch dẫn bao gồm promoter đặc hiệu phloem promoter đặc hiệu xylem Chuyển gen vào thực vật sử dụng promoter đặc hiệu phloem/xylem cho phép gen đích biểu đặc hiệu mạch dẫn biện pháp đầy hứa hẹn việc kiểm soát bệnh hệ mạch [19] Một số promoter đặc hiệu xylem đƣợc nghiên cứu nhƣ promoter GRP 1.8 (từ Đậu Pháp), PAL (từ Cải dầu), CsPP (từ Chanh), CAD4 (từ Dƣơng lai) [6; 18; 41] 1.3.2 Promoter đặc hiệu xylem CAD4 Gen CAD4 đƣợc phân lập từ Dƣơng lai ( Populus trichocarpa - P trichocarpa) [6; 41- 43] CAD4 gen mã hóa cho Cinamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) – enzyme đóng vai trị quan trọng trình tổng hợp lignin Trong thành phần cấu tạo nên thành tế bào xylem thứ cấp, lignin đƣợc coi thành phần quan trọng nhất, chiếm từ 15-35% khối lƣợng khô Lignin tạo nên vững chắc, tính khơng thấm chống lại phân hủy sinh học [40] Lignin đƣợc tìm thấy hầu hết có mạch, có chức điều khiển vận chuyển chất thực vật (một phần tham gia vào việc giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh vận chuyển chất lỏng), cho phép lớn lên cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời [7] Lignin có cấu trúc phức tạp, polyphenol có mạng không gian mở Thành phần thay đổi theo loại gỗ, tuổi vị trí c ấu trúc gỗ CAD xúc tác cho phản ứng khử ba loại hydroxy-cinnamaldehydes(pcoumaraldehyde, coniferaldehyde, sinapaldehyde) để tạo thành ancol hydroxy-cinnamyl tƣơng ứng, tiền chất trực tiếp lignin [58] Ở mầm hai mầm, hoạt động CAD đƣợc điều hòa tăng cƣờng stress sinh học phi sinh học CAD đƣợc mã hóa họ gen, trình tự đầy 10 Footer Page 20 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 21 of 126 đủ họ gen đƣợc xác định hệ gen số mơ hình nhƣ Arabidopsis, Oryza; Populus nhƣ số loài khác [6, 40, 58] Trong thành viên thuộc họ gen CAD phân lập từ dƣơng, gen mã hóa cho CAD4 đƣợc xem gen CAD quan trọng đƣờng tổng hợp lignin dựa vào phát sinh loài nghiên cứu biểu [6, 9] Cây dƣơng chuyển gen với giảm hoạt động CAD4 thể biến đổi cấu trúc lignin, xác nhận lại vai trị quan trọng CAD4 trình tổng hợp lignin [40] Barakat cộng (2009) nghiên cứu mức độ biểu 15 gen CAD phân lập từ Dƣơng phản ứng định lƣợng RT-PCR thu đƣợc kết CAD4 biểu mạnh vùng xylem, gấp 100 lần mức độ biểu xylem gen CAD lại nhƣng lại biểu yếu phận khác nhƣ lá, vỏ cuống [6] Sự biểu đặc hiệu xylem CAD4 promoter CAD4 quy định Lê Thị Vân Anh cộng (2015) nghiên cứu điều khiển biểu gen GUS CAD4 (pPtCAD4 nghiên cứu) Dƣơng lai (P trichocarpa) thu đƣợc kết biểu mạnh GUS vùng xylem (mức độ biểu GUS phận khác Dƣơng chuyển gen đƣợc thể Hình 1.3, màu đỏ thể mức độ cao màu vàng) Tác giả chuyển gen PtIREG1- GFP (chống chịu kim loại Nikel) dƣới điều khiển CAD4 vào Dƣơng lai thu đƣợc kết dòng chuyển gen, PtIREG1-GFP biểu đặc hiệu mô gỗ, mức độ biểu cao từ 12-28 lần so với không chuyển gen nhƣng thấp so với dịng chuyển gen đích dƣới điều khiển promoter định [41] 11 Footer Page 21 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 22 of 126 Hình 1.3: Mức độ biểu gus dƣới điều khiển promoter CAD4 mô quan khác [41] Sau lựa chọn đƣợc promoter thích hợp để điều khiển biểu gen chuyển theo mục đích mong muốn, việc sử dụng phƣơng pháp chuyển gen vector chuyển gen phù hợp vô quan trọng Để chuyển gen vào thực vật, phƣơng pháp hữu hiệu đƣợc sử dụng phổ biến phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.4 Tình hình nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen Trong năm gần đây, với phát triển nhanh chóng kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều trình sinh lý thực vật liên quan đến sinh trƣởng phát triển đƣợc nghiên cứu cách cặn kẽ, nhiều thơng tin thu đƣợc góp phần tạo ứng dụng to lớn cải thiện giống trồng nói chung lâm nghiệp nói riêng Nhiều gen chìa khóa tham gia vào điều khiển tăng trƣởng đƣợc phân lập, thiết kế với promoter mạnh chuyển vào số 12 Footer Page 22 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 23 of 126 trồng, kết thu đƣợc khả quan Các hƣớng nghiên cứu chuyển gen vào lâm nghiệp bao gồm chuyển gen tăng cƣờng khả chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi, kháng sâu bọ, cải thiện hàm lƣợng cellulose lignin Một hƣớng nghiên cứu gần đƣợc quan tâm chuyển gen liên quan đến hình thành gỗ nhằm mục tiêu cải thiện chất lƣợng gỗ Các loại hormone có vai trị điều hịa nhiều trình sinh trƣởng phát triển thực vật có sinh trƣởng thân hoa Chuyển gen mã hóa cho loại hormone để tăng cƣờng sinh trƣởng thân hƣớng nghiên cứu đầy triển vọng nhằm mục đích thay đổi đặc điểm hình thái giải phẫu trồng Tiêu biểu gen GA20 mã hóa cho enzyme đa chức GA20 oxidase enzyme chìa khóa điều hịa sinh tổng hợp gibberellin có hoạt tính kích thích biệt hóa kéo dài mạch xylem làm thân gỗ tăng trƣởng chiều cao đƣờng kính Một cơng trình tiêu biểu chuyển gen GA20 vào Dƣơng lai, kết cho thấy tất dịng chuyển gen có tốc độ sinh trƣởng nhanh sinh khối tăng cao so với đối chứng không chuyển gen, chồi khối lƣợng khô tăng 64%, thân tăng 126% [8; 37] Gen GS1 (cytosolic glutamine synthetase) mã hóa cho octamer protein/enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp glutamine từ glutamic acid NH4 +, tăng cƣờng khả hấp thu tái sử dụng hiệu nguồn nitơ (GS; EC 6.3.1.2) Gallardo cộng (1999) chuyển cấu trúc gen GS1 dƣới điều khiển promoter 35S vào Dƣơng lai, kết cho thấy chuyển gen sinh trƣởng nhanh so với đối chứng 76% (cây tháng tuổi) 21,3% (cây tháng tuổi) [24] Nghiên cứu chuyển gen vào rừng đƣợc thực nhiều nƣớc giới nhƣ Singapore, Trung Quốc, Đài Loan, Australia, Brazil, Ấn Độ, Nếu nhƣ vào năm 1996 nông nghiệp biến đổi gen thức đƣợc trồng thƣơng mại hố, đến năm 2002, Trung Quốc nƣớc có loài lâm 13 Footer Page 23 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 24 of 126 nghiệp biến đổi gen đƣợc trồng thƣơng mại hoá Đó dƣơng (P nigra) chuyển gen Bt kháng côn trùng ăn đƣợc trồng khảo nghiệm 80 hecta vào năm 1999 trồng thƣơng mại 200-300 hecta vào năm 2002; dƣơng lai 741(P alba X [P davidiana + P simonii] X P tomentosa) chuyển gen Cry1A(c) API kháng côn trùng ăn đƣợc trồng khảo nghiệm năm 2001 trồng thƣơng mại năm 2003 Tại Mỹ, có khoảng 124 giống trồng chuyển gen đƣợc trồng thử nghiệm Các giống lâm nghiệp chuyển gen cải thiện khả hình thành gỗ (tăng tốc độ sinh trƣởng, cải thiện hàm lƣợng cellulose ) ngày đƣợc quan tâm nghiên cứu, trồng khảo nghiệm sớm đƣa vào thƣơng mại hóa [21; 56] 1.4.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta Trên giới Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu đặc điểm lâm sinh học, cơng dụng Xoan ta ngƣời môi trƣờng sinh thái nhƣng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến chất lƣợng giống Xoan ta lại chƣa đƣợc quan tâm mức Đã có số cơng trình ngồi nƣớc nghiên cứu tái sinh Xoan ta nuôi cấy in vitro [2;3] Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng quy trình tái sinh in vitro phục vụ bảo tồn, nhân giống vô tính, chọn lọc dịng tế bào biến dị soma chịu mặn cơng tác chuyển gen Số lƣợng cơng trình công bố chuyển gen cải thiện giống Xoan ta cịn Trên giới có cơng trình cơng bố chuyển gen thị (gen GFP) gen chọn lọc kanamycin (gen nptII) vào Xoan ta) [46] Ở Việt Nam có số cơng trình cơng bố chuyển gen vào Xoan ta: chuyển gen thị (gen gus) gen chọn lọc chất diệt cỏ PPT (gen bar) [2]; chuyển gen 4Cl tăng chất lƣợng gỗ [45]; chuyển gen codA, P5CSm tăng cƣờng khả chống chịu điều kiện bất thuận môi trƣờng Các kết nghiên cứu tiền đề quan trọng để cải thiện giống Xoan ta Trƣớc công dụng to lớn Xoan ta kinh tế lâm nghiệp, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm tạo giống Xoan ta 14 Footer Page 24 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 25 of 126 có khả sinh trƣởng nhanh có ý nghĩa Dựa sở nghiên cứu chuyển gen vào Xoan ta nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho GA dạng hoạt động (ví dụ nhƣ GA20) thơng qua vi khuẩn A tumefaciens trƣớc đây, thực nghiên cứu chuyển gen GA20 dƣới điều khiển promoter CAD4 đặc hiệu xylem vào Xoan ta nhằm đánh giá ảnh hƣởng gen chuyển khả sinh trƣởng Xoan ta, phục vụ cho công tác tạo dòng Xoan ta sinh trƣởng nhanh cho sinh khối gỗ lớn 15 Footer Page 25 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 26 of 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực Vật rừng, NXB Nông nghiệp Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2011), ―Nghiên cứu chuyển gen mã hóa gibberellin 20-oxidase vào Xoan ta (Melia azedarach L.) Agrobacterium tumefaciens‖, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (2): 217-222 Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007), ―Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta (Melia azedarach L.) phục vụ cho chuyển gen‖, NXB KH&KT, Hội nghị Khoa học toàn quốc Nghiên cứu khoa học sống Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), ―Tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) sinh trƣởng nhanh kỹ thuật chuyển gen‖, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 11-14 Quyết định số 16/2005/QĐ-BNN việc ban hành ―Danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo vùng sinh thái lâm nghiệp‖ TÀI LIỆU TIẾNG ANH Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., Diloreto D S., Yellanki P., Carlson J E.(2009), ―The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and expression‖, BMC PlantBiology, 9(1), 26 Barros J., Serk H., Granlund I., Pesquet E (2015), ―The cell biology of lignification in higher plants‖, Annals of Botany, 115(7), 1053–1074 Biemelt, S (2004), ―Impact of Altered Gibberellin Metabolism on Biomass Accumulation, Lignin Biosynthesis, and Photosynthesis in Transgenic Tobacco Plants‖, Plant Physiology, 135(1), 254–265 Burge C., Lopez M C., Baker H V., Mandel R J., Muzyczka N.(2008), ―Genome-wide analysis of aging and learning-related genes in the hippocampal dentate gyrus‖, Neurobiology of Learning and Memory, 89(4), 379–396 55 Footer Page 26 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 27 of 126 10 Cantón FR, Suarez MF, Jose-Estanyol M, Cánovas F (1999), ―Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts‖, Plant Molecular Biology 40: 623-634 11 Carrera E., Bou J., Garcia-Martínez, J L., Prat S.(2000),―Changes in GA 20oxidase gene expression strongly affect stem length, tuber induction and tuber yield of potato plants‖, Plant Journal, 22(3), 247–256 12 Chen Z., Wang J., Ye M X., Li H., Ji L X., Li Y., An X M (2013), ―A novel moderate constitutive promoter derived from poplar‖ International Journal of Molecular Sciences, 14(3), 6187–6204 13 Cheng H., Li L., Xu F., Cheng S., Cao F., Wang Y., Wu C (2013), ― Expression patterns of a cinnamyl alcohol dehydrogenase gene involved in lignin biosynthesis and environmental stress in Ginkgo biloba”, Molecular Biology Reports, 40(1), 707–721 14 Collins Graham G., Symons Robert H (1993), ―Polymorphisms in Grapevine DNA detected by the RAPD PCR technique‖, Plant molecular biology reporter, 11(2) 15 Dayan J (2016), Gibberellin transport Annual Plant Reviews,49(49), 95–120 16 Diaga Diouf, 2003 ― Genetic transformation of forest trees‖, African Journal of Biotechnology 2(10), 328-333 17 Do P T., De Tar, J R., Lee, H., Folta, M K., Zhang, Z J (2016 ), ―Expression of ZmGA20ox cDNA alters plant morphology and increases biomass production of switchgrass (Panicum virgatum L.)‖, Plant Biotechnology Journal, 14(7), 1532– 1540 18 Dutt M., Dhekne, Soriano L., Kandel R., Grosser J W.(2014 ), ―Temporal and spatial control of gene expression in horticultural crops‖, Horticulture Research, 1(August) 19 Eom H., Kim H., Hyun K.(2016), ―The cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) gene family in flax (Linum usitatissimum L.): Insight from expression profiling of cads induced by elicitors in cultured flax cells‖, Archives of Biological Sciences, 68(3), 603–612 56 Footer Page 27 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 28 of 126 20 Eriksson, M E., Israelsson, M Olsson, Moritz T.(2000), ―Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length‖, Nature Biotechnology, 18(7), 784–788 21 FAO (2010), Forest and genetically modified trees 22 Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., Grima-Pettenati J (1995), ―Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants‖, Plant Molecular Biology, 27(4), 651–667 23 Fukuda H.(1996), ―Xylogenesis : Initiation , Progression , and Cell Death‖, 299– 325 24 Gallardo F., Fu J., Jing Z P., Kirby E G., Cánovas F M (2003), ―Genetic modification of amino acid metabolism in woody plants‖, Plant Physiology Biochemistry, 41: 587–594 25 Goellner M (2001), ―Endo-beta-1, 4-Glucanase Expression in Compatible Plant Nematode Interactions‖, The Plant Cell Online, 13(10), 2241–2255 26 Gomi K., Matsuoka M (2003), ―Gibberellin signalling pathway‖, Current opinion in plant biology, 6(5), 489-493 27 Gustavo A., Cabrera J (1998), ―The Agrobacterim tumefaciens gene transfer to plant cell Molecular Microbiology”, 26, 1-14 28 Hai L., Qingyin Z., Yan Ling Z., Sha sheng W., Xiangning J., 2003 ―Xylemspecific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco‖, Plant Growth Regulation, 41(3), 279 - 286 29 Hedden P., Kamiya Y.(1997), ―Gibberellin biosynthesis: Enzymes, Genes and Their Regulation‖, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 48, 31–460 30 Hedden P., Thomas S G.(2012), ―Gibberellin biosynthesis and its regulation Biochemical Journal‖, 444(1), 11–25 31 Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T.(1994) ―Efficient transformation of rice (Oriza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA‖, The Plant Journal, 6, 271-282 32 Hu F., Zhang L., Wang X., Ding J.,Wu D (2005), ―Agrobacterium- mediated transformed transgenic triploid bermudagrass (Cynodon dactylon x C 57 Footer Page 28 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 29 of 126 transvaalensis) plants are highly resistant to the glufosinate herbicide Liberty‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83(1), 13–19 33 Huang R C., Tadera K., Yagi F., Minami Y., Okamura H., Iwagawa T., Nakatani M (1996) ―Limonoids from Melia azedarach”, Phytochemistry, 43, 581-583 34 Israelsson M (2004), ― Gibberellin Homeostasis and Biosynthesis in Relation to Shoot Growth in Hybrid Aspen‖, Forest Genetics 35 Israelsson M., Mellerowicz E., Chono M., Gullberg J., Moritz T (2004), ―Cloning and overproduction of gibberellin 3-oxidase in hybrid aspen trees Effects on gibberellin homeostasis and development‖, Plant Physiology, 135(1), 221–230 36 Israelsson M., Sundberg B., Moritz T.(2005), ―Tissue-specific localization of gibberellins and expression of gibberellin-biosynthetic and signaling genes in wood-forming tissues in aspen‖, Plant Journal, 44(3), 494–504 37 Jeon H W., Cho J S., Park E J., Han K H., Choi Y I., Ko J H (2016), ―Developing xylem-preferential expression of PdGA201, a gibberellin 20oxidase from Pinus densiflora, improves woody biomass production in a hybrid poplar‖, Plant Biotechnology Journal, 14(4), 1161–1170 38 Ko J H., Kim H T., Hwang I., Han K H.(2012),― Tissue-type-specific transcriptome analysis identifies developing xylem-specific promoters in poplar‖, Plant Biotechnology Journal, 10(5), 587–596 39 Lapierre C., Pollet B., Petit-Conil M., Toval G., Romero J., Pilate G., Jouanin L (1999), ―Structural alterations of lignins in transgenic poplars with depressed Cinnamyl alcohol dehydrogenase or caffeic acid o- methyltransferase activity have an opposite impact on the efficiency of industrial kraft pulping‖, Plant Physiology, 119(1), 153–164 40 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos-Thevenot P., GrimaPettenat J (2002), ―The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species‖, Plant Molecular Biology, 50(3), 497–509 58 Footer Page 29 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 30 of 126 41 Le Thi Van Anh, T D E (2015), Characterization of poplar metal transporters to improve rehabilitation of metal polluted soils, Institut des Sciences du Végétal 42 Ma Q H (2010), ―Functional analysis of a cinnamyl alcohol dehydrogenase involved in lignin biosynthesis in wheat‖, Journal of Experimental Botany, 61(10), 2735–2744 43 Mansell R L., Gross G G., Stöckigt J., Franke H., Zenk M H (1974), ―Purification and properties of cinnamyl alcohol dehydrogenase from higher plants involved in lignin biosynthesis‖, Phytochemistry, 13(11), 2427–2435 44 Marroni F., Pinosio S., Zaina G., Fogolari F., Felice N., Cattonaro F., Morgante M (2011), ―Nucleotide diversity and linkage disequilibrium in Populus nigra cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD4) gene‖, Tree Genetics and Genomes, 7(5), 1011–1023 45 Ngo Van Thanh, Jiang Xiangning, Ha Van Huan, Nguyen Thi Hau, Ho Van Giang (2010), ―Vector construction and transformation of 4CL gene into Chinaberrytree (Melia azedarach L.)‖, Journal of Science, 26, 205-210 46 Nirsatmanto A., Gyokusen K.(2007), ―Genetic transformation of Melia azedarach L., using Agrobacterium mediated transformation‖, Journal of Forestry Research 4, 1-8 47 Niu S., Li Z., Yuan H., Fang P., Chen X., Li W (2013 ), ―Proper gibberellin localization in vascular tissue is required to regulate adventitious root development in tobacco‖, Journal of Experimental Botany, 64(11), 3411–3424 48 Nugroho W D., Yamagishi Y., Nakaba S., Fukuhara S., Begum S., Marsoem S N, Funada R (2012), ―Gibberellin is required for the formation of tension wood and stem gravitropism in Acacia mangium seedlings‖, Annals of Botany, 110(4), 887–895 49 Olszewski N., Sun T P., Gubler F (2002), ―Gibberellin signaling: biosynthesis, catabolism, and response pathways‖, The Plant Cell, 14 Supplement, 61–80 50 Phillips L., Ward D., Uknes S., Appleford N E., Lange T., Huttl A K., Hedden P (1995), ― Isolation and expression of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones from Arabidopsis‖, Plant Physiology, 108(3), 1049–1057 59 Footer Page 30 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 31 of 126 51 Ruzika K., Ursache R., Helariutta Y (2015), ―Xylem development - from the cradle to the grave‖, New Phytologist, 207(3), 519–535 52 Ragni L., Nieminen K., Pacheco-Villalobos D., Sibout R., Schwechheimer C., Hardtke C S.(2011),―Mobile gibberellin directly stimulates Arabidopsis hypocotyl xylem expansion‖, The Plant Cell, 23(4), 1322–36 53 Regnault T., Davière J M., Achard P.(2016), ―Long-distance transport of endogenous gibberellins in Arabidopsis”, Plant Signaling & Behavior, 11(1) 54 Roberts K., McCann M C (2000), ―Xylogenesis: The birth of a corpse‖, Current Opinion in Plant Biology, 3(6), 517–522 55 Shi R., Sun Y H., Li Q., Heber S., Sederoff R.,Chiang V L (2010 ), ― Towards a systems approach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa: Transcript abundance and specificity of the monolignol biosynthetic genes ‖, Plant and Cell Physiology, 51(1), 144–163 56 Tang W., Tang A Y (2014), ―Transgenic woody plants for biofuel‖, Journal of Forestry Research, 25(2), 225–236 57 Tanimoto E (2005), ―Regulation of Root Growth by Plant Hormones—Roles for Auxin and Gibberellin‖, Critical Reviews in Plant Sciences, 24(4), 249–265 58 Tobias C M., Chow E K (2005), ―Structure of the cinnamyl-alcohol dehydrogenase gene family in rice and promoter activity of a member associated with lignification‖, Planta, 220(5), 678–688 59 Topping J (1998), ―Tobacco Transformation‖, Plant Virology Protocols, 4(81), 365-372 60 Tzfira T., Citovsky V (2008), Agrobacterium From Biology to Biotechnology, Developmental Biology 61 Van Doorsselaere J., Baucher M., Feuillet C., Boudet A M (1995), ―Isolation of cinnamyl alcohol dehydrogenase cDNAs from two important economic species: alfalfa and poplar Demonstration of a high homology of the gene within angiosperms‖, Plant Physiology and Biochemistry, 33(1), 105–109 62 Wagner A., Tobimatsu Y., Phillips L (2015), ―Syringyl lignin production in conifers: Proof of concept in a Pine tracheary element system‖, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 112(19), 6218–23 60 Footer Page 31 of 126 Nguyễn Hồng Nhung – K23QH2014 Header Page 32 of 126 63 Xu Y L., Li L., Wu K., Peeters, A J., Gage, D A., Zeevaart J A (1995), ―The GA5 locus of Arabidopsis thaliana encodes a multifunctional gibberellin 20oxidase: molecular cloning and functional expression‖, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92(14), 6640–4 64 Yamaguchi S (2008), ―Gibberellin Metabolism and its Regulation‖, Annual Review of Plant Biology, 59(1), 225–251 65 Yamaguchi S., Kamiya Y (2000), ―Gibberellin Biosynthesis: Its Regulation by Endogenous and Environmental Signals‖, Plant Cell Physiol, 41(3), 251–257 66 Yaxley J R (2001),―Gibberellin Biosynthesis Mutations and Root Development in Pea‖, Plant Physiology, 125(2), 627–633 67 Zhong P J., Gallardo F., Pascual M B., Sampalo R., Romero J., Navarra A T., Cánovas F M (2004), ―Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase‖, New Phytologist, 164: 137–145 68 http://vafs.gov.vn 61 Footer Page 32 of 126 ... NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GA20 MÃ HÓA ENZYME G A20 -OXIDASE DƢỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CAD4 BIỂU HIỆN ĐẶC HIỆU Ở XYLEM VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành:... có nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho GA20- oxidase dƣới điều khiển promoter định 35S vào đối tƣợng thực vật Xuất phát từ sở trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen GA20 mã hóa enzyme GA20- oxidase. .. cuống [6] Sự biểu đặc hiệu xylem CAD4 promoter CAD4 quy định Lê Thị Vân Anh cộng (2 015) nghiên cứu điều khiển biểu gen GUS CAD4 (pPtCAD4 nghiên cứu) Dƣơng lai (P trichocarpa) thu đƣợc kết biểu mạnh