Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB3 điều khiển tính chống chịu của cây đậu tương [Glycine Max (L.) Merrill]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÀNH THỊ MAI ANH TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 Học viên: Bành Thị Mai Anh Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà THÁI NGUYÊN - 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có công bố công trình khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn , TS Phạm Bích Ngọc, Ths Lê Thu Ngọc toàn thể cán phòng Công nghệ Tế bào thực vật , Viện Công nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ cho trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô khoa Sinh-KTNN khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập thực thành công luận văn Thái Nguyên, ngày 29 tháng năm 2011 Học viên BÀNH THỊ MAI ANH MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục chƣ̃ viết tắt iv Danh mục bảng vi Danh mục hình vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… I Đặt vấn đề II Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………… III Nội dung nghiên cƣ́u………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG…………………………………… 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tƣơng………………………………………… 1.1.2 Đặc điểm sinh học đậu tƣơng………………… 1.1.3 Giá trị kinh tế đậu tƣơng 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.2 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƢƠNG……… 1.3 CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN………………… 11 1.3.1 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn…………………………… 11 1.3.2 Các nhân tố phiên mã điều khiển gen liên quan đến tính chịu hạn……… 12 i 1.3.3 Promoter rd29A…………………………………………………………… 15 1.4 NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB…………………………… 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 24 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.2.1.1 Phương pháp tách chiết, tinh DNA RNA………………………… 25 2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA……………………………………………… 26 2.2.1.3 Phản ứng PCR …………………………………… 27 2.2.1.4 Phương pháp tách dòng gen……………………………………………… 27 2.2.1.5 Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3……………………………… 29 2.2.2 Phƣơng pháp tái sinh chuyển gen thông qua Agrobacterium 30 2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào đậu tương thông qua Agrobacterium 30 2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium 32 2.2.3 Phƣơng pháp phân tí ch chuyển gen 33 2.2.3.1 Phương pháp PCR 33 2.2.3.2 Phương pháp gây hạn nhân tạo 33 2.2.4 Phƣơng pháp tính toán xử lý số liệu 33 2.2.5 Phƣơng pháp xƣ̉ lý trì nh tƣ̣ gen và amino acid 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 34 3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÕNG GEN DREB3…………………………………… 34 ii 3.1.1 Kết quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổng số giống đậu tƣơng Nâu Cao Bằng 34 3.1.2 Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng ………………… 35 3.1.3 Phân tí ch và xếp nhóm protein DREB3 dƣ̣a vào vùng bảo thủ AP2………… 39 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN DREB3 ……………… 42 3.2.1 Thiết kế vector ……………………………………………………………… 42 3.2.2.Biến nạp cấu trúc vector pBI 101::rd29A::DREB3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………………………………… 3.3 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN DREB3 VÀO CÂY THUỐC LÁ THÔNG QUA AGROBACTERIUM……………………………………………………… 3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc vector pBI ::rd29A::DREB3 vào giống thuốc K326………………………………………………………………………………… 47 48 48 3.3.2 Kết quả phân tí ch và đánh giá các dòng thuốc lá thu đƣợc……………… 50 3.4 KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬU TƢƠNG…………………………………………………………………………… 52 3.4.1 Kết chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng…………………… 52 3.4.2 Kết phân tích đậu tƣơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR…… 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………………… 56 DANH MỤC CÔNG TRÌ NH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………………… 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 58 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ABR ABA/stress responsive ABRE ABA responsive element AP2/EREBP APETALA2/Ethylene Response Elements Binding Proteins AP2/ERF APETALA2/ethylen response factor AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair bZIP Basic leucine zipper cDNA Sợi DNA bổ sung (Complementary DNA) CCM Cocultivation medium – môi trƣờng đồng nuôi cấy Cs Cộng sƣ̣ DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate DRE/CRT Dehydration responsive element/C repeat DREB Dehydration responsive element binding EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt iv Gus β –Glucuronidase gene (Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase) IBA Indole-3-butyric acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb kilo base LB Luria Bertani LEA Late embryogenesis abundant MAP kinase Mitogen-activated protein kinases MES 2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid MS Môi trƣờng muối theo Murashige Skoog (1962) NSL Nuclear localization signal OD Optical density rd29A Responsive Dehydration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trƣờng rễ RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecylsulfat SIM Shoot induction medium – môi trƣờng tạo đa chồi SEM Shoot elongation medium – môi trƣờng kéo dài chồi TBE Tris - Boric acid – EDTA TAE Tris - Acetate – EDTA TE Tris – EDTA v/p vòng/phút X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosidase v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam từ năm 2003 đến 2010… Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết…………………………… 25 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR…………………………………… 27 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng……………… 27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR……………………………… 28 Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid………………………………… 29 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI, SacI 29 Bảng 2.7 Môi trƣờng nuôi cấy đậu tƣơng…………………………………… 31 Bảng 2.8 Môi trƣờng nuôi cấy thuốc lá……………………………………… 32 Bảng 3.1 Sƣ̣ sai khác về trì nh tƣ̣ nucleotide và amino acid của trình tự gen DREB3 thu đƣợc với gen GmDREB3 mã số DQ055133……………………… 38 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của mảnh thuốc biến nạp qua giai đoạn chọn lọc 48 Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót mô đậu tƣơng qua giai đoạn chọn lọc 53 vi data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70... HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƢƠNG……… 1.3 CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN………………… 11 1.3.1 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn…………………………… 11 1.3.2 Các nhân tố phiên mã điều khiển gen liên... 3.1.2 Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng ………………… 35 3.1.3 Phân tí ch và xếp nhóm protein DREB3 dƣ̣a vào vùng bảo thủ AP2………… 39 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN