Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen GS1 vào cây xoan ta (melia azedarach) tam bội bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KHÁNH HÕA NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHUYỂN GEN GS1 VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH) TAM BỘI BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KHÁNH HÕA NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHUYỂN GEN GS1 VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH) TAM BỘI BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Phong TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh Hà Nội – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi cộng tác với cộng sự, dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Phong TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực phần đƣợc cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần kết lại luận văn chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Vũ Thị Khánh Hòa LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội trang bị kiến thức cho suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Phong Trung tâm xúc tiến đào tạo du học - Đại học Lâm nghiệp TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh - Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN tận tình bảo hƣớng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh luận văn thạc sĩ Xin đƣợc cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu chọn tạo đánh giá dòng xoan ta biến đổi gen sinh trƣởng nhanh có triển vọng” TS Nguyễn Văn Phong chủ nhiệm hỗ trợ phƣơng diện để thực nghiên cứu Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin cảm ơn anh chị em sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp ln bên cạnh giúp đỡ, khích lệ, động viên suốt thời gian học tập, nghiên cứu phòng Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Vũ Thị Khánh Hòa MỤC LỤC MỤC LỤC i MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu chung xoan ta 1.1.1 Nguồn gốc phân bố xoan ta 1.1.2 Đặc điểm hình thái xoan ta 1.1.3 Đặc điểm sinh thái xoan ta 1.1.4 Giá trị sử dụng xoan ta .4 1.2 Các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta 1.2.1 Các nghiên cứu xoan ta giới 1.2.2 Các nghiên cứu đối tƣợng xoan ta Việt Nam .6 1.3 Kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.3.1 Các phƣơng pháp chuyển gen thực vật 1.3.2 Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.4 Hệ thống tái sinh thông qua tạo mô sẹo xoan ta tam bội 11 1.5 Gen GS1 ứng dụng chuyển gen GS1 tạo giống trồng .11 1.5.1 Vai trò nitơ thực vật 11 1.5.2 Gen GS1 13 1.5.3 Ứng dụng chuyển gen GS1 tạo giống trồng 14 1.6 Các phƣơng pháp phân tích đánh giá chuyển gen in vitro in vivo 15 1.6.1 Đánh giá chọn lọc chuyển gen in vitro 15 1.6.2 Phân tích chuyển gen kỹ thuật sinh học phân tử 15 1.6.3 Đánh giá khả sinh trƣởng chuyển gen 17 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu 18 2.1.1 Vật liệu thực vật .18 2.1.2 Vật liệu di truyền 19_Toc534147740 i 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu .20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Nuôi cấy tạo mô sẹo xoan ta tam bội .21 2.3.2 Chuyển gen GS1 vào mô sẹo xoan ta tam bội 22 2.3.3 Chọn lọc thể nhận gen kháng sinh kanamycin 23 2.3.4 Xác định chuyển gen kỹ thuật PCR 25 2.3.5 Xác định chuyển gen phƣơng pháp Southern blot 27 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng dòng xoan ta tam bội chuyển gen 29 2.3.5.1 Huấn luyện trồng điều kiện nhà lưới 29 2.3.5.2 Đánh giá tiêu sinh lý chuyển gen 30 2.3.6 Phƣơng pháp thu thập xử lí số liệu 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp NAA BAP đến khả tạo mô sẹo xoan ta tam bội .32 3.2 Chọn lọc thể nhận gen kháng sinh kanamycin 35 3.2.1 Đánh giá ảnh hƣởng hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả sống mô sẹo 35 3.2.2 Chọn lọc thể nhận gen GS1 in vitro 36 3.3 Đánh giá ảnh hƣởng hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả rễ chồi xoan ta tam bội chuyển gen 39 3.4 Kiểm tra có mặt gen GS1 dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 .42 3.5 Kết phân tích dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 kĩ thuật Southern blot 44 3.6 Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng dòng xoan ta tam bội chuyển gen .48 3.6.1 Đánh giá ảnh hƣởng thành phần giá thể đến tỉ lệ sống dòng xoan ta tam bội 48 ii 3.6.2 Đánh giá khả sinh trƣởng chiều cao dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 49 3.6.3 Đánh giá khả sinh trƣởng đƣờng kính dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 51 KẾT LUẬN .54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái xoan ta Hình 1.2 Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens .9 Hình 1.3 Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 10 Hình 2.1 Biểu đồ phân tích dòng chảy tế bào dòng xoan ta [44] 18 Hình 2.2 Cây xoan ta tam bội in vitro 19 Hình 2.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GS1 20 Hình 2.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR .27 Hình 2.5 Mơ hình trồng xoan ta điều kiện cách ly vật lý .30 Hình 3.1 Mô sẹo xoan ta tam bội .32 Hình 3.2 Mơ sẹo tái sinh qua ba lần chọn lọc 38 Hình 3.3 Ảnh hƣởng kanamycin đến khả rễ chồi xoan ta tam bội không chuyển gen .40 Hình 3.4 Ảnh hƣởng kanamycin đến khả rễ chồi xoan ta tam bội chuyển gen .41 Hình 3.5: Kết điện di DNA tổng số dòng gel agarose 1% 42 Hình 3.6: Kết kiểm tra sản phẩm PCR dòng chuyển gen GS1 43 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm DNA tổng số 44 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm cắt DNA tổng số enzyme XbaI .45 Hình 3.9 Kết Southern blot mẫu xoan ta tam bội chuyển gen GS1 46 Hình 3.10 Sinh trƣởng dòng xoan ta tam bội 53 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens .23 Bảng 2.2 Trình tự mồi tham gia phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR .26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA 28 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo mơ sẹo 33 Bảng 3.2 Kết tạo mô sẹo xoan ta tam bội 34 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến khả sống mô sẹo .36 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu chuyển gen GS1 vào mô sẹo 37 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng kanamycin đến khả rễ chồi xoan ta tam bội không chuyển gen .39 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng kanamycin đến khả rễ chồi xoan ta tam bội chuyển gen .41 Bảng 3.7 Nồng độ DNA mẫu sau tinh 44 Bảng 3.8 Tổng hợp kết phân tích Southern blot dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 .47 Bảng 3.10 Sinh trƣởng chiều cao xoan ta (Hvn) 50 Bảng 3.11 Sinh trƣởng đƣờng kính gốc xoan ta (D00) 51 Bảng 3.12 Sinh trƣởng đƣờng kính ngang ngực xoan ta (D1,3) 51 v DANH MỤC BIỂU ĐÕ Biểu đồ 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến khả sống mô sẹo 36 Biểu đồ 3.2 Hiệu chọn lọc mô sẹo chuyển gen GS1 38 Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng giá thể lên tỉ lệ sống sau tháng .48 vi 7,80 G12 18,46 103,25 193,08 288,92 372,64 155,76 3.6.3 Đánh giá khả sinh trƣởng đƣờng kính dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 Ngoài đánh giá sinh trƣởng theo tiêu chiều cao cây, sử dụng đồng thời số đƣờng kính gốc để so sánh Sau đo đƣờng kính gốc (D00) đƣờng kính ngang ngực (D1,3) thuộc dòng xoan ta tam bội chuyển gen đối chứng, chúng tơi tính tốn thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.11 bảng 3.12 nhƣ sau: Bảng 3.11 Sinh trƣởng đƣờng kính gốc xoan ta (D00) Tỉ lệ tăng 12 15 tháng tháng tháng tháng tháng tháng (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) ĐC 0,6 2,35 5,49 10,24 12,77 21,03 100 G1 0,96 4,01 7,12 19,66 22,19 43,21 205,47 G3 0,79 3,5 7,01 14,35 19,23 33,87 161,06 G4 0,84 3,88 6,59 17,84 18,94 27,72 131,81 G12 0,89 3,67 6,99 18,12 20,49 30,89 146,89 trƣờng sau 15 tháng (%) Bảng 3.12 Sinh trƣởng đƣờng kính ngang ngực xoan ta (D1,3) tháng 12 tháng 15 tháng Tỉ lệ tăng trƣờng (mm) (mm) (mm) sau 15 tháng (%) ĐC 9,61 12,17 19,54 100 G1 18,87 21,49 39,36 201,43 51 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH G3 13,81 18,87 29,18 149,33 G4 16,76 17,36 23,73 121,44 G12 17,01 19,21 27,55 140,99 Kết cho thấy đƣờng kính gốc đƣờng kính ngang ngực dòng xoan chuyển gen GS1 cao so với đối chứng tính đến thời điểm 15 tháng sau trồng thử nghiệm Về đƣờng kính gốc dòng chuyển gen to gấp 131,81 205,47% so với đối chứng Trong đáng kể đến dòng G1 có tỉ lệ tăng trƣởng đƣờng kính gốc cao (205,47%) đƣờng kính trung bình đạt đƣợc lên tới 43,21 mm Tiếp đến dòng G3 (33.87 mm), dòng G12 (20,49 mm) dòng G4 có đƣờng kính gốc trung bình đến tháng thứ 15 thấp dòng chuyển gen, đạt 27,72 mm nhƣng cao so với đối chứng 6,69 mm Về giá trị đƣờng kính ngang ngực cho kết tƣơng tự nhƣ giá trị đƣờng kính gốc Tuy nhiên tỉ lệ tăng trƣởng so với đối chứng lại thấp đạt 121,44 - 201,43% Đƣờng kính ngang ngực dòng chuyển gen dòng đối chứng có khác biệt đáng kể mang tính thống kê (F>F crit) Sau 15 tháng trồng ngồi vƣờn nhân giống, dòng G1 có đƣờng kính ngang ngực trung bình cao đạt 39,36 mm, lớn đối chứng 19,82 mm (tƣơng đƣơng với 201,43%), dòng chuyển gen G3, G4, G12 lần lƣợt đạt 29,18 mm, 23,73 mm, 27,55 mm cao so với đối chứng (19,54 mm) Từ hai kết đánh giá chiều cao đƣờng kính dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 cho thấy dòng chuyển gen G1, G3, G4, G12 sinh trƣởng vƣợt trội so với đối chứng, dòng G1 G3 có khả sinh trƣởng tốt ổn định so với dòng lại G4, G12 so với đối chứng Kết tƣơng đồng với nghiên cứu trƣớc Gallardo cs năm 1999 52 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH Hình 3.10 Sinh trƣởng dòng xoan ta tam bội A Cây tháng tuối, B Cây tháng tuổi, C Cây tháng tuổi, D Cây 12 tháng tuổi, E Cây 15 tháng tuổi 53 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, rút đƣợc kết luận sau: + Mơi trƣờng thích hợp tạo mơ sẹo xoan ta tam bội in vitro MS + mg/l BAP + mg/l NAA + 20g/l sucrose + g/l aga với tỉ lệ tạo mô sẹo trung bình đạt 87,3% + Mơi trƣờng bổ sung 150 mg/l kháng sinh kanamycin cho hiệu chọn lọc mẫu mô sẹo chuyển gen tối ƣu Hiệu suất chuyển gen vào mô sẹo xoan ta tam bội đạt 5,959% + Môi trƣờng chọn lọc rễ chọn lọc tối ƣu chồi xoan ta tam bội chuyển gen kanamycin nồng độ 75 mg/l (tỉ lệ rễ đạt 32,93%) + Bốn dòng chuyển gen dƣơng tính với kết PCR lai Southern blot gồm: dòng G1, G3, G4 dòng G12 + Sau 15 tháng vƣờn ƣơm, hai dòng chuyển gen G1, G3 có giá trị sinh trƣởng cao cao đối chứng 174,98 - 206,62% giá trị chiều cao vút ngọn, gấp 161,06 - 205,47% giá trị đƣờng kính gốc gấp 149,33 - 201,43% giá trị đƣờng kính ngang ngực KIẾN NGHỊ Với kết thu đƣợc, xin đƣa số hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: + Kéo dài thời gian theo dõi sinh trƣởng dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 dòng đối chứng + Tiến hành đánh giá biểu gen chuyển thông qua kỹ thuật nhƣ RT-PCR hay Western blot 54 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật cải tiến giống trồng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng (tập 2), Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật Nguyễn Việt Cƣờng (2010), Nghiên cứu lai giống nhóm lồi xoan để tạo giống có đặc điểm ưu việt, Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà (2008), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta ( Melia azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, số tr.227-232 Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), “Tạo giống xoan ta (Melia azedarach L.) sinh trƣởng nhanh kỹ thuật chuyển gen”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, 11-14 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Công nghệ gen nông nghiệp, Đại học Nông Lâm - Đại học Huế Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Nguyễn Thị Thơm, Phan Quyền, (2003), Nghiên cứu chọn nhân giống cho xoan ta tếch có suất cao, Trung tâm Nghiên cứu giống rừng Nguyễn Văn Phong (2016), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta in vitro từ chồi xoan ta trội”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn tháng 11/2016, 58-64 10 Nguyễn Đình Sâm (1995), Sinh lý thực vật, Nhà xuất Đại học Lâm nghiệp 11 Bùi Phƣơng Thảo (2007), Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro bạch đàn (Eucalyptus) phục vụ chuyển gen, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Lâm nghiệp Việt Nam 55 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH 12 Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà (2013), “Quy trình chuyển gen vào xoan ta (Melia azedazach L.) Agrobacterium đạt hiệu suất cao”, Tạp chí sinh học, 35(2), 227-233 Tài liệu Tiếng Anh 13 Bauer, D., Biehler K., et al (1997), “A role for cytosolic glutamine synthetase in the remobilization of leaf nitrogen during water stress in tomato”, Physiologia Plantarum, 99 (2), pp 241-248 14 Bernard, S.M and Habash D.Z (2009), “The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling”, New Phytologist, 182 (3), pp 608-620 15 Brugière, N., Dubois F., et al (1999), “Glutamine synthetase in the phloem plays a major role in controlling proline production”, The Plant Cell, 11 (10), pp 1995-2011 16 Cren, M and Hirel B (1999), “Glutamine synthetase in higher plants regulation of gene and protein expression from the organ to the cell”, Plant and Cell Physiology, 40 (12), pp 1187-1193 17 Davies, P.J (1995), Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology, Springer Science & Business Media 18 Edwards, J.W., Walker E.L., and Coruzzi G.M (1990), “Cell-specific expression in transgenic plants reveals nonoverlapping roles for chloroplast and cytosolic glutamine synthetase”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 87 (9), pp 3459-3463 19 Fuentes, S.I., Allen D.J., Ortiz‐Lopez A., and Hernández G (2001), “Over‐ expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations”, Journal of Experimental Botany, 52 (358), pp 10711081 20 Gallardo, F., Fu J., Cantón F.R., García-Gutiérrez A., Cánovas F.M., and Kirby E.G (1999), “Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar”, Planta, 210 (1), pp 19-26 21 Godfrey, R.K (1988), Trees, shrubs, and woody vines of northern Florida and adjacent Georgia and Alabama, University of Georgia Press 22 Hiei, Y., Ohta S., Komari T., and Kumashiro T (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T‐DNA”, The Plant Journal, (2), pp 271-282 23 Hirel, B., Marsolier M.C., et al (1992), “Forcing expression of a soybean root glutamine synthetase gene in tobacco leaves induces a native gene encoding cytosolic enzyme”, Plant molecular biology, 20 (2), pp 207-218 24 Huang, R.C., Tadera K., et al (1996), “Limonoids from Melia azedarach”, Phytochemistry, 43 (3), pp 581-583 56 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH 25 Indieka, S., Odee D., Muluvi G., Rao K., and Machuka J (2007), “Regeneration of Melia volkensii Gürke (Meliaceae) through direct somatic embryogenesis”, New Forests, 34 (1), pp 73-81 26 Ishiyama, K., Inoue E., Watanabe-Takahashi A., Obara M., Yamaya T., and Takahashi H (2004), “Kinetic properties and ammonium-dependent regulation of cytosolic isoenzymes of glutamine synthetase in Arabidopsis”, Journal of Biological Chemistry, 279 (16), pp 16598-16605 27 Kakkar, A and Verma V.K (2011), “Agrobacterium mediated biotransformation”, J Appl Pharm Sci, (7), pp 29-35 28 Lea, P and Miflin B (1980), “Transport and metabolism of asparagine and other nitrogen compounds within the plant”, in Amino Acids and Derivatives, Elsevier, pp 569-607 29 Man, S., Gao W., Wei C., and Liu C (2012), “Anticancer drugs from traditional toxic Chinese medicines”, Phytotherapy Research, 26 (10), pp 14491465 30 Miflin, B.J and Habash D.Z (2002), “The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation and possibilities for improvement in the nitrogen utilization of crops”, Journal of experimental botany, 53 (370), pp 979-987 31 Mroginski, L.A and Rey H.Y (2012), “Micropropagation of paradise tree (Melia azedarach) by in vitro culture of axillary buds”, in Protocols for Micropropagation of Selected Economically-Important Horticultural Plants, Springer, pp 223-230 32 Nakanishi, H (1996), “Fruit color and fruit size of bird-disseminated plants in Japan”, Vegetatio, 123 (2), pp 207-218 33 Nixon, E., Ward J., Fountain E., and Neck J (1991), “Woody vegetation of an old-growth creekbottom forest in north-central Texas”, The Texas journal of science (USA) 34 O'neal, D and Joy K (1973), “Localisation of glutamine synthetase in chloroplasts”, Nature New Biology, 246 (150), pp 61 35 Obara, M., Kajiura M., et al (2001), “Mapping of QTLs associated with cytosolic glutamine synthetase and NADH‐glutamate synthase in rice (Oryza sativa L.)”, Journal of Experimental Botany, 52 (359), pp 1209-1217 36 Oliveira, I.C., Brears T., Knight T.J., Clark A., and Coruzzi G.M (2002), “Overexpression of cytosolic glutamine synthetase Relation to nitrogen, light, and photorespiration”, Plant Physiology, 129 (3), pp 1170-1180 37 Paul, E.A (2014), Soil microbiology, ecology and biochemistry, Academic press 38 Pennington, T.D and Styles B.T (1975), “A generic monograph of the Meliaceae”, Blumea, 22 (3), pp 419-540 39 Sharma, D and Paul Y (2013), “Preliminary and Pharmacological Profile of Melia azedarach L.: An Overview” 57 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH 40 Sharry, S., Cabrera Ponce J.L., Herrera Estrella L., Rangel Cano R.M., Lede S., and Abedini W (2006), “An alternative pathway for plant in vitro regeneration of chinaberry-tree Melia azedarach L derived from the induction of somatic embryogenesis”, Electronic Journal of Biotechnology, (3), pp 0-0 41 Stanford, A.C., Larsen K., Barker D.G., and Cullimore J.V (1993), “Differential expression within the glutamine synthetase gene family of the model legume Medicago truncatula”, Plant Physiology, 103 (1), pp 73-81 42 Tingey, S., Tsai F.-Y., Edwards J., Walker E., and Coruzzi G (1988), “Chloroplast and cytosolic glutamine synthetase are encoded by homologous nuclear genes which are differentially expressed in vivo”, Journal of Biological Chemistry, 263 (20), pp 9651-9657 43 Thomsen, H.C., Eriksson D., Møller I.S., and Schjoerring J.K (2014), “Cytosolic glutamine synthetase: a target for improvement of crop nitrogen use efficiency?”, Trends in Plant Science, 19 (10), pp 656-663 44 Van Thang, B., Van Viet N., Nam V.Q., Tung H.T., and Nhut D.T (2018), “Triploid plant regeneration from immature endosperms of Melia azedazach”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 133 (3), pp 351-357 45 Yang, C.-J., Huang Y.-J., et al (2010), “Antiproliferative effect of Toona sinensis leaf extract on non–small-cell lung cancer”, Translational Research, 155 (6), pp 305-314 46 Yuan, C.-M., Zhang Y., et al (2013), “Cytotoxic limonoids from Melia azedarach”, Planta medica, 29 (02), pp 163-168 58 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH PHỤ LỤC Bảng B1 Nồng độ DNA mẫu chuyển gen GS1 Mẫu G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 Nồng độ DNA (ng/µl) 543,6 619,05 548,7 507,3 549,4 613,9 535,7 OD260nm/OD280nm 2,13 2,09 2,18 2,06 2,11 2,09 2,06 Mẫu G8 G9 G10 G11 G12 G13 G14 Nồng độ DNA (ng/µl) 668,7 476,5 559,4 507,2 642,3 612,2 508,6 OD260nm/OD280nm 2,11 2,15 2,07 2,06 2,05 2,08 2,06 Mẫu G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 Nồng độ DNA (ng/µl) 678,4 528,8 509,2 521,6 577,3 604,9 624,8 OD260nm/OD280nm 2,11 2,09 2,13 2,07 2,11 2,16 2,07 Mẫu G22 G23 G24 G25 G26 G27 G28 Nồng độ DNA (ng/µl) 476,3 523, 546,2 701,4 607,8 546,3 527,6 OD260nm/OD280nm 2,21 2,17 2,04 2,06 2,12 2,14 2,05 Mẫu G29 G30 G31 G32 G33 G34 G35 Nồng độ DNA (ng/µl) 621,8 528,9 542,6 369,7 429,4 518,6 561,4 OD260nm/OD280nm 2,07 2,08 2,06 2,11 2,08 2,13 2,15 Mẫu Nồng độ DNA (ng/µl) G36 G37 G38 G39 G40 G41 G42 501,3 439,6 548,7 528,3 458,3 627,5 456,6 OD260nm/OD280nm 2,08 2,12 2,15 2,09 2,17 2,08 2,14 Mẫu G43 G44 G45 Nồng độ DNA (ng/µl) 534,7 547,5 612,4 OD260nm/OD280nm 2,13 2,12 2,24 59 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH ảng B2 ảng xử lý số liệu nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp NAA AP đến khả tạo mô sẹo xoan ta tam bội Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance ĐC 3 0 208 69,33333 1,333333 3 166 55,33333 1,333333 188 62,66667 1,333333 206 68,66667 5,333333 232 77,33333 1,333333 3 262 87,33333 1,333333 228 76 214 71,33333 5,333333 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 15408 42,66667 18 Total 15450,67 26 SS df MS F 1926 812,5313 P-value F crit 2,04E-21 2,510158 2,37037 Bảng B3 Bảng xử lý số liệu ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến khả sống mô sẹo lần Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count ĐC Sum Average Variance 100 300 284 94,66667 5,333333 258 86 3 240 80 60 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH 206 68,66667 1,333333 138 ANOVA Source of Variation Between Groups SS df MS F 3565,968 693,3827 72 Total 16 1,333333 5,333333 21395,81 Within Groups 46 P-value F crit 1,71E-16 2,847726 14 5,142857 21467,81 20 Bảng B4 Bảng xử lý số liệu ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến khả sống mô sẹo lần Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC Count 3 3 3 3 Sum 300 250 210 182 62 40 Average 100 83,33333 70 60,66667 20,66667 13,33333 Variance 9,333333 9,333333 9,333333 1,333333 MS F ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 26487,62 66,66667 4414,603 927,0667 14 4,761905 Total 26554,29 20 SS df P-value F crit 2,25E-17 2,847726 Bảng B5 Bảng xử lý số liệu ảnh hƣởng nồng độ kanamycin đến khả sống mô sẹo lần Anova: Single Factor 61 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH SUMMARY Groups ĐC Count 3 3 3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 29596,95 40 Total 29636,95 Sum Average Variance 300 100 230 76,66667 5,333333 160 53,33333 1,333333 82 27,33333 9,333333 0 0 0 df MS F 4932,825 1726,489 14 2,857143 P-value F crit 2,93E-19 2,847726 20 Bảng B6 Đánh giá ảnh hƣởng hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả rễ chồi xoan ta tam bội không chuyển gen Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 25 50 75 100 3 3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 23090 233,3333 Total 23323,33 Sum Average Variance 295 98,33333 8,333333 240 80 25 145 48,33333 58,33333 15 25 0 df MS F 5772,5 247,3929 10 23,33333 P-value 5,96E-10 F crit 3,47805 14 Bảng B7 Ảnh hƣởng thành phần giá thể đến tỉ lệ sống dòng xoan ta tam bội 62 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count GT1 GT2 GT3 GT4 ANOVA Source of Variation Sum Average Variance 3 32 10,66666667 200 66,66666667 110 36,66666667 2,333333333 25,33333333 2,333333333 149 49,66666667 16,33333333 SS df Between Groups Within Groups 5018,25 92,66666667 Total 5110,916667 MS F 1672,75 11,58333333 144,4100719 P-value F 2,64E07 4,0 11 Bảng B8 Sinh trƣởng chiều cao dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY ĐC G1 G3 G4 G12 Count 12 15 ANOVA Source of Variation SS 6 6 Sum 627,0517 1166,365 1008,535 917,2 987,1467 Average 104,5086 194,3942 168,0892 152,8667 164,5244 5 5 5 46,97375 9,39475 3,776747 86,625 17,325 19,63713 489,6833 97,93667 349,4254 913,6073 182,7215 1290,1 1399,259 279,8519 4378,825 1770,15 354,03 5403,674 df MS Variance 8756,638 31005,78 24215,77 17653,34 21664,3 F P-value F crit 63 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH Rows Columns Error 26101,62 496799 19680,13 6525,405 6,631464 0,001444 2,866081 99359,8 100,9747 1,74E-13 2,71089 20 984,0067 Total 542580,8 29 Bảng B9 Sinh trƣởng đƣờng kính gốc dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY ĐC G1 G3 G4 G12 Count 6 6 6 12 15 Sum Average Variance 52,48 8,746667 57,43779 97,15 16,19167 248,1383 78,75 13,125 150,2626 75,81 12,635 109,3433 81,05 13,50833 134,1275 4,08 17,41 33,2 80,21 93,62 156,72 ANOVA Source of Variation Rows Columns Error SS 171,3537 3289,305 207,2418 Total 3667,901 0,816 0,01853 3,482 0,43857 6,64 0,4537 16,042 14,29172 18,724 12,72118 31,344 66,72518 df MS F P-value F crit 42,83844 4,134151 0,013348 2,866081 657,861 63,4873 1,4E-11 2,71089 20 10,36209 29 Bảng B10 Sinh trƣởng đƣờng kính ngang ngực dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY ĐC G1 G3 Count 3 Sum Average Variance 41,32 13,77333 26,57923 79,72 26,57333 124,3402 61,86 20,62 61,3561 64 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH G4 G12 3 12 15 57,85 19,28333 14,91963 63,77 21,25667 30,91453 76,06 89,1 139,36 ANOVA Source of Variation Rows Columns Error SS 252,0099 446,8666 69,35285 Total 768,2294 df 15,212 13,08952 17,82 12,1594 27,872 55,09177 MS F P-value F crit 63,00248 7,26747 0,008973 3,837853 223,4333 25,77351 0,000326 4,45897 8,669107 14 65 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.2016.T.CH ... KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KHÁNH HÕA NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHUYỂN GEN GS1 VÀO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH) TAM BỘI BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... in vitro phục vụ nhân giống vơ tính, chọn lọc biến dị Chính lí này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen GS1 vào xoan ta (Melia azedarach) tam bội vi khuẩn Agrobacterium. .. tạo giống xoan ta 1.2.1 Các nghiên cứu xoan ta giới 1.2.2 Các nghiên cứu đối tƣợng xoan ta Vi t Nam .6 1.3 Kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens