tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã gmdreb3 điều khiển tính chống chịu của cây đậu tương [glycine max (l.) merrill]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠ I HỌ C THÁ I NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M BNH TH MAI ANH TCH DÕNG V THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬ N VĂN THẠ C SĨ SINH HỌ C THI NGUYÊN - 2011 1 ĐẠ I HỌ C THÁ I NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M LUẬ N VĂN THẠ C SĨ SINH HỌ C TCH DÕNG V THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngà nh: Di truyề n họ c M s: 62.42.70 Hc viên: Bnh Th Mai Anh Ngườ i hướ ng dẫ n: PGS.TS. Chu Hoà ng Hà THI NGUYÊN - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Mi trch dn đu ghi r ngun gốc. LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dn, chỉ bảo và tạo điu kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hc tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn , TS. Phạm Bch Ngc, Ths. Lê Thu Ngc cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật , Viện Công nghệ Sinh hc đã tận tình giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-KTNN và khoa Sau đại hc, trƣờng Đại hc Sƣ phạm – Đại hc Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyn & Sinh hc hiện đại đã giúp đỡ và tạo điu kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hc tập và nghiên cứu đ tà i. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hc tập và thực hiện thành công luận văn này. Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2011 Hc viên BNH TH MAI ANH i MC LC Trang Lờ i cam đoan Lờ i cả m ơn Mc lc i Danh mụ c chƣ̃ viế t tắ t iv Danh mụ c bảng vi Danh mụ c hình vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 1 I. Đt vấn đ 1 II. Mc tiêu nghiên cứu……………………………………………………… 2 III. Nộ i dung nghiên cƣ́ u………………………………………………………… 2 Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U…………………………………………… 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG…………………………………… 3 1.1.1. Ngun gốc phân loại cây đậu tƣơng…………………………………………. 3 1.1.2. Đc điểm sinh hc của cây đậu tƣơng………………… 3 1.1.3. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng 5 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.2. HẠN V TC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬ U TƢƠNG……… 7 1.3. CC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHU HẠN………………… 11 1.3.1. Các nhóm gen liên quan đến tnh chịu hạn…………………………… 11 1.3.2. Các nhân tố phiên mã điu khiển các gen liên quan đến tnh chịu hạn……… 12 ii 1.3.3. Promoter rd29A…………………………………………………………… 15 1.4. NHÂN TỐ ĐIỀ U KHIỂ N PHIÊN MÃ DREB…………………………… 18 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U 24 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT B 24 2.2. PHƢƠNG PHP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.2.1.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA………………………… 25 2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA……………………………………………… 26 2.2.1.3. Phản ứng PCR …………………………………… 27 2.2.1.4. Phương pháp tách dòng gen……………………………………………… 27 2.2.1.5. Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3………………………………. 29 2.2.2. Phƣơng phá p tá i sinh và chuyển gen thông qua Agrobacterium 30 2.2.2.1. Phương phá p chuyể n gen vào cây đu tương thông qua Agrobacterium 30 2.2.2.2. Phương phá p chuyể n gen và o cây thuốc lá thông qua Agrobacterium 32 2.2.3. Phƣơng phá p phân tí ch cây chuyể n gen 33 2.2.3.1. Phương phá p PCR 33 2.2.3.2. Phương phá p gây hạ n nhân tạ o 33 2.2.4. Phƣơng pháp tính toán và xử lý s liệu 33 2.2.5. Phƣơng phá p xƣ̉ lý trình tƣ̣ gen và amino acid 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢ O LUẬ N………………………………… 34 3.1. KẾ T QUẢ TCH DÕNG GEN DREB3…………………………………… 34 iii 3.1.1. Kế t quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổ ng số giố ng đậ u tƣơng Nâu Cao Bằ ng 34 3.1.2. Kế t quả ghé p nố i đoạ n gen DREB3 vào vector tách dòng ………………… 35 3.1.3. Phân tích và xế p nhó m protein DREB3 dƣ̣ a và o vù ng bả o thủ AP2…………. 39 3.2. KẾ T QUẢ THIẾ T KẾ VECTOR CHUYỂ N GEN DREB3 ……………… 42 3.2.1. Thiế t kế vector ………………………………………………………………. 42 3.2.2.Biế n nạ p cấ u trú c vector pBI 101::rd29A::DREB3 vào vi khun Agrobacterium tumefaciens………………………………………… 47 3.3. KẾT QUẢ CHUYỂ N GEN DREB3 VO CÂY THUỐC L THÔNG QUA AGROBACTERIUM……………………………………………………… 48 3.3.1. Kế t quả chuyể n cấ u trú c vector pBI ::rd29A::DREB3 vào ging thuc lá K326…………………………………………………………………………………. 48 3.3.2. Kế t quả phân tích và đá nh giá cá c dò ng thuố c lá thu đƣợ c………………. 50 3.4. KẾT QUẢ CHUYỂ N PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬ U TƢƠNG…………………………………………………………………………… 52 3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng…………………… 52 3.4.2. Kết quả phân tch cây đậu tƣơng chuyển gen bng k thuật PCR…… 55 KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………………… 56 DANH MỤ C CÔNG TRÌ NH LIÊN QUAN ĐẾ N LUẬ N VĂN………………… 57 TI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 58 PH LC………………………………………………………………………… iv DANH MC CHỮ CI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ABR ABA/stress responsive ABRE ABA responsive element AP2/EREBP APETALA2/Ethylene Response Elements Binding Proteins AP2/ERF APETALA2/ethylen response factor AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair bZIP Basic leucine zipper cDNA Sợi DNA bổ sung (Complementary DNA) CCM Cocultivation medium – môi trƣờng đng nuôi cấy Cs Cộ ng sƣ̣ DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate DRE/CRT Dehydration responsive element/C repeat DREB Dehydration responsive element binding EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E. coli Escherichia coli GA 3 Gibberellic acid GM Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt v Gus β –Glucuronidase gene (Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase) IBA Indole-3-butyric acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb kilo base LB Luria Bertani LEA Late embryogenesis abundant MAP kinase Mitogen-activated protein kinases MES 2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid MS Môi trƣờng muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NSL Nuclear localization signal OD Optical density rd29A Responsive Dehydration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trƣờng ra rễ RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecylsulfat SIM Shoot induction medium – môi trƣờng tạo đa chi SEM Shoot elongation medium – môi trƣờng kéo dài chi TBE Tris - Boric acid – EDTA TAE Tris - Acetate – EDTA TE Tris – EDTA v/p vòng/phút X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosidase vi DANH MỤ C BẢ NG Trang Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010… 6 Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết…………………………… 25 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR……………………………………. 27 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng………………. 27 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony – PCR………………………………. 28 Bảng 2.5. Thành phần hoá chất tách plasmid…………………………………. 29 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằ ng enzyme BamHI, SacI 29 Bảng 2.7. Môi trƣờ ng nuôi cấ y đậ u tƣơng……………………………………. 31 Bảng 2.8. Môi trƣờ ng nuôi cấ y thuố c lá ………………………………………. 32 Bảng 3.1. Sƣ̣ sai khá c về trình tƣ̣ nucleotide và amino acid củ a 3 trình tự gen DREB3 thu đƣợ c vớ i gen GmDREB3 mã số DQ055133……………………… 38 Bảng 3.2. Tỷ lệ số ng só t của của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọ n lọ c 48 Bảng 3.3. Tỷ lệ số ng só t của các mô đậ u tƣơng qua các giai đoạn chọ n lọ c 53 [...]... chuyển gen ở thƣc vât, đo la chỉ chuyên môt hay vai gen điêu khiên, thay vì vai trăm gen chƣc năng vao ̣ ̣ ́ ̀ ̉ ̣ ̀ ̀ ̉ ̀ ́ ̀ cây đê tăng cƣơng tí nh chông chị u cua cây trông [8] ̉ ̀ ́ ̉ ̀ Xuất phát từ nhƣng cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Tách dòng và thiêt kê ̃ ́ ́ vector chuyên gen mang gen ma hoa nhân tô phiên ̉ ̃ ́ ́ mã GmDREB3 điêu khiên tí nh ̀ ̉ chông chị u cua cây đâu tƣơng [Glycine. .. gen bar đƣợc điều khiển bởi promoter CaMV 35s và gen Adhl intron ở ngô, đã đƣợc chuyển vào mô nuôi cấy của cụm hoa và phôi còn non của cây lúa mỳ đông lục bội CV.8901, 5-8, 99-92 và 104 bằng cách bắn gen trƣc tiêp Hơn 70 dòng cây chuyển gen đã ̣ ́ đƣợc thu nhận Phân tích PCR hệ gen và RNA điểm đã cho thấy rằng gen DREB đã xuất hiện trong hệ gen lúa mỳ của cây chuyển gen ở T0 và T1, và cũng đã đƣợc... cDNA của gen DREB3 - Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A: :GmDREB3 - Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A: :GmDREB3 và đánh giá khả năng chịu hạn của cây thuốc lá chuyển gen tạo đƣợc - Tạo cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc pBI::rd29A::gus 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 1 TÔNG QUAN TAI LIÊU ̉ ̀ ̣ 1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU... hạn và ABA Các kết quả này đề xuất rằng chức năng của ba gen DREB đặc trƣng trong phản ứng lại với stress môi trƣờng của cây đậu tƣơng [24] Khi nghiên cứu gây ra sự biểu hiện cua nhân tố điều khiển phiên mã DREB và tác ̉ động của nó đến khả năng chịu hạn của cây lúa mỳ chuyển gen, Wang Jun Wei và cs đã thiết kế vector pBAC128F, mang gen DREB đƣợc điều khiển bởi promoter rd29B gây ra bởi hạn và gen. .. tƣơng [Glycine Max (L.) Merrill] ́ ̉ ̣ II Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập đƣợc cDNA của gen DREB3 tƣ cây đậu tƣơng ̀ - Thiết kế đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A: :GmDREB3 - Đánh giá hoạt động của cấu trúc rd29A: :GmDREB3 trên cây thuốc lá chuyển gen - Kiểm tra khả năng hoạt động của promoter rd29A trên cây đậu tƣơng chuyển gen III Nôi dung nghiên cƣu ̣ ́ - Tách dòng, xác định và phân tích... protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn , các nhân tô phiên ma bam vao trì nh tƣ DNA đăc hiêu trên vung khơi đông ́ ̃ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ̀ ̉ ̣ (promoter) của các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen này và kết quả là tăng cƣờng tính chịu hạn của thực v ật Các nghiên cứu về gen đa chƣng minh vung khơi đông cua nhiêu gen chƣc... sanh cac dong cây chuyên gen rd29A: :GmDREB3 ở cây Arabidopsis ́ ́ ̀ ̉ và thuốc lá với cây đối chứng trong đi ều kiện xử lý stress cho thấy : Khi xƣ ly han , tât ca ̉ ́ ̣ ́ ̉ các cây đối chứng bị chết , trong khi đo 85% các dòng mang cấu trúc rd29A: :GmDREB3 ́ còn sống sót Kêt qua cho thây sƣ biêu hiên cua GmDREB3 cải thiện tính chịu hạn của ́ ̉ ́ ̣ ̉ ̣ ̉ cây chuyên gen Các phân tích tính chịu muối... bám vào trình tự DRE và đƣợc đặt tên là : DREB1/CBF và DREB2 [19] AP2/ERF la môt ho lơn ̀ ̣ ̣ ́ bao gôm cac yêu t ố phiên mã quan trọng Các protein AP 2 của Arabidopsis đƣơc chia ̀ ́ ́ ̣ thành 5 nhóm dựa vào sự giống nhau trong vùng gắn DNA của chúng : họ AP2 (14 gen) , họ RAV (liên quan tơi ABI3/VP1) (6 gen) , họ DREB (55 gen; nhóm A), họ ERF (65 gen, ́ nhóm B), và các gen khác (4 gen) , môt gen. .. nhân va môt vung tân cung đâu C biên đôi ̣ ̀ ̣ ̀ ̣ ̀ ̀ ́ ̉ Nhóm nhân tố DREB: trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự lõi là A /GCCGAC lân đâu tiên đƣơc phat hiên năm trong vung điêu khiên gen ̀ ̀ ̣ ́ ̣ ̀ ̀ ̀ ̉ rd29 ở Arabidopsis và sau này đƣợc phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển gen của các gen biêu hiên trong điêu kiên han va l ạnh khác Các gen điều khiển quá trình phiên. .. của các cây đối chứng ̉ bị hạn chế, trong khi cac cây chuyên gen duy trì sinh trƣơng bì nh thƣơng , chiêu dai trung ́ ̉ ̉ ̀ ̀ ̀ bình của rễ và các phần trên mặt đất của cây ch uyên gen đêu lơn hơn so vơi cây đôi ̉ ̀ ́ ́ ́ chƣng Đanh gia vê sƣ biên đôi kiêu hì nh cho thây , ở giai đoạn trƣởng thành và giai đoạn ́ ́ ́ ̀ ̣ ́ ̉ ̉ ́ cây non, chiêu cao trung bì nh cua cây chuyên gen rd29A: :GmDREB3 giông . hành đ tài: Tách dng và thiế t kế vector chuyể n gen mang gen mã hó a nhân tố phiên m GmDREB3 điề u khiể n tính chố ng chịu củ a cây đậ u tƣơng [Glycine Max (L. ) Merrill] . II TCH DÕNG V THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L. ) Merrill] Chuyên ngà nh:. TCH DÕNG V THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L. ) Merrill] LUẬ N VĂN