Nghiên cứu biến nạp Gen vào đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -   NGUYỄN TIẾN DŨNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -   NGUYỄN TIẾN DŨNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S Nguyễn Văn Đồng PGS.TS Ngô Xuân Bình Thái Nguyên-2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều giới năm 2008 Bảng 1.2 Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua vùng khác Bảng 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam Bảng 1.4 Các thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 17 Bảng 1.5 Các gen thông báo thị sinh hóa 20 Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 38 Bảng 3.1 Khả phát sinh chồi số giống đậu tương sau 10 ngày 45 Bảng 3.2 Khả kéo dài chồi rễ tạo hoàn chỉnh 47 Bảng 3.3 Kết lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen 48 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu biến nạp gen 53 Bảng 3.5 Ảnh hưởng phương thức tăng cường khả lây nhiễm 54 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp gen 56 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ AS đến khả biến nạp gen 57 Bảng 3.8 Ảnh hưởng L-cystein đến hiệu biến nạp gen 58 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hygromycin đến khả chọn lọc sau chuyển gen 59 Bảng 3.10 Hiệu chuyển gen vào số giống đậu tương 62 Bảng 3.11 Số sau chọn lọc số giống đậu tương 63 Bảng 3.12 Kết phân tích PCR dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin 10 Hình 1.2 Sự tương tác Agrobacterium với tế bào thực vật 12 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 15 Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 16 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H 31 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tái sinh đậu tương 35 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương 37 Hình 3.1 Phát sinh tạo đa chồi số giống đậu tương nghiên cứu 46 Hình 3.2 Phát sinh rễ số giống đậu tương 48 Hình 3.3 Biểu gus đậu tương lây nhiễm với chủng vi khuẩn 49 Hình 3.4 Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp Agrobacterium chủng AGL1 51 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp 52 Hình 3.6 Chọn lọc chồi chuyển gen môi trường SIM 60 Hình 3.7 Biểu gen gfp chuyển vào giống đậu tương 63 Hình 3.8 Kết điện di DNA tổng số dòng đậu tương 64 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : - Benzylaminopurine bp : base pair (cặp bazơ) GFP : Green Fluorescent Protein DNA EDTA : : Deoxyribo Nucleic Acid Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br gus : : Ethidium Bromide hpt MSC NAA MS : : : : Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase Multi - Cloning Site α -Napthalene acetic acid Murashige and Skoog, 1962 LB NOS : : Luria Bertani Nopalin Sythetase OD PCR : : Optical Density (mật độ quang học) Polymerase Chain Reaction SDS TAE : : Sodium Dodecyl Sulfate Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-EDTA T- DNA Ti-Plasmid : : Transfer DNA (ADN chuyển) Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR X-gluc : : Virulence region (vùng gây độc có khả tạo khối u) 2,4-D : Dichlorophenoxy acetic acid & cs : cộng -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Yêu cầu nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tƣơng 1.2 Đặc tính chống chịu đậu tương 1.3 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.3.1.Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trình chuyển gen 1.4.1 Agrobacterium tumefaciens tượng biến nạp gen thực vật tự nhiên 1.4.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid 1.4.3 Cấu trúc chức đoạn T-DNA 11 1.4.4 Cơ chế phân tử việc chuyển gen 11 1.4.5 Tương tác T-DNA genome tế bào thực vật 13 1.5 Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 1.5.1 Vector nhị thể 14 1.5.2 Hệ vector liên hợp 16 1.6 Gen thị 17 1.6.1 Chỉ thị chọn lọc 17 1.6.2 Chỉ thị sàng lọc 18 1.7 Hệ thống tái sinh biến nạp gen giống đậu tƣơng 20 1.7.1 Hệ thống tái sinh đậu tương 20 1.7.2 Phương pháp biến nạp gen đậu tương 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Các thiết bị dụng cụ thí nghiệm 30 2.1.2 Hóa chất 30 2.1.3 Plasmid, primers vi khuẩn 30 2.1.4 Vật liệu thực vật 31 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 32 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32 2.3 Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu 32 2.3.1 Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli phƣơng pháp sốc nhiệt 32 2.3.2 Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens phƣơng pháp xung điện 33 2.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 33 2.3.4 Phƣơng pháp PCR 34 2.3.5 Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose 2.3.6 Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh hoàn chỉnh 35 2.3.7 Phƣơng pháp biến nạp gen vào giống đậu tƣơng 39 2.3.8 Sàng lọc, phân tích chuyển gen 39 2.3.8.1 Sàng lọc thông qua gen thị GFP 39 2.3.8.2 Phân tích PCR 39 2.3.9 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá sử lý kết 41 2.3.9.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………… 41 2.3.9.2 Phương pháp theo dõi, đánh giá .42 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh số giống đậu tƣơng 44 3.1.1 Khả phát sinh chồi số giống đậu tương 44 3.1.2 Khả kéo dài chồi, rễ tạo hoàn chỉnh giống đậu tương nghiên cứu 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2 Kết lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đậu tƣơng 48 3.3 Kết biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng 51 3.4 Tối ƣu hóa yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu biến nạp gen 52 3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn lây nhiễm 52 3.4.2 Ảnh hưởng phương thức tăng cường khả lây nhiễm 54 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp gen 55 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ Acetosyringon (AS) 56 3.4.5 Ảnh hưởng L-cystein đến khả biến nạp 57 3.4.6 Ảnh hưởng hygromycin đến khả chọn lọc sau chuyển gen 59 3.5 Đánh giá hiệu chuyển gen số giống đậu tƣơng 61 3.5.1 Hiệu chuyển gen thông qua gen thị sàng lọc gfp 61 3.5.2 Kết tách chiết DNA tổng số phân tích PCR dòng đậu tƣơng chuyển gen 63 LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng... sinh đậu tương 35 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương 37 Hình 3.1 Phát sinh tạo đa chồi số giống đậu tương nghiên cứu 46 Hình 3.2 Phát sinh rễ số giống đậu tương. .. http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2 Kết lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đậu tƣơng 48 3.3 Kết biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng 51 3.4 Tối