Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen 4CL1 vào cây xoan ta (melia azedarach l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN NHƯ NGỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR VÀ CHUYỂN GEN 4CL1 VÀO CÂY XOAN TA ( Melia azedarach L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUANG HÒA HÀ NỘI – 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, nội dung trình bày luận văn tìm tòi, nghiên cứu thân Các kết nghiên cứu trung thực chưa công bố luận văn tác giả khác Tôi xin chịu trách nhiệm nội dung cam đoan Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010 Tác giả Nguyễn Như Ngọc LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn tốt nghiệp, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lê Quang Hòa, người thầy trực tiếp, tận tình hướng dẫn suốt trình thực luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới ThS Hồ Văn Giảng, Giám đốc trung tâm Giống Công nghệ Sinh học- trường Đại học Lâm Nghiệp, chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) có sức sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt” tận tình giúp đỡ trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè gia đình quan tâm động viên khích lệ suốt trình thực luận văn Một lần nữa, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tất người giúp đỡ ủng hộ tôi! Hà Nội, Tháng 10-2010 Tác giả: Nguyễn Như Ngọc DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Stt Ký hiệu Tên gọi FAO Food and Agriculture Organization GMC Genetic Modified Crops CNSH Công nghệ sinh học EIQ Bt GHE ISAAA RB Right boder LB Left boder 10 Kan Kanamycin 11 MCS Multiple Cloning Site 12 kb 13 E.coli 14 A.tumefaciens Environmental Impact Quotient Bacillus thurigenesis Greenhouse Effect International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications Kilobase Escheria coli Agrobacterium tumefaciens DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số loài rừng nghiên cứu chuyển gen Trung Quốc Bảng 1.2 Đặc điểm số gen 4CL1 đối tượng khác 18 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất lai southern blot 35 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt vector chuyển gen pBI 121 vector tách dòng PCR 2.1- 4CL1 cặp enzym giới hạn 36 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối vector pBI121 với gen 4CL1 để tạo vector tái tổ hợp 36 Bảng 2.4 Cắt plasmid pBI121-4CL1 cặp enzym BamHI/SacI 39 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR nhân gen 4CL1 44 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 1.1 Biểu đồ diện tích trồng công nghệ sinh học toàn cầu Hình1.2 Biểu đồ diện tích số loại trồng CNSH toàn cầu từ 1996 – 2008 (Clive James, 2009) Hình 1.3 Cấu tạo hóa học đơn phân lignin 14 Hình 1.4 Mô hình gắn kết sợi polysaccharide lignin 15 Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp lignin 17 Hình 1.6 Hình thái trưởng thành, Hoa Quả Xoan ta 22 Hình 1.7 Cấu trúc T – ADN T – plasmid 25 Hình 1.8 Sơ đồ cấu trúc vùng T – ADN vector pBI121 32 Hình 1.9 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121 32 10 Hình 3.1 Kết cắt pBI121, pCR2.1-4CL1 BamHI/SacI 49 11 Hình 3.2 Kết gel thu nhận gen 4CL1 vector pBI121 50 12 Hình 3.3 Vi khuẩn E.coli mang vector pBI121-4CL1 môi trường Kan 51 13 Hình 3.4 Plasmid tách chiết từ dòng tế bào biến nạp pBI121-4CL1 52 14 Hình 3.5 Kết PCR nhân gen 4CL1 53 15 Hình 3.6 Kết cắt kiểm tra pBI121-4CL1 enzym giới hạn 53 16 54 18 Hình 3.7 Các khuẩn lạc vi khuẩn A.tumefaciens chủng LBA 4404 sau biến nạp mọc môi trường chọn lọc Hình 3.8 Kết colony PCR từ khuẩn lạc vi khuẩn A tumefaciens chủng Hình 3.9 Plasmid tách từ dòng A tumefaciens LB1và LB2 19 Hình 3.10 Kết cắt plasmid dòng LB1 LB2 enzym giới hạn 56 20 Hình 3.11 Kết PCR nhân gen 4CL1 từ dòng LB1 LB2 57 21 Hình 3.12 Cây mầm Xoan ta in vitro tái sinh từ hạt 58 22 Hình 3.13 Thân mầm Xoan ta cộng sinh với vi khuẩn A tumefaciens mang vector pBI121 – 4CL1 59 17 55 56 24 Hình 3.14 Các giai đoạn phát triển vật liệu nhận gen môi trường chọn lọc Hình 3.15 Cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 62 25 Hình 3.16 Cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 điều kiện tự nhiên sau tháng 63 26 Hình 3.17 Ảnh điện di ADN tổng số từ dòng Xoan ta chuyển gen 64 27 Hình 3.18 Kết PCR nhân gen 4CL1 từ 16 dòng Xoan ta chuyển gen 65 28 Hình 3.19 Kết southern blot từ ADN Xoan ta chuyển gen, dòng T5 66 23 60 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan lời cảm ơn Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU………………………………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN .4 1 Tình hình trồng biến đổi gen giới Việt Nam .4 1.1.1 Tình hình trồng biến đổi gen giới 1.1.2 Tình hình trồng biến đổi gen Việt Nam 1.2 Tình hình nghiên cứu Lâm nghiệp biến đổi gen giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Lâm nghiệp biến đổi gen giới .7 1.2.2 Tình hình nghiên cứu lâm nghiệp biến đổi gen Việt Nam 1.2.3 Các gen thường chuyển vào lâm nghiệp 10 1.3 Gen điều hòa trình sinh tổng hợp lignin thực vật .13 1.3.1 Giới thiệu lignin vai trò lignin thực vật 13 1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp lignin thực vật .16 1.3.3 Gen 4CL1 – điều hòa trình sinh tổng hợp lignin thực vật 17 1.3.4 Tình hình nghiên cứu gen 4CL1 giới 18 1.4 Tổng quan Xoan ta (Melia azedarach L.) 20 1.4.1 Giới thiệu Xoan ta 20 1.4.2 Tình hình nghiên cứu phát triển giống Xoan ta .22 1.5 Chuyển gen thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .23 1.5.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens…………………………………………….24 1.5.2 Cấu trúc T-plasmid T- AND……………………………………………….24 1.5.3 Cơ chế trình chuyển T - AND vào tế bào thực vật……………………… 25 1.5.4 Tương tác T-ADN genome tế bào thực vật……………………………….27 1.6 Hệ vector sử dụng nghiên cứu 29 1.6.1 Giới thiệu vector chuyển gen pBI121………………………………………… 29 1.6.2 Các thành phần cấu trúc vector pBI121…………………………………… 29 Chương 33 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu hoá chất nghiên cứu 33 2.1.1 Vật liệu .33 2.1.2 Hoá chất thiết bị 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu .35 2.2.1 Thiết kế vector chuyển gen 4CL1 35 2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp chứa gen 4CL1 37 2.2.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen 38 2.3 Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta 39 2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens chứa vector mang gen 4CL1 41 2.3.2 Tạo đoạn thân mầm để cảm ứng phục vụ cho chuyển gen .42 2.3.3 Đồng nuôi cấy vi khuẩn với đoạn thân mầm .42 2.3.4 Chọn lọc vật liệu nhận gen 42 2.3.5 Tái sinh chồi từ vật liệu nhận gen 43 2.3.6 Tạo chuyển gen hoàn chỉnh .43 2.4 Kiểm tra có mặt gen 4CL1 Xoan chuyển gen 43 2.4.1.Nhân gen mục tiêu phương pháp PCR 43 2.4.2.Phương pháp lai Southern blot 45 Chương 49 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Thiết kế vector chuyển gen tái tổ hợp pBI12-4CL1 49 3.1.1 Cắt vector chuyển gen pBI121 pCR2.1-4CL1 cặp enzym BamHI/SacI gel để thu nhận sản phẩm cắt 49 3.1.2 Ghép nối tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào vi khuẩn E.coli sàng lọc dòng vi khuẩn E.coli mang vector tái tổ hợp 51 3.1.3 Kiểm tra kỹ thuật PCR .52 3.1.4 Kiểm tra enzym giới hạn 53 3.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pBI121-4CL1 .54 3.2.1 Biến nạp vector chuyển gen mang gen 4CL1 vào vi khuẩn A tumefaciens chủng LBA 4404 .54 3.2.2.Tuyển chọn dòng vi khuẩn mang vector chuyển gen 55 3.3 Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta .58 3.3.1 Tạo mầm in vitro để tạo vật liệu phục vụ cho chuyển gen 58 3.3.2 Đồng nuôi cấy với vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen .58 3.3.3 Chọn lọc vật liệu nhận gen .59 3.3.4 Tạo Xoan ta chuyển gen 4CL1 61 3.4 Kiểm tra có mặt gen 4CL1 chuyển gen 63 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số Xoan ta chuyển gen 63 3.4.2 Kết nhân gen 4CL1 .64 3.4.3 Kết Southern blot 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .68 TÀI LIỆU THAM KHẢO .69 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam nay, nhu cầu gỗ gia tăng mạnh mẽ cho tiêu dùng nội địa xuất Nước ta xuất sản phẩm gỗ sang 120 quốc gia vùng lãnh thổ giới, tập trung vào thị trường trọng điểm Mỹ (chiếm 43,35%); Nhật Bản (chiếm 13,68% ); tiếp đến Trung Quốc (với 7,62%) Dự kiến kim ngạch xuất đồ gỗ lâm sản Việt Nam năm 2010 2,95 tỷ USD, tăng 5,3% so với năm 2009, gỗ sản phẩm gỗ đạt 2,735 tỷ USD Do đó, Chính phủ xếp sản phẩm gỗ vào nhóm 10 mặt hàng xuất chiến lược Nhưng khó khăn Việt Nam hàng năm phải nhập 80% nguyên liệu cho việc sản xuất sản phẩm từ gỗ Không thế, tương lai gần việc nhập gỗ ngày trở nên khó khăn nhiều nước nhiệt đới cấm xuất gỗ Một loài lấy gỗ đáp ứng nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng Xoan ta, với đặc điểm gỗ lớn, thời gian thu hoạch ngắn, suất gỗ cao, gỗ có tính thẩm mỹ, không bị mọt, thích nghi với nhiều điều kiện gây trồng Gỗ Xoan ưa chuộng dùng xây dựng, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất điêu khắc… Do đó, Xoan ta chọn loài gỗ lớn quan trọng xếp vị trí thứ thứ hai danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm Mặc dù vậy, giống Xoan ta trồng chưa đáp ứng yêu cầu người trồng rừng sản xuất người sử dụng gỗ Xoan sau thu hoạch thường phải ngâm nước từ đến tháng gỗ bền, không bị mối, bị biến dạng sử dụng Chính vậy, thực tiễn đòi hỏi tạo giống Xoan ta có sức sinh trưởng nhanh hơn, chất lượng gỗ tốt để đáp ứng nhu cầu gỗ cho người Công tác nghiên cứu nhằm cải tạo giống trồng, vật nuôi truyền thống nhà khoa học tiến hành từ sớm đến đạt thành định Tuy nhiên, phương pháp nhiều hạn chế, đặc biệt plasmid hoạt động để chuyển gen mục tiêu sang tế bào thực vật tạo điều kiện để gen mục tiêu tích hợp vào gen tế bào thực vật Hình 3.13: Thân mầm Xoan ta cộng sinh với vi khuẩn A tumefaciens mang vector pBI121–4CL1 3.3.3 Chọn lọc vật liệu nhận gen Sau cộng sinh với vi khuẩn, tế bào có mang gen mục tiêu chọn lọc cách khử khuẩn nuôi cấy môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Kan (100mg/l) Các mẫu sống môi trường chọn lọc có khả mang gen phát triển để phân chia tái sinh chồi Các mẫu không mang gen không sống môi trường chọn lọc Đây bước chọn lọc sơ để thu mẫu chuyển gen Tiếp theo, mẫu sống môi trường chọn lọc lần sau 14 ngày cấy chuyển sang môi trường chọn lọc tương ứng để khẳng định thêm khả chống chịu với kháng sinh Và vậy, sau lần cấy chuyển mẫu sang môi trường chọn lọc, mẫu có khả sống tốt có khả tái sinh mẫu có khả mang gen cao Các chồi chọn lọc sơ bộ, sống môi trường chọn lọc sau lần cấy chuyển sang môi trường chất chọn lọc để giảm khả ức chế kháng sinh tăng khả tái sinh chồi Kết thể hình 3.14 59 A B C D Hình 3.14: Các giai đoạn phát triển vật liệu nhận gen môi trường chọn lọc A: Mẫu chuyển gen môi trường chọn lọc lần 1sau tuần B: Mẫu chuyển gen môi trường chọn lọc lần sau tuần C: Mẫu chuyển gen môi trường chọn lọc lần 3, sau tuần D: Mẫu chuyển gen môi trường chất chọn lọc sau tuần Từ hình ảnh ta thấy được, môi trường chọn lọc lần có nhiều mẫu bị chết, vài mẫu có khả sống, khả tái sinh chậm Sau chọn lọc lần loại bỏ mẫu chắn không mang gen Các mẫu sống môi trường chọn lọc cấy sang môi trường chọn lọc để chọn lọc 60 tiếp Ở môi trường này, tiếp tục loại mẫu không mang gen, tỷ lệ chết mẫu môi trường chọn lọc giảm so với lần Sau cấy chuyển sang môi trường chọn lọc lần 3, có mẫu phát triển mạnh có mẫu phát triển chậm hơn, điều sức chống chịu với kháng sinh dòng xoan khác Sau lần chọn lọc, sơ chọn chồi Xoan có khả mang gen Để chồi sinh trưởng bình thường tạo chồi đủ tiêu chuẩn để chuẩn bị tạo hoàn chỉnh, tiến hành cấy chuyển sang môi trường kháng sinh Trên môi trường này, chồi sinh trưởng nhanh hơn, chồi có độ đồng cao 3.3.4 Tạo Xoan ta chuyển gen 4CL1 3.3.4.1 Kích thích tăng trưởng chồi Các chồi Xoan ta sau trình chọn lọc sơ cắt lấy phần chồi, kích thước khoảng 2cm chuyển sang môi trường kéo dài chồi L5 Sau tuần nuôi cấy, chồi phát triển kéo dài đến kích thước – 5cm (Hình 3.15A B) Chồi sau kéo dài cấy chuyển sang môi trường rễ R1 để tạo hoàn chỉnh, có rễ khoẻ mạnh có khả sống sinh trưởng tốt đưa từ điều kiện phòng thí nghiệm huấn luyện trồng môi trường đất tự nhiên Sau cấy môi trường rễ thời gian đến tuần thu hoàn chỉnh, có từ – lá, đến rễ, chiều dài rễ đến cm, rễ to, khỏe (Hình 3.15 C, D) Cây rễ đủ tiêu chuẩn chiều cao, số rễ, số trước đưa trồng môi trường tự nhiên cần phải huấn luyện ngày phòng nuôi cách rửa môi trường thạch, sau cấy sang bầu đất có bọc nilon, tưới nước ngày lần, chế độ nuôi in vitro để có khả thích nghi dần với môi trường đất Sau ngày huấn luyện, bầu bọc nilon đưa môi trường phòng thí nghiệm, tưới nước hàng ngày để thích nghi với điều kiện: ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ môi trường 61 thời gian ngày tiến hành bỏ nilon, trồng chậu đất tự nhiên (Hình 3.15 E F) Hình 3.15: Cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 A: Chồi kéo dài sau tuần nuôi cấy; B: chồi kéo dài sau tuần nuôi cấy C, D: Cây chuyển gen hoàn chỉnh; E, F: Xoan ta huấn luyện 62 Cây Xoan ta sau huấn luyện trồng môi trường tự nhiên với chế độ chăm sóc không chuyển gen Hình 3.16: Cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 điều kiện tự nhiên sau tháng 3.4 Kiểm tra có mặt gen 4CL1 chuyển gen 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số Xoan ta chuyển gen Sau trình chuyển gen, thu 66 dòng Xoan ta sống sau ba lần cấy chuyển môi trường chọn lọc, ký hiệu từ T1 đến T66 Vì chưa có điều kiện kiểm tra 66 dòng nên tiến hành chọn ngẫu nhiên 16 dòng để kiểm tra có mặt gen mục tiêu Lấy mẫu từ Xoan ta chuyển gen 4CL1 rễ hoàn chỉnh trồng môi trường để tách chiết ADN tổng số Tiến hành tách chiết ADN 16 dòng Xoan chuyển gen (T1;T5;T9;T12;T15;T17;T20;T25;T28;T30;T35;T40;T42;T50;T55 T62) Kết tách chiết thể hình 3.16, nhiên ảnh thể kết tách ADN dòng, dòng khác thu kết tương tự) 63 Hình 3.17: Ảnh điện di ADN tổng số từ dòng Xoan ta chuyển gen (M: thang ADN chuẩn 1kb; giếng từ đến tương ứng với ADN tổng số dòng Xoan ta chuyển gen: T1;T5;T9;T12;T15;T17;T20;T25;T28) Từ hình 3.16 cho thấy, tách chiết thành công ADN dòng Xoan ta chuyển gen, đảm bảo chất lượng cho tiến hành phản ứng PCR 3.4.2 Kết nhân gen 4CL1 Để kiểm tra có mặt gen 4CL1 Xoan ta chuyển gen, sử dụng ADN tổng số 16 dòng Xoan ta chuyển gen tách ADN làm khuôn để nhân gen 4CL1 với mồi đặc hiệu gen 4CL1 chương trình PCR thiết kế, đối chứng dương phản ứng PCR từ mẫu plasmid tái tổ hợp PCR2.1-4CL1, đối chứng âm phản ứng PCR từ ADN tách từ Xoan ta không chuyển gen Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% kết thể hình 3.17 64 Hình 3.18: Kết PCR nhân gen 4CL1 từ 16 dòng Xoan ta chuyển gen (M: thang ADN chuẩn 1kb;Các Giếng ký hiệu tương ứng với dòng Xoan ta chuyển gen từ T1 đến T62) (-): Đối chứng âm: PCR nhân gen CL1 từ ADN Xoan ta không chuyển gen (+): Đối chứng dương: PCR nhân gen 4CL1 từ ADN plasmid PCR2.1-4CL1 Từ hình 3.17 ta thấy, giếng T5; T17; T28; T35; T55; T62 xuất băng có kích thước khoảng 1,6 kb, trùng với kích thước gen 4CL1 Như khẳng định tạo dòng Xoan chuyển gen có chứa gen 4CL1, dòng: T5; T17; T28; T35; T55; T62 3.4.3 Kết Southern blot Để khẳng định chắn có mặt gen 4CL1 Xoan ta chuyển gen biết số gen 4CL1 hệ gen Xoan ta chuyển gen, tiến hành thí nghiệm Southern blot dòng T5, Tiến hành cắt ADN dòng Xoan T5 enzym giới hạn khác nhau: XhoI; KpnI; cặp enzym BamHI/SacI, thí nghiệm thu kết hình 3.18 65 : Hình 3.19: Kết southen blot từ ADN Xoan ta chuyển gen, dòng T5 (+): mẫu đối chứng dương: tiến hành với pBI121-4CL1 (X): ADN genom tách từ dòng T5 cắt enzym XhoI (BS): ADN genom tách từ dòng T5 cắt enzym BamHI/SacI (K): ADN genom tách từ dòng T5 cắt enzym KpnI (-): Mẫu đối chứng âm (ADN genom tách từ Xoan ta không chuyển gen) Từ hình 3.19 ta thấy: Đối với giếng cắt cặp enzym BamHI/SacI, lai Southern có băng vạch có kích thước trùng khớp với kích thước đối chứng dương, điều khẳng định chắn rằng: dòng Xoan T5 có mặt gen 4CL1 Đối với giếng (X), cắt ADN enzym XhoI (sở dĩ chọn enzym XhoI gen 4CL1 không chứa trình tự cắt enzym này, màng lai có hai 66 băng vạch có kích thước khác nhau, khẳng định dòng Xoan chuyển gen T5 có hai gen 4CL1 Đối với giếng cắt enzym KpnI (trong gen 4CL1 không chứa trình tự cắt enzym này), màng lai băng vạch có kích thước khác nhau, khẳng định: dòng Xoan T5 có hai gen 4CL1 Như vậy, qua phản ứng southen blot, khẳng định dòng Xoan T5 chắn có chứa gen 4CL1 có nhât hai gen 4CL1 hệ gen 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Qua thời gian thực đề tài “Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta (Melia azedarach L.) thông qua kết nghiên cứu trình bày, đến kết luận sau: Đã thiết kế thành công 01 vector chuyển gen mang gen 4CL1, pBI121-4CL1 Tạo 01 chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mang vector chuyển gen pBI121-4CL1 Tạo dòng Xoan ta mang gen 4CL1 Kiểm tra có mặt gen 4CL1 Xoan ta chuyển gen Từ kết nghiên cứu kết luận trên, có số kiến nghị sau: - Tối ưu hóa trình chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta để nâng cao hiệu suất chuyển gen - Nghiên cứu đánh giá biểu gen 4CL1 dòng Xoan ta chuyển gen 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Bộ trưởng Nông nghiệp phát triển nông thôn (2005), “Quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/3/2005 Ban hành Danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo vùng sinh thái lâm nghiệp”, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, Hà Nội Bộ trưởng Nông nghiệp phát triển nông thôn (2006), “Quyết định số 62/2006/QĐ-BNN ngày 16 tháng năm 2006 việc phê duyệt chiến lược phát triển giống lâm nghiệp giai đoạn 2006-2020”, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, Hà Nội Lê Mộng Chân (1993), Thực vật rừng, Nhà Xuất Nông nghiệp, Hà Nội Lê Thị Thu Hiền (2007), “Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, (1), tr 1-18 Lê Thi Thu Hiền (2004), “Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen mã hoá protein ức chế trypsin McoTi-II phân lập từ hạt gấc Momordica cochinchinensis”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(3), tr 335-344 Lê Thị Thu Hiền (2004), “Thiết kế vector hệ mang gen kháng côn trùng cryIAc để chuyển vào trồng”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(1), tr 85-92 Hà Văn Huân (2009), “Phân lập gen 4CL1 từ thông đuôi ngựa ( Pinus massonia Lamb) trồng Việt Nam”, Tạp chí công nghệ sinh học, 7(4), tr 479-483 Trần Thị Lệ (2006), Giáo trình công nghệ gen nông nghiệp, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Trần Thị Phương Liên (1997), “Chuyển tổ hợp gen GUS-BNG vào thuốc lá”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 35(2), tr 23-27 69 10 Nguyễn Hoàng Lộc (2005), “Chuyển gen Cholera Toxin B subtilis vào mía (Saccharum officinarum.L) thông qua A Tumefaciens” , Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 11 Đặng Trọng Lương (2005), “Nghiên cứu chuyển gen Chitinase kháng nấm vào lúa thông qua vi khuẩn A Tumefacies”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 12 James C (2008), Hiện trạng trồng chuyển gien/CNSH năm 2008, Báo cáo khoa học số 39, ISAAA, Hoa Kỳ 13 Lê Đức Tấn (2007), Công nghệ chuyển gen thực vật, Báo cáo hội nghị khoa học công nghệ, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 14 Lê Tiến (2010), Cây trồng công nghệ sinh học nông nghiệp giới việt nam, Nhà xuất Công thương, Hà Nội 15 Lê Xuân Tình (1998), Khoa học gỗ, Nhà Xuất Nông nghiệp, Hà Nội.(13) 16 Nguyễn Đức Thành (2003), chuyển gen thực vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội 17 Bùi Văn Thắng (2007), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta (Melia azedarach L) phục vụ cho chuyển gen”, Báo cáo Khoa học hội nghị toàn quốc, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội 18 Nguyễn Văn Thêm (2004), Lâm sinh học, Nhà xuất Nông nghiệp,Hà Nội II Tiếng Anh 19 Alimohammad M (2009), “Agrobacterium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors”, African Journal of Biotechnology 8(20), pp 5142-5148 20 Beard A.J Porter S.J (2003), Genetically modified organisms and aquaculture, Food and agriculture organization of the United nations, Rome 21 Bevan M W., (1983), “A chimeric antibiotic resistance gene as a selecable marker for plant cell transformation” Nature, 304, 184-187 70 22 Boerjan W (2003), “Lignin Biosynthesis”, Plant biol 54(3), 519 – 546 23 Brich R.G.(2007), “Plant tranformation Problems and strategies for practical applications”, Annual Review of plant physiology plant Molecular Biology, 48(3), pp 297-326 24 Brown, A (1995) “Review of lignin in biomass”, Biochem 7(1), pp 371-378 25 Crow R.M (2003), “Genetic modified trees: production, properties, and potential”, Journal Arboriculture, 29 (5), pp 259 – 266 26 Diouf D (2003), “Genetic transformation of forest trees”, African Journal of Biotechnology (10), pp 328-333 27 Dixon R (1997), “Nif gene transfer and expression in chloroplasts: prospects and problems”, Plant and soil, 194(2), pp 193 – 203 28 Eriksson E.M., Israelsson M (2000), “Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, bimass production and xylem fiber length” Nature Biotechnology, 18 (2), pp: pp 784 – 788 29 Fresco L O.(2001), Genetically modified Organisms in food and Agriculture, Crop DNA Forest Biotechnology for the future Royal Swedish Academy of Agriculture and Forestry, Falkenberg Sweden 30 Gustavo A., Riva D.L (1998), “Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, EJB Electronic Journal of Biotechnology ISSN, 1(3), pp 1-16 31 Hamberger H (2004), “The – coumarate: coA ligase gene family in Arabidopsis thaliana comprise one rare, Sinapate – activating and three commonly occurring isoenzyms”, Pnas, 101(7), pp 2209-2214 32 Hoa T.T., Hai H.V.(2008), “Transformation efficiens of the soybean variety PC 19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omonrice, 16, pp 1-8 33 Hu J.W (1999), “Repression of lignin biosynthesis promotes cellulos accumulation and growth in transgenic trees”, Nature America, 6(2), pp 807 – 812 71 34 Iiyama, K., Lam T.B., Stone, B.(1994) “Covalent cross-links in the cell wall”, Plant Physiol 104(5), pp 315–320 35 James Clive (2003), Global status of GM crops their contribution to Sustain ability and Future Prospects, International Service for the Acquisition of Agri-biotech Application, USA 36 Jent C.G (1986), “Activity of T-DNA Borders in Plant Cell Transformation by Mini-T Plasmids”, Journal of bacteriology, 166(2), pp 491-499 37 Kallman M (2008), Genetically Modified Crops and the futere of World Agriculture, Nature Biotechnology, 17(6), pp 231-235 38 Kempken R.(2001), “Transgenic woody plants in forestry and agriculture”, Genetic engneering Newsletter p Special Issue 7(1), pp 1-7 39 Kuta D.D (2005), “Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated and transfer”, African Journal of Biotechnology, (8), pp 752-757 40 Lu H, Zhao Y.L (2004), “stable and specific expression of – coumarate Coenzym A ligase gene (4CL1) driven by the xylem specific Pto4CL1 in the transgenic tobaco” Biotechnology leeters, 26(14), pp 1147 – 1152 41 Lu H.(2003), “Xylem specific expression of GRP1.8 Promotes 4CL1 gene construct in transgenic tobaco”, Plant Growth regulation, 41(3), pp 279-286 42 Matsui N., Fukushima K (1994)), “On the Behavior of Monolignol Glucosides in lignin Biosynthesis”, Holzforschung, 48(5), pp 375 – 380 43 Orwa et al(2009), “Melia azedarach”, Agroforestry Database, pp 1-5 44 Pearl I.W (1967), The chemistry of lignin, Marcel Dekker, New York 45 Robischon M (2006), “Field Trials with Transgenic Trees – State of the Art and Developments”, Special Issue, 9(3), pp – 46 Sarkanen K.V and Hergert H L,(1971), In lignins, Ocurence, formation, structure and Reactions, Wiley Interscience, New York 72 47 Sedjo, A.R (2004), Genetically engineed Tress promise and concern, Resources for the future, USA 48 Tinl B (1996), “the integration of T –DNA into plant genomes”, Trends in plant science, 1(6), pp 178-184 49 Tzfira T.,Zuker.A.(1998), “Forest-tree biotechnology: genetic transformation and its application to future forests”, Elsevier Science, 16(4), pp.439 – 446 50 Vila S (2003), “Somatic embryo genesis and plant regeneration form immature zygotic embryos of Melia Azedarach (Meliaceae)”, applied and social sciences magazine, 39(3), pp 189-195 51 Vila S., “Plant regeneration, origin, and development of shoot buds from root segments of Melia azedarach L (Meliaceae) seedlings”, Invitro cellular and developmental Biology-plant,41(6), pp: 746-751 52 Wei Xiao-Xin, “Evolution of 4-coumarate:coenzym A ligase (4CL) gene and divergence of Larix (Pinaceae)”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 31(3), pp 542–553 53 Whetten R (1995), “Lignin Biosynthesis”, The plant cell, (4), pp 1001 – 1003 III Trang Web 54 http://www.Economy.vn/58 135 POC99/dân số giới.htm 55 http://www.Gmo-compass.org/eng/agri-biotechnology/gmo-planting/ 411.gmo-planting.2007.htm 56 http:///www Tin tức.vn/ trồng chuyển gen Việt Nam 73 ... thực đề tài Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta (Melia azedarach L.) nội dung quan trọng đề tài Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) biến đổi gen có khả... cho biến nạp gen 4CL1 vào đối tượng Xoan ta Tạo số dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 phạm vi phòng thí nghiệm Nội dung đề tài: - Xây dựng cấu trúc vector để biểu gen 4CL1 Xoan ta chuyển gen - Tạo chủng... khuẩn A Tumefaciens mang vector biểu gen 4CL1 Xoan ta - Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta - Kiểm tra có mặt gen 4CL1 Xoan ta chuyển gen Chương TỔNG QUAN 1 Tình hình trồng biến đổi gen giới Việt Nam 1.1.1