Khảo sát khả năng biến nạp gen GmCHS7 vào đậu tương (glycine max (l ) merrill) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN QUỐC BẢO KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BIẾN NẠP GEN GmCHS7 VÀO ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Đức Long Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng công bố công trình khác Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Trần Quốc Bảo LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng – Giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp hướng dẫn tận tình giúp đỡ trình thực hoàn thành luận văn thạc sỹ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Đức Long – Giảng viên Bộ môn Di truyền học – Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc Gia Hà Nội, giúp đỡ đóng góp ý kiến tận tình để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ , ý kiến đóng góp , hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Anh Vũ – Cán Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn tới bố mẹ, anh chị bạn bè, người mà quan tâm, ủng hộ chỗ dựa cho suốt thời gian làm luận văn này, sống Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2015 Học viên Trần Quốc Bảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, vai trò vị trí đậu tương hệ thống trồng 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Tầm quan trọng đậu tương 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.1.4 Đặc tính chống chịu hạn đậu tương 1.2 Vi khuẩn A tumefaciens phương pháp biến nạp gen thực vật 1.2.1 Cấu trúc chức Ti – plasmid 10 1.2.2 Cấu trúc chức đoạn T – DNA 11 1.2.3 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 12 1.2.4 Tương tác T - DNA genome tế bào thực vật 13 1.2.5 Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 15 1.2.6 Gen thị chọn lọc sàng lọc 17 1.3 Gen liên quan đến khả chịu hạn gen GmCHS7 19 1.3.1 Khái quát gen liên quan đến khả chịu hạn 19 1.3.2 Gen GmCHS7 21 1.4 Phương pháp chuyển gen đậu tương 22 1.4.1 Sử dụng súng bắn gen 22 1.4.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23 1.5 Tình hình sản xuất đậu tương biến đổi gen 27 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Vật liệu thực vật 29 2.1.2 Vật liệu di truyền 31 2.1.3 Các thiết bị dụng cụ thí nghiệm 31 2.1.4 Hóa chất 32 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương 32 2.2.2 Sàng lọc, phân tích chuyển gen 35 2.3 Xử lý số liệu 42 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Đánh giá khả cảm ứng tạo chồi đặc tính đa chồi giống đậu tương nghiên cứu 44 3.2 Đánh giá khả sống sót kéo dài chồi môi trường chọn lọc giống đậu tương 45 3.3 Đánh giá hiệu biến nạp gen GmCHS7 vào giống đậu tương chọn lọc 48 3.3.1 Đánh giá hiệu chuyển gen thông qua biểu gen bar 48 3.3.2 Kết PCR với cặp mồi đặc hiệu gen GmCHS7 51 3.4 Kết phân tích Southern blot hiệu chuyển gen GmCHS7 53 3.5 Phân tích khả phân ly gen GmCHS7 hệ T1 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 Kết luận 61 Đề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều giới năm 2013 Bảng 1.2 Sản lượng diện tích đậu tương Việt Nam từ 2011 – 2015 Bảng 1.3 Một số gen thị chọn lọc (selectable marker genes) 18 Bảng 1.4 Một số gen thị sàng lọc (screenable marker genes) 19 Bảng 2.1.Hóa chất sử dụng phân tích Southern blot 37 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích 25 µl 38 Bảng 3.2 Kết theo dõi khả sống sót môi trường có chất chọn lọc giống đậu tương 46 Bảng 3.3 Biểu đậu tương sau lần phun Basta 49 Bảng 3.4 Kết phân tích PCR có biểu kháng với Basta 52 Bảng 3.5 Hiệu chuyển GmCHS7 vào giống đậu tương ĐT22 hệ T0 55 Bảng 3.6 Kết phun Basta phân tích PCR dòng đậu tương hệ T1 56 Bảng 3.7 Tỷ lệ phân ly dòng đậu tương giống ĐT22 hệ T1 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Diện tích trồng sản lượng đậu tương Việt Nam (2011 - 2015) Hình 1.2 Bản đồ Ti - plasmid 11 Hình 1.3 Cấu trúc T – DNA 12 Hình 1.4 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 13 Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 16 Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 17 Hình 2.1 Sơ đồ vector pZY101 - 35S 31 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình biến nạp tái sinh đậu tương từ nốt mầm 33 Hình 3.1 Chồi tái sinh kéo dài môi trường SEM giống ĐT22 47 Hình 3.2 Chồi đậu tương môi trường rễ 48 Hình 3.3 Biểu đậu tương sau phun Basta 49 Hình 3.4 Biểu đậu tương sau phun Basta 50 Hình 3.5 Kết điện di DNA tổng số T0 giống ĐT22 51 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR gen GmCSH7 dòng giống đậu tương ĐT22 hệ T0 52 Hình 3.7 Kết điện di DNA tổng số kết lai Southern blot dòng đậu tương ĐT22 hệ T0 54 Hình 3.8 Các dòng đậu tương giống ĐT22 mang gen GmCHS7 hệ T1 57 Hình 3.9 Biểu dòng đậu tương giống ĐT22 mang gen GmCHS7 hệ T1 sau phun Basta 57 Hình 3.10 Biểu dòng đậu tương giống ĐT22 mang gen GmCHS7 hệ T1 sau phun Basta 58 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR gen GmCHS7 số dòng 58 giống đậu tương ĐT22 hệ T1 58 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm PCR gen GmCHS7 số dòng giống 59 đậu tương ĐT22 hệ T1 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A tumefacien: Agrobacterium tumefaciens AS : Acetosyringone BAP : - Benzylaminopurine bp : base pair (cặp bazơ) Bar : gen kháng thuốc diệt cỏ Phosphinothricin (PPT) CCM : Co – cultivation medium (môi trường đồng nuôi cấy) DNA : Deoxyribo Nucleic Acid EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Et - Br : Ethidium Bromide GM : Germination medium (môi trường nảy mầm) NAA : α - Napthalene acetic acid MS : Murashige and Skoog, 1962 PCR : Polymerase Chain Reaction RM : Root medium (môi trường rễ) OD : Optical Density (mật độ quang học) SIM : Shoot induction medium (môi trường tạo chồi) SEM : Shoot elongation medium (môi trường kéo dài chồi) TAE : Tris - Acetate- EDTA TE : Tris - EDTA T - DNA : Transfer DNA (ADN chuyển) Ti - Plasmid : Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR : Virulence region (vùng gây độc có khả tạo khối u) 2,4 - D : Dichlorophenoxy acetic acid & cs : cộng MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) trồng có vị trí quan trọng Việt Nam, nhiều nước giới Với giá trị dinh dưỡng cao, hạt đậu tương sử dụng làm thực phẩm giàu đạm chất béo cho người, chế biến thức ăn chăn nuôi, cung cấp nguyên liệu cho ngành chế biến dầu thực vật số ngành công nghiệp khác [2] Ngoài đậu tương trồng lý tưởng hệ thống luân canh có khả cố định Nitơ khí thông qua nốt sần rễ khả cải tạo đất tơi xốp Theo số liệu Tổng cục Thống kê Việt Nam 2014, diện tích đậu tương nước ta đạt khoảng 117.000 với suất bình quân 1,43 tấn/ha tổng sản lượng đạt 176,4 ngàn Sản lượng sản xuất chưa đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước, hàng năm nước ta phải nhập khối lượng đậu tương lớn [12] Những năm gần người phải đối mặt với biến đổi khí hậu toàn cầu Sự thiếu hụt nước trầm trọng, diễn biến phức tạp khí hậu hạn hán, mưa lũ,… với gia tăng dịch hại tác động không nhỏ đến sinh trưởng, phát triển làm giảm suất trồng nói chung đậu tương nói riêng Để tăng sản lượng đậu tương, mở rộng thêm diện tích cấu luân canh, tăng suất giải pháp Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen tiến quan trọng ngành trồng đậu tương giới nay, với diện tích đậu tương biến đổi gen giới năm 2014 lên đến khoảng 94 triệu [40] Gần phủ Việt Nam quan tâm đầu tư phát triển ngành công nghệ cao công nghệ sinh học xem ngành công nghệ mũi nhọn tương lai Ở nước ta dần tiếp cận ứng dụng công nghệ để tăng suất đậu tương tạo số đặc tính hữu ích khác Sử dụng phương pháp chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn A tumefaciens để chọn tạo giống đậu tương cho suất, chất lượng cao, có khả chống chịu tốt với điều kiện bất thuận môi trường mục tiêu quan tâm nhiều nhà khoa học Việc tạo giống đậu tương biến đổi gen từ giống đậu tương trồng Việt Nam đòi hỏi nghiên cứu tiến hành có hệ thống, việc đánh giá khả đáp ứng giống chuyển nạp gen cần thiết Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành thực nghiên cứu đề tài “Khảo sát khả biến nạp gen GmCHS7 vào đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn A tumefaciens” Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu chuyển gen GmCHS7 vào số giống đậu tương Việt Nam (ĐT22, DT84, DT2001, DT99, MTĐ176) xác định hiệu chuyển gen giống đậu tương đưa vào nghiên cứu - Tạo dòng đậu tương có mang gen GmCHS7 cho nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Tiến hành nghiên cứu biến nạp gen GmCHS7 vào giống đậu tương Việt Nam (DT84, DT99, DT2001, MTĐ176 ĐT22) thông qua vi khuẩn A tumefaciens phương pháp nốt mầm - Nghiên cứu khả tạo chồi tạo đa chồi giống đậu tương Việt Nam (DT84, DT99, DT2001, MTĐ176 ĐT22) sau biến nạp - Đánh giá hiệu chuyển gen vào giống đậu tương (DT84, DT99, DT2001, MTĐ176 ĐT22) thông qua vi khuẩn A tumefaciens mang gen GmCHS7 - Đánh giá tỷ lệ phân ly gen GmCHS7 hệ T1 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 10 Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thư (2007), “Chuyển gen Gus vào đỉnh phôi hạt chín giống đậu tương ĐT12 thông qua Agrobacterium Tumefaciens”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(4), tr 471 – 478 11 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB KHKT, Hà Nội 12 Tổng cục Thống kê Việt Nam (2014), “Niên giám thống kê 2014”, Nhà xuất thống kê, Hà Nội 13 Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, NXB nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh 14 Aragão FJL, Sarokin L, Vianna GR, Rech EL (2000) “Selection of transgenic meristematic cells utilizing a herbicidal molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean [Glycine max (L.) Merril] plants at a high frequency”, Theor Appl Genet, 101, pp – 15 Bravo Angel A.M., Hohn B., Tinland B (1998), “The Omega sequence of Vir D2 is important but not essential for efficient of the T – DNA by Agrobacterium tumefaciens”, Molecular plant Microbe interaction (11), pp 57 – 63 16 Chen Shi – Yun (2004), “High – efficiency Agrobacterium – mediated transformantion of soybean”, Acta Botanica simica, 46(5), pp 610 – 617 17 Clemente T., LaVallee B.J., Howe A.R., Ward D.C., Rozman R.J., Hunter P.E., Broyles D.L., Kasten D.S., Hinchee M.A (2000), “Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacteriummediated transformation”, Crop Sci 40, pp 797 - 803 18 Dai, S.H., Zheng, P., Marmey, P., Zhang, S.P., Tian, W.Z., Chen, S.Y., Beachy, R.N., Fauquet, C (2001), “Comparative analysis of transgenic rice 63 plants obtained by Agrobacterium – mediated transformation and particle bombardment”, Mol Breeding, 7(1), pp 25 – 33 19 Dang W, Wei Z (2007), “An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes”, Plant Sci., 173, pp 381 – 389 20 Dao TT, Linthorst HJ, Verpoorte R (2011), “Chlacone synthase and its functions in plant resistance”, Phytochem Rev., 10(3), pp 397 - 412 21 Dhaubhadel S., Gijzen M., Moy P., Farhangkhoee M (2007), “Transcriptome analysis reveals a critical role of CHS7 and CHS8 genes for isoflavonoid synthesis in soybean seeds”, Plant Physiol, , 143(1), pp 326 338 22 Di R., Purcell V., Colin G.B., Ghabrial S.A (1996), “A production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene”, Plant Cell Rep., 7, pp 399-402 23 Droste A, Pasquali G, Bodanese-Zanettini MH (2002), “Transgenic fertile plants of soybean (Glycine max (L) Merrill) obtained from bombarded embryogenic tissue”, Euphytica, 127, pp 367 – 376 24 Fromm, M., Taylor, L.P., and Walbot, V (1985), “Expression of gene transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation” Proc Natl Acad Sci.USA, 82, pp 5824 - 5828 25 Finer, J.J (1988), “Apical proliferation of embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill)”, Plant Cell Tissue Organ Cult., 15, pp 125 136 26 Finer, J.J McMullen, M.D (1991), “Transformtion of soybean via particle bombardment of embryogenic suspension culture tissue” Invitro Cell Dev.Biol., 27, pp 175 - 182 27 Finer JJ, Vain P, Jones MW, McMullen MD (1992), “Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells”, Plant Cell Rep., 11, pp 323 – 328 64 28 Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K (1968), “Nutrient requirements of suspension cultures of soybean cells”, Experimental Cell Research 50(1), pp 151 - 158 29 Gandhi, A.p (2009), “Review article: Quality of soybean and its products”, International Food research journal, 16, pp 11 – 19 30 Genlvin S.B (2000), “A and plant genes involved in T- DNA transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology, 51, pp 223 - 256 31 Gomez KA, Gomez AA (1984), “Statistical procedures for agricultural research”, Second Ed John Wiley and Sons Inc., New York – Chichester, Bribane Toronto Singapore, 680 pages 32 Guriqbal Signh (2010), “The soybean: Botany, production and uses”, Uk, ISBN – 13, pp – 47 33 Gustavo A., Cabrera J (1998), “The A tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report, 26, pp – 11 34 Hansen G, Wright MS (1999), “Recent advances in the transformation of plants”, Trends Plant Sci., 4, pp 226 – 231 35 Hinchee, M.A.W., D.V.Connor-Ward, C.A.Newell, R.E.McDonnell, S.J.Sato, C.S.Gasser, D.A.Fischhoff, D.B.Re, R.T.Fraley, and R.B.Horsch (1988), “Production of transgenic soybean plants using A.-mediated gene transfer”, Bio/Technol., 6, pp 915 - 922 36 Homrich MS, Passaglia LMP, Pereira JF, Bertagnolli PF, Salvadori JR, Nicolau M, Kaltchuk-Santos E, Bodanese-Zanettini MH (2008), “Agronomic performance, chromosomal stability and resistance to velvetbean caterpillar of transgenic soybean expressing cry1Ac gene”, Pesq Agropec Bras., 43, pp 801 – 807 37 Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of A tumefaciens” Ann.Rev Phytopathol., 32, pp 157 – 179 38 Hooykaas, P J J., & Schilperoort, R A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology, 19(1), pp 15 - 38 65 39 Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L (2006), “Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice” Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 12 987 – 12 992 40 Hymowitz T and Newell C.A (1981), “Taxonomy of the genus Glycine domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp 272 - 288 41 ISAAA, http://www.isaaa.org/ 42 Jame Clive (2014), “Global status of commercialized biotech/GM crops: 2014”, ISAAA Brieft, 49, ISAAA, Ithaca, New York 43 Jeremy Schmutz , Steven B Cannon, Jessica S., Jianxin M., Therese M., William N., David L H., Qijian S., Jay J T., J., Dong X., Uffe H., Gregory D M., Yeisoo Y., Tetsuya S., Taishi U., Madan K B., Devinder S., Babu V., Erika L., Myron P., David G., Shengqiang S., David G., Kerrie B., Montona Futrell G., Brian A., Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Xue C Z., Kazuo S., Henry T N., Rod A W., Perry C., James S., Jane G., Dan R., Gary S., Randy C S & Scott A J., “Genome sequence of the palaeopolyploid soybean”, Nature, 463, pp 178 – 183 44 Juan J Gutierrez - Gonzalez, Satish K Guttikonda, Lam-Son Phan Tran, Donavan L Aldrich, Rui Zhong, Oliver Yu, Henry T Nguyen, David A Sleper (2010), “Differential Expression of Isoflavone Biosynthetic Genes in Soybean During Water Deficits”, Plant Cell Physiol., 51(6), pp 936 – 948 45 Kazuno, N., Kazuko, Y.S (2005), “Molecular studies on stress – responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerence in crop plants by regular Biotechnology”, JARQ, 39(4), pp 221 – 229 46 Kovtun, Y., Chiu, W.L., Tena, G., and Sheen, J (2000), “Functional analysis of oxidative stress - activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 97, pp 2940 – 2945 47 Lance Gibson and Garren Benson (2005), “Origin, history and uses of soybean (Glycine max (L.) Merrill)”, Iowa State University USA press 66 48 Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/µP DNA binding domain separate two cellular signal transcription pathways in drought- and low-temperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis”, Plant Cell, 10, pp 1391 - 1406 49 Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q (2008), “The effect of co-cultivation and selection parameters on A.-mediated transformation of Chinese soybean varieties”, Plant Cell Rep., 28, pp 489 - 498 50 Lakshmir P.M, Satish K.G (2009), “Physiological and molecular appoches to improve drought resistance in soybean”, Plant Cell Physiol., 50(7), pp 1260 – 1276 51 Maitra N., Cushman (1994), “Isolation and characterization of a drought – induced soybean cDNA encoding a D95 family late – embryogenesis – abudant protein”, Plant Physiol, 106(2), pp 805 - 806 52 Martinell B.J., Julson L.S., Emler C.A., Yong H., Mc Cabe D.E., Williams E.J (2002), “Soybean Agrobacterium transformation method”, US Patent Application, No 6384301 53 Margie M Paz, Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K B & Wang K (2004), “Assessment of conditionsaffecting A - mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167 - 169 54 Mc Cabe DE, Swain WF (2008), “Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles”, Plant Physiol., 87, pp 671 – 674 55 Meurer C A., Drinkins R D., Colins G.B (1998), “Factor affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant cell Re., 18, pp 180 – 186 56 Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Yamaguchi K., Tran L S (2010), “Genome – wide analysis of two component systems and prediction of stress – responsive two component system members in soybean”, DNA Res, 17, pp 303 – 324 67 57 Mochida K., Yoshida T., Sakurai T , Yamaguchi K , Tran L S (2009), “In silico analysis of transcription factor repertoire and prediction of stress responsive transcription factors in soybean”, DNA Res., 16(6), pp 353 – 369 58 Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and Biosays with tobacco Tissue cultures”, Physiol plant, 15, pp 473 – 497 59 Nakashima K, Tran LS., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of a NAC - type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice” Plant J, 51, pp 617–630 60 Nelson D.E., Repetti P.P., Adams T.R (2007), “Plant nuclear factor Y (NFY) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water - limited acres” Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 104, pp 16450–16455 61 Nishihama R., Ishikawa M., Araki S., Soyano T., Asada T., Machida Y (2001), “The NPK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase is a regulator of cell-plate formation in plant cytokinesis”, Genes Dev., 15, pp 352 – 363 62 Olhoft P M., K Lin ,J Galbraith, N.C Nielsen and D.A Somers (2001), “The role of thiol compounds in increasing A.-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep., 20, pp 731 – 737 63 Olhoft P M., D.A.Somers (2001), “L - Cysteine increases A.-mediated TDNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep, 20, pp 706 – 711 64 Olhoft, P M., L.E Flagel, C M Donovan, and D.A Somers (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta, 216, pp 723 - 735 65 Owens, L D., and Cress, D E (1985), “Genotypic variability of soybean response to A strain Ti or Ri plasmids” Plant Physiol., 77, pp 87 - 94 68 66 Parrott, W.A., Hoffman, L.M., Hildebrand, D.F., Williams and Collin G.B (1989), “Recovery of primary transformation of soybean” Plant Cell., 2, pp 201 - 204 67 Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K B & Wang K (2004), “Assessment of conditionsaffecting A.-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167 - 169 68 Paz MM, Martinez JC, Kalvig AB, Fonger TM, Wang K, (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Rep, 25, pp 206 – 213 69 Sato H, Yamada T, Kita Y, Ishimoto M, Kitamura K (2007), “Production of transgenic plants and their early seed set in Japanese soybean variety, Kariyutaka”, Plant Biotechnol., 24, pp 533 – 536 70 Sato S, Newell C, Kolacz K, Tredo L, Finer J, Hinchee M (1993), “Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems”, Plant Cell Rep., 12, pp 408 – 413 71 Sato S, Xing A, Ye X, Schweiger B, Kinney A, Graef G, Clemente T (2004), “Production of γ-linolenic acid and stearidonic acid in seeds of marker-free transgenic soybean”, Crop Sci., 44, pp 646 – 652 72 Shou H., Patricia B., Kan W (2004), “Expression of the Nicotiana protein kinase (NPK1) enhanced drought tolerance in transgenic maize”, Journal of Experimental Botany, 55(399), pp 1013 – 1019 73 Stachel, S.E., Messsens, E., Van Montagu, M., and Zambryski, P (1985), “Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells which active the T - DNA transfer process in A tumefaciens” Nature 318, pp 624 - 629 74 Stewart, C N., Adang Jr., M.J., All J.N., Boerma H R., Cardineau G., Tucker D., Trick H.N & Finer J.J (1996), “Sonication-assisted 69 Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max L Merrill) embryogenic suspension culture tissue”, Plant Cell Rep., 17, pp 482 - 488 75 Shou, H.X., Frame, B.R., Whitham, S.A., Wang, K (2004), “Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated transformation”, Mol Breeding, 13(2), pp 201 208 76 Tasuku K., Takuro M., Setsuzo Y., Mineo S (2009), “Molecular Mechanism of Seed Coat Discoloration Induced by Low Temperature in Yellow Soybean”, Plant Cell Physiol, 50 (6), pp 1090 - 1098 77 Tran L S., Quach T N., Guttikonda S K., Aldrich D L., Kumar R (2009), “Molecular characterization of stress - inducible GmNAC genes in soybean” Mol Genet Genomics, 281, pp 647 – 664 78 Tran Phan Lam Son, K Nakashima, Y Sakuma (2004), “Isolation and Functional Analysis of Arabidopsis Stress-Inducible NAC Transcription Factors That Bind to a Drought - Responsive cis - Element in the early responsive to dehydration stress Promoter”, Plant Cell, 16(9), pp 2481 – 2498 79 Travella, S., Ross, S.M., Harden, J., Everett, C., Snape, J.W., Harwood, W.A (2005), “A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacteriummediated techniques”, Plant Cell Rep., 23(12), pp 780 – 789 80 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai, La Cao Thang (2008), “Transformation efficiences of the soybean variety PC19 (Glycine max (L.) Merrill) using Agrobacterium Tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omonrice, 16, pp – 81 Trick H.N., Dinkins R.D., Santarem E.R., Di R., Samoylov V., Meurer C.A., Walker D.R., Parrott W.A., Finer J.J., Collins G.B (1997), “Recent advance in soybean trasformation”, Plant tissue Cult Biotechnol., 3, pp - 26 70 82 Trick HN, Finer JJ (1998), “Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max(L.) Merrill] embryogenic suspension culture tissue”, Plant Cell Rep, 17, pp 482 – 488 83 Townsend, J.A., and Thomas, L.A (1993), “An improved method of A – mediated transformation of culture soybean cells, U.S Patent No WO94/02620 84 Xing A., Zhang Z.Y., Sato S., Staswick P and Clemente T (2000), “The use of the two T-DNA binary systemto derive marker-free transgenic soybeans”, In Vitro Cell Dev Biol –Plant, 36, pp 456 - 463 85 Xinping YI and Deyu Yu (2006), “Transformation of multiple soybean cultivar by infecting cotyledonary – node with A Tumefaciens”, African journal of Biotechnology vol.5 , 20, pp 1989 – 1993 86 Xue, R.G., H.F Xie and B Zhang (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Bitechnol Lett., 28, pp 1551 - 1557 87 Yan B., Reddy M.S.S., Collins G.B., Dinkins R.D (2000), “Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of soybean (Glycine max L Merrill) using immature zygotic cotylendon explants”, Plant Cell Rep., 19, pp 10901097 88 Yi J, Derynck MR, Chen L, Dhaubhadel S (2010), “Differential expression of CHS7 and CHS8 genes in soybean”, Planta 231, (3), pp 741 - 753 89 Zupan J.,Muth T R., Draper O., Zambryski P (2000), “The transfer of DNA from A Tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights”, Plant J 23, pp 11 – 28 90 Zhang Z, Xing A, Staswick PE, Clemente TE (1999), “The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean”, Plant Cell Tiss Organ Cult, 56, pp 37 – 46 71 91 Zeng P, Vadnais DA, Zhang Z, Polacco JC (2004), “Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill)”, Plant Cell Rep., 22, pp 478 – 482 92 Wang, G., & Xu, Y (2008), “Hypocotyl-based Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max) and application for RNA interference”, Plant Cell Report, 27(7), pp 1177 – 1184 72 Phụ lục Bảng 1: Môi trƣờng B5 đa lƣợng STT Thành phần (mg/l) KNO3 2500 CaCl 2H2O 150 MgSO4 7H2O 150 (NH4)2 SO4 134 NaH2PO4 H2O 150 Bảng 2: Môi trƣờng B5 vi lƣợng STT Thành phần (mg/l) H3BO3 MnSO4 H2O 10 ZnSO4 7H20 KI 0,7 Na2MoO4 2H2O 0,2 CuSO4 5H2O 0,25 CoCl2 6H2O 0,25 Bảng 3: Môi trƣờng B5 Fe (III) – Na2EDTA STT Thành phần (mg/l) FeSO4 7H2O 27,8 Na2EDTA 37,2 Bảng 4: Môi trƣờng B5 Vitamin STT Thành phần (mg/l) Myo - inositol 100 Nicotinic acid Pyridoxin - HCl Thiamine HCl 10 Bảng 5: Môi trƣờng MS đa lƣợng STT Thành phần (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 2H2O 440 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 Bảng 6: Môi trƣờng MS vi lƣợng STT Thành phần (mg/l) H3BO3 6,2 MnSO4 H2O 22,3 ZnSO4 7H20 10,6 KI 0,8 Na2MoO4 2H2O 0,25 CuSO4 5H2O 0,02 CoCl2 6H2O 0,02 Bảng 7: Môi trƣờng YEP (pH = 7.0) STT Thành phần (g/l) Bacto - pepton 10 Yeast - extract NaCl Agar 1.2 Bảng 8: Môi trƣờng nuôi cấy Thành phần Môi trƣờng nảy mầm (GM) Môi trƣờng đồng nuôi cấy (CCM) Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi (SIM) Môi trƣờng kéo dài chồi (SEM) Môi trƣờng rễ (RM) B5 đa lượng 10X 10X 10X - - B5 vi lượng 100X 100X 100X - - MS đa lượng - - - 10X 10X MS vi lượng - - - 100X 100X B5 vitamin 100X 100X 100X 100X 100X Fe (III) Na2EDTA 100X 100X 100X 100X 100X Sucrose Agar pH 20 g/l 7,8 g/l 5,8 - 30 g/l 7.8 g/l 5,4 400 mg/l 400 mg/l 3,9 g/l 154 mg/l 158 mg/l 20 g/l 7.8 g/l 5,7 0,6 g/l - 30 g/l 7.8 g/l 5,7 0,6 g/l - 20 g/l 7.8 g/l 5,7 0,6 g/l - AS L - cysteine MES DTT(dithiothritol) Sodium thiosulfate L - asparagine L - glutamic acid Zeatin riboside BAP - 1,5mg/l 1,5mg/l 50 mg/l 100 mg/l mg/l - - GA3 - 0,25 mg/l - 0,5 mg/l - IAA - - - 0,1 mg/l - IBA - - - - mg/l Cefotaxime - - 400 mg/l 400 mg/l 400 mg/l Glufosinate - - 10 mg/l mg/l - Bảng 9: Bảng phân phối Khi bình phƣơng (χ2) Số bậc tự P=99 95 80 50 20 05 01 000157 00393 0642 455 1.642 3.841 6.653 020 103 446 1.386 3.219 5.991 9.210 115 352 1.005 2.366 4.642 7.815 11.345 297 711 1.649 3.357 5.989 9.488 13.277 554 1.145 2.343 4.351 7.298 11.070 15.086 872 1.635 3.070 5.348 8.558 12.592 16.812 1.239 2.167 3.822 6.346 9.803 14.067 18.475 1.646 2.733 4.594 7.344 11.030 15.507 20.090 2.088 3.325 5.380 8.343 12.242 16.919 21.666 10 2.558 3.940 6.179 9.342 13.442 18.307 23.209 15 5.229 7.261 10.307 14.339 19.311 24.996 30.578 20 8.260 10.851 14.578 19.337 25.038 31.410 37.566 25 11.524 14.611 18.940 24.337 30.675 37.652 44.314 30 14.953 18.493 23.364 29.336 36.250 43.773 50.892 ... tài Khảo sát khả biến nạp gen GmCHS7 vào đậu tương (Glycine max (L. ) Merrill) thông qua vi khuẩn A tumefaciens Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu chuyển gen GmCHS7 vào số giống đậu tương Vi t... MTĐ176 ĐT2 2) sau biến nạp - Đánh giá hiệu chuyển gen vào giống đậu tương (DT84, DT99, DT2001, MTĐ176 ĐT2 2) thông qua vi khuẩn A tumefaciens mang gen GmCHS7 - Đánh giá tỷ lệ phân ly gen GmCHS7 hệ... MTĐ17 6) xác định hiệu chuyển gen giống đậu tương đưa vào nghiên cứu - Tạo dòng đậu tương có mang gen GmCHS7 cho nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Tiến hành nghiên cứu biến nạp gen GmCHS7 vào giống đậu