Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ sinh học Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bông vải (Gossypium hirsutum.L) là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thoả

mãn một trong những nhu cầu bức thiết của con người là mặc, đồng thời cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai trên thế giới sau cây đậu tương (Nobre và ctv, 2001) Cây bông vải được trồng khắp nơi trên thế giới Trong các nước trồng bông vải thì Ấn Độ là nước sản xuất bông vải lớn nhất, đứng đầu về diện tích (khoảng 9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế đến là Mỹ chiếm 24% và Trung Quốc chiếm 20% diện tích trồng bông vải toàn cầu (Satyavathi và ctv, 2002)

Ở Việt Nam nghề trồng bông vải có từ ngàn xưa và từng là loại cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Trung Bộ trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp Sau năm 1975, nhà nước ta nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bông ở đây nhưng không thành công do giá cả thị trường bấp bênh và không phòng trừ được sậu đục quả bông một cách hiệu quả dẫn đến người trồng bông thua lỗ, diện tích trồng bông không thể phát triển được

Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học và công nghệ đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu và có năng suất cao để đưa vào sản xuất Tuy nhiên sản lượng bông xơ chỉ đáp ứng một phần nhỏ (10 - 15%) nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt may Dự kiến đến năm 2010, sản lượng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nước, đưa diện tích trồng bông tăng lên 1 triệu ha, tập trung ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng Bằng Sông Cửu Long ( Bộ Nông Nghiệp và PTNT, 2003)

Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di truyền của các loài cây bông vải Mặc dù có nhiều giống bông vải tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống, nhưng dường như các giống bông đó khó có thể khai thác được các nguồn gen có lợi một cách hiệu quả Việc ứng dụng công nghệ di truyền thực vật có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống cây bông có nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nông học như tính kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều kiện bất lợi của môi trường (rét, khô hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lượng cũng như chất lượng của bông và sợi (Gasser và Fraley, 1992)

Trong thập kỷ qua, các nổ lực nghiên cứu chuyên sâu đã từng tập trung trên cây bông vải và các gen quy định các đặc tính nông học tốt đã được chuyển nạp bằng phương pháp

chuyển gen nhờ Agrobacterium (Perlak và ctv, 1990; Thomas và ctv, 1995; Satyavathi và

ctv, 2000) Cây bông vải đã được xem là cây khó có thể chuyển nạp gen và chỉ sau khi các giống nhóm bông vải Coker được phát hiện là đáp ứng tốt cho sự chuyển nạp gen (Nobre và ctv, 2001) thì các gen mong muốn đều được chuyển vào nhóm giống này và sau đó hồi giao với các giống bông khác Ngoài sự giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô sẹo có hình thái dị thường do biến dị soma cho nên sự cải tiến phương pháp nuôi cấy để tạo ra hệ thống tái sinh hiệu quả là cần thiết Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống và các kỹ thuật công nghệ sinh học tiến bộ gần đây (bao gồm các quy trình nuôi cấy mô và chuyển nạp gen) đã và đang được ứng dụng vào việc chọn tạo giống bông vải (Nobre và ctv, 2001)

Trong chuyển nạp gen ở cây trồng, hệ thống thanh lọc cây biến đổi gen thông dụng nhất là sử dụng thuốc kháng sinh và thuốc diệt cỏ (Christou, 1997) Việc sử dụng các hệ thống chọn lọc này gây nhiều lo ngại về tính an toàn của cây trồng biến đổi gen đối với con người và môi trường Nhằm khắc phục vấn đề này, phương pháp chọn lọc mới thộng qua thanh lọc bằng đường mannose được áp dụng Hệ thống thanh lọc này dựa trên enzyme

phosphomannose isomerase mã hoá bởi gen pmi được phân lập từ vi khuẩn E coli Enzyme

này đóng vai trò trong việc chuyển hóa đường mannose làm nguồn carbon cho các hoạt động biến dưỡng trong sinh vật và các tế bào thực vật biến đổi gen (Hoa và Bong, 2003)

Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chưa được thực hiện thành công và việc chuyển gen chỉ được thực hiện bằng vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001) Phương pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhưng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây không được hoàn toàn, tạo ra các thể khảm gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này Sự thu nhận cây chuyển gen tái sinh qua con đường sinh phôi thể hệ từ các tế bào sinh phôi là các phương pháp được ưu chuộng hiện nay (Chen và ctv, 2000)

Cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu khả năng

chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các giống bông vải đang trồng ở Việt Nam Vì vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của

ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ” là một

vấn đề cần thiết

1.2 Mục tiêu của khóa luận

Tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P

bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hệ thống chọn lọc bằng

mannose để thanh lọc mô sẹo sau khi được chuyển nạp

1.3 Hạn chế của khóa luận

Do thời gian thực hiện ngắn nên khóa luận chỉ thực hiện xong giai đoạn thanh lọc (qua 3 vòng) mô sẹo đã được chuyển nạp gen trên hai giống Coker312 và VN36P Giai

đoạn thử nghiệm sự biểu hiện gen chỉ thị gus (β-glucuronidase) tạm thời các mô sẹo đã qua

thanh lọc chưa có điều kiện thực hiện

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây bông vải 2.1.1 Vị trí phân loại

Cây bông vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Hộ, 1997)

2.1.2 Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố

Chi Gossypium rất đa dạng, có 39 loài, trong đó có 5 loài được trồng phổ biến trên thế giới (Hộ, 1997), và có 3 loài được trồng ở Việt Nam: G arboreum, G hirsutum, G barbadense

2.1.2.1 Gossypium arboreum

Loài G arboretum (loài bông Cỏ) có nguồn gốc từ châu Á, có mặt và gắn liền với

nghề trồng bông ở nước ta từ lâu Các giống bông Cỏ có dạng hình thoáng, thân mảnh, lá nhỏ, lông ít, rễ cộc nhỏ với bộ rễ ăn nông, chịu được mưa, cuống quả dài rủ xuống, đầu quả quay xuống đất, vỏ quả mỏng, chín sớm, hạn chế được hiện tượng thối quả khi gặp mưa lúc bông nở Về phẩm chất xơ bông Cỏ : thô, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn kém Trong khoảng thế kỷ XIII – XIV, loài bông này được trồng phổ biến khắp mọi miền đất nước Các giống bông

Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc 2 loài phụ: G arboreum ssp neglectum và G.arboreum ssp

nanking (Lê Quang Quyến, 2004)

2.1.2.2 Gossypium hirsutum

Loài Gossypium hirsutum (loài bông Luồi) thường là cây hàng năm, cây cao, lá to,

mặt lá phẳng Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả tròn, mặt quả nhẵn, trọng lượng hạt

bông trung bình trong một quả đạt 5 - 6g Loài G hirsutum xuất xứ từ Trung Mỹ, du nhập

vào Việt Nam khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX Loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp với đều kiện trồng nhờ nước trời ở nước ta, với tiềm năng cho năng suất cao và có chất lương xơ tốt, các giống bông này dần thay thế các giống bông Cỏ trước đó Bông Luồi được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Nga, Ấn Độ, Mêhico, Trung Quốc, Braxin… Bông Luồi

có nhiều loài phụ như : G.hirsutum ssp Mexicanum, G.hirsutum ssp punctatum, G.hirsutum ssp panicultum…

2.1.2.3 Gossypium barbadense

Loài Gossypium barbadense còn gọi là bông Hải Đảo, cây tương đối to, chín muộn,

lá to, khía sâu, màu xanh đậm Thân cành lá gần như không có lông, đài không có răng cưa rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sóng Hạt thường nhẵn, không có xơ ngắn, xơ dài màu

trắng hoặc cà phê sữa Loài G barbadense có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay được trồng nhiều

ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nước khác Loài này thường gặp dưới dạng cây bông lâu năm ở trong các vườn hoang và bờ dậu Bông Hải Đảo chỉ thích hợp trong vụ khô có tưới, không

thích hợp với đều kiện mưa nhiều, độ ẩm cao Bông Hải Đảo có nhiều loài phụ như: G barbadense ssp darwinii, G barbadense ssp ruderale, G barbadense ssp ventiforlum

Hiện nay loài này được nghiên cứu trong chương trình tạo giống bông lai giữa bông Luồi với bông Hải Đảo nhằm mục đích khai thác khả năng cho năng suất cao của bông Luồi kết hợp với chất lượng xơ tốt của bông Hải Đảo

2.1.2.4 Gossypium herbaceum

Loài này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khô nóng như vùng Trung Á, Tây Bắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam

2.1.2.5 Gossypium tricuspidatum

Loài này khá giống loài G hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và mịn Loài

này đòi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh khá và được trồng nhiều ở Nam Mỹ Loài bông này không có ở Việt Nam

2.1.3 Tình hình sản xuất bông vải ở Việt Nam

Trước thời Pháp thuộc, giống bông vải được sử dụng chủ yếu là các giống bông Cỏ

địa phương (Gossypium arboreum) Giống bông này cho năng suất thấp Một số ít diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã được trồng các giống bông Luồi (Gossypium hirsutum) nhập nội

với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha Đầu thế kỷ 20, nước ta đã xuất khẩu bông sang Nhật, Hồng Kông Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bông đã được phát triển mạnh, trong đó liên khu V đạt khoảng 10000 ha và liên khu IV đạt khoảng 13000 ha

Sau năm 1954, các giống bông Luồi nhập nội được thay thế một phần cho giống bông Cỏ địa phương Sau ngày đất nước thống nhất, xuất phát từ nhu cầu cấp thiết về nguyên liệu bông xơ cho ngành Dệt May, Đảng và nhà nước ta có chủ trương đẩy mạnh việc phát triển cây bông ở vùng Duyên hải Miền Trung và Tây Nguyên Tuy nhiên việc phát triển bông theo kế hoạch không thưc hiện được do:

i Tổ chức sản xuất trên cơ sở kế hoạch tập trung giao cho Hợp tác xã Nông nghiệp và các Nông trường quốc doanh, theo cơ chế bao cấp, kém năng động, nên không phát huy hết sức mạnh và nguồn lực toàn dân

ii Sâu bệnh gây hại ở tất cả các vùng trồng bông, mùa khô không đủ nước tưới, dẫn đến người trồng bông thua lỗ, các nông trường bị giải thể, diện tích bông không thể phát triển được

iii Chưa có giống bông phù hợp với từng đều kiện sinh thái và kháng sâu bệnh Chưa có hệ thống cơ sở hạ tầng cho việc phát triển bông, như hệ thống thuỷ lợi đồng bộ ( Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004.)

Sau năm 1990, Nhà nước ta chủ trương phát triển bông dựa vào các hộ nông dân, nền sản xuất bông chuyển hướng từ tập trung sang phân tán trong đều kiện mùa mưa nhờ nước tưới trời nhằm giảm áp lực sâu hại, do đó diện tích bông được nhanh chóng mở rộng và năng suất được nâng lên bình quân khoảng 7- 8 tạ/ha (Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004)

Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bước thay đổi mạnh mẽ, chúng ta đã tạo được các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất cao, chất lượng xơ tốt, chống chịu được sâu bệnh Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật được áp dụng như: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác như hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE cho bông, phun các chất đều hòa tăng trưởng… chính vì vậy mà năng suất và chất lượng bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao Hiện nay, diện tích đã đạt hơn 35000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trước đây (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam trong những năm qua (Nguồn: Lê Quang Quyến, 2004)

Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn) 1996/1997

1997/1998 1998/1999 1999/2000 2000/2001 2001/2002 2002/2003

10676 11716 19963 17705 13250 29573 35200

6 9 8 10

9 11 10,5

6866 10986 16245 17578 20340 32530 36960

2.1.4 Tình hình sản xuất bông trên thế giới

Vụ bông 2001- 2002 tổng diện tích bông trên thế giới là 33,457 triệu ha, trong đó các nước đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nước phát triển chỉ chiếm có 30% diện tích Trong mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới (Bảng 2.2), thì Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và

Pakistan 3,1 triệu ha (ISAAA, 2002)

Sản lượng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960/1961 lên 21,2 triệu tấn niên vụ 2001/2002 Trong mười nước có sản lượng bông lớn nhất thế giới (bảng 2.3) thì Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn Điều đặc biệt là trong mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới thì có sáu nước là các nước đang phát triển Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1658 kg bông xơ/ha, tiếp theo là Syria 1303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1103 kg bông xơ/ha (ISAAA, 2002)

Trong khi đó, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng Diện tích trồng bông trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha, trong đó bông chuyển gen chiếm 28% So với năm 2003 diện tích bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003) Trong số các nước trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nước có diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003) Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bông chuyển gen nhưng năm 2004 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha Trung Quốc cũng là nước có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 có 2,8 triệu ha nhưng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bông) Theo dự báo của các chuyên gia thì diện tích trồng

bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hướng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu (James, 2004)

Bảng 2.2 Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002 (ISAAA, 2002)

Diện tích trồng bông của thế giới 33,457

Nguồn: ICAC, 2002 (http://www.isaaa.org/)

Bảng 2.3 Mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002 (ISAAA, 2002)

2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển nạp gen khác nhau nhưng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù (McCabe và Martinell, 1993; Rajasekaran và ctv, 2000), phương pháp

chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens (Umbeck và ctv, 1987;

Rajasekaran và ctv, 1996; Satyavathi và ctv, 2002)

Chuyển nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải thành công đã được công

bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv, 1987; Umbeck và ctv, 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp Từ đó nhiều gen được chuyển thành công vào cây bông

nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng và gen kháng

thuốc diệt cỏ (Perlak và ctv, 1990; Chen và ctv, 1994) Các loại mẫu cấy như trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng như phôi non đã được dùng trong việc chuyển

gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv, 1987;

Perlak và ctv, 1990) Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã được sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv, 1995)

Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, khoảng 20 - 30% khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996) Một hiệu quả chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã được công bố khi trụ hạ diệp được dùng làm

mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng

làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv, 1987) Nhưng chỉ là kết quả của sự thử nghiệm sự biểu

hiện gen tạm thời của gen onc Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp gen ở

song tử diệp chỉ khoảng 20 -30% (Cousins và ctv,1991), hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp khi sử dụng phương pháp bắn gen (Keller và ctv, 1997 Sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen có thể ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu quả của chuyển nạp gen và sự tái sinh, một số nhà nghiên cứu cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv, 1987) Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả

chuyển nạp gen trên cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy các

yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen Thêm vào đó kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trường chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001)

Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp như giống bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thường khó có thể tái sinh và chuyển nạp được Thiếu phương pháp tái sinh cây hiệu quả cũng được xem như là một rào cản chính cho việc áp dụng phương pháp

chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv, 1987) Để cải

tiến phương pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy được phát triển, cùng với môi trường nuôi cấy được cải tiến thích hợp Hiện nay, Trung Quốc đã thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhưng phương pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây được tạo thành nhưng chỉ một số ít cây được chuyển nạp gen (Chen và ctv, 2000)

2.3 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti,

thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen

còn được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A radiobacter ( loài nay không gây bệnh cho cây), A tumefaciens và A rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ… (Jiang, 2004)

Hình 2.1 Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật A: một khối

u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv, 2005).

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005) Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, vi

khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29oC trong môi trường có bổ sung mangan và succinate

như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999) Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây

bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây Bộ nhiễm sắc thể

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6Mb Ngoài ra vi khuẩn

còn mang plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005) Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó là Plasmid Ti Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu được tìm thấy ở gốc cây Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ Các khối u có đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5 – 10 cm Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon

2.3.2 Ti-plamid

Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn Việc xác định Plasmid Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một

giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens Điều này đã mở ra khả

năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các hormon

thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho

việc tiêu hoá opine Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T-

DNA và gen vir (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002)

2.3.2.1 Chức năng của T-DNA

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb, trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (Gelvin, 2003) Trong Plasmid

Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái Trình tự nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25bp (Gelvin, 2003) Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến dần về phía trái Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Gelvin, 2003; Zhu và ctv, 2000)

T-DNA mã hóa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng

bên ngoài Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin) Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết

isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl Hai gen

trên T-DNA khác được cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b) Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv,1991) Trong khi đó gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích (Tinland và ctv, 1992) Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u

khác

Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn, đó là các opine Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid hoặc một đường (Dessaux và ctv, 1998) Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opine Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp từ khối u Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn

Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine

Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine

chuyên biệt (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985) Gen ocs mã hóa cho

octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được

phát hiện trong các khối u (Dessaux và ctv, 1998) Sản phẩm của gen mas2’ được cho là

làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng

minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic acid Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine

thành agropine Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic acid (Dessaux và ctv, 1998) Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine

2.3.2.2 Chức năng của các gen vir

Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp (Riva và ctv, 1998) Những gen vir này mã hoá cho các vai

trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn T-DNA, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ

Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua dấu hiệu

hoá học tiết từ vết thương Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để làm kích hoạt các gen độc

khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết Gen vir được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự

hiện diện của các hợp chất phenol như là acetosyringone (AS), chất mà được giải phóng khi

tế bào cây bị tổn thương (Ziemienowicz, 2001) Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên

protein nằm trong màng tế bào, protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương của cây VirA có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino acid (Zhu và ctv, 2000; Ziemienowicz, 2001) Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi aspartic acid còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv, 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen

vir Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12bp trong trình tự “vir box” (Winans

và ctv, 1987)

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn DNA trong vi khuẩn và đưa sợi đơn DNA vào trong tế bào cây Các protein được mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức

năng tạo ra phức hợp DNA Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T-DNA Protein VirD2 được tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ vai ở vị trí tương đồng (Zupan và ctv, 1996; Deng và ctv,1998) Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn DNA , nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của

T-các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998), protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp

thúc đẩy sự hấp thu phức hợp T-DNA vào nhân Hai sản phẩm của gen vir khác cũng được

cho là có chức năng trong việc tạo gia công T-DNA là: VirC1 và VirC2 VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003) Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo sợi đơn T-DNA nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000) Ngoài ra, Protein VirD2 được cho là có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001)

Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột

biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998) Các protein VirB đều khiển tạo chiên mao và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện (Zhu và ctv, 2000)

Hình 2.2 Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000)

2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ

cây Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học Đều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Plasmid Ti sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7 M) Bởi vậy, một trong những chức năng của Plasmid Ti là mã hoá các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm Ở nồng độ cao (10-5

– 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên

Plasmid Ti (Valentine, 2003 )

Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA Quá

trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và

VirD2 thực hiện Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn DNA để tạo thành phức hợp DNA Phức hợp T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 được chuyển vào trong tế bào cây

T-thông qua hệ thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen virB Cùng với một số thành phần

trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào

trong nhân tế bào (Valentine, 2003 )

Hình 2.3 Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (Valentine, 2003 )

Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào Sau đó nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tương đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự hòa hợp của T-DNA hoàn thành Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho

vi khuẩn (Valentine, 2003 )

Hình 2.4 Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây

(Valentine, 2003 )

CHƯƠNG 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P

bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi và gen gus để xây dựng quy trình chuyển nạp gen với hệ thống thanh lọc

bằng mannose đối với cây bông vải

3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: khóa luận được thực hiện từ ngày 21/03/2005 đến ngày 31/07/2005

Địa điểm: khóa luận được thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, huyện Cờ Đỏ, TP Cần Thơ

3.3 Vật liệu nghiên cứu

Giống bông vải Coker 312 và VN36P Hạt bông vải tự thụ được thu từ cây bông vải trồng ở nhà lưới của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

Mẫu cấy: trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi

Dụng cụ, thiết bị, hoá chất ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục 7)

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy

Hạt của các giống bông vải được đốt lớp xơ bao quanh bằng axit sunfurit đậm đặc (H2SO4 98%), rồi rửa dưới vòi nước máy nhiều lần cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C khoảng 48 giờ để đạt độ ẩm 14%

Sau khi sấy, hạt được khử trùng bề mặt với cồn 700

trong 2 phút rồi rửa bằng nước cất vô trùng (3 lần), tiếp theo hột được khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) có vài giọt Tween 20, lắc ở tốc độ 100 vòng/phút thực hiện 2 lần mỗi lần 10 phút (giữa 2 lần khử trùng bằng HgCl2 có rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng), sau đó hạt được rửa nhiều lần với nước cất vô trùng (6 lần) rồi được bảo hoà qua đêm trong nước cất

Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% có vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút) Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 - 290C, độ ẩm tương đối bằng 50%

Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm

làm nguồn vật liệu thí nghiệm Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy, các

trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen

Hình 3.1 Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nảy mầm

Hình 3.2 Cây mần in vitro 5 ngày tuổi

3.4.2 Quy trình chuyển nạp gen 3.4.2.1 Nguồn plasmid

Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003)

mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404

Trên môi trường đặc ABG (phụ lục 4) chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuôi cấy trong 3ml môi trường lỏng YEP (An và ctv, 1988) có bổ sung 50mg/l kanamycin và nuôi qua đêm (24-28 giờ) ở 280C trên máy lắc với tốc độ 200vòng/phút Sau khi nuôi cấy 24-28 giờ, cấy chuyền sang 50 ml môi trường YEP (phụ lục 5) có kanamycin 50mg/l và nuôi cấy khoảng 16- 18 giờ ở 280C, lắc 200 vòng/phút đến khi OD600 đạt khoảng 0,5 - 1

3.4.2.3 Lây nhiễm (đồng nuôi cấy)

Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv, 2000 (US Patent số: WO 00/77230 A1) với một vài thay đổi: OD600 pha loãng là 0,5, thời gian ngâm mẫu trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây nhiễm trên môi trường không có giấy thấm (Chen và ctv tiến hành thí nghiệm với OD600 pha loãng là 0,3, thời gian 5 phút và lây nhiễm trên môi trường có giấy thấm)