Thiết kế vector

III. Nội dung nghiên cƣ́u

3.2.1. Thiết kế vector

Mục đích thiết kế vector là gắn gen DREB3 thu đƣợc vào trong cấu trúc vector pBI::rd29A. Trong đó, sƣ̣ hoạt động của gen DREB3 sẽ đƣợc điều khiển bởi promoter của gen rd29A. Mô hình vector đƣợc thiết kế đƣợc mô tả trong hình 3.9.

A. Mô hình vector pBI101

B. Mô hình vector pBI101::rd29A

C. Mô hình vector pBI101::rd29A::DREB3

Hình 3.9. Mô hình mô tả các bƣớc thiết kế vector chuyển gen

Promoter của gen rd29A là một promoter cảm ứng hạn , cùng với promoter 35S thƣờng đƣợc sƣ̉ dụng trong thiết kế vector chuyển các gen liên quan đến tính chống chịu stress môi trƣờng. Vì vậy, trong điều kiện hạn, dƣới sƣ̣ điều khiển của promoter rd29A sẽ tăng cƣờng sƣ̣ biểu hiện của gen DREB3, tƣ̀ đó sẽ có tác động tăng cƣờng hoạt động

44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phiên mã các gen liên quan đến phản ƣ́ng trả lời lại các yếu tố bất lợi cho đời sống cây trồng.

Mồi nhân gen ban đầu không có trình tự nhận biết điểm cắt củ a enzyme giới hạn . Vì vậy, chúng tôi tiến hành thiết kế thêm cặp mồi đặc hiệu DREB-BamHI/DREB-SacI để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen.

DREB3-BamHI F AGAGGATCCATGGCAGCTTTGATGGATTTTTAC

DREB3-SacI R CGGGAGCTCATTCAAAGAGGAGGAGCAGCTT

Kết quả PCR vector pBT::DREB3 với cặp mồi đặc hiệu DREB3-BamHI/DREB3-

SacI đƣợc thể hiện trong hình 3.10.

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi DREB3-BamHI/DREB3-SacI

M: Thang DNA chuẩn 1 kb

Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tiến hành cắt đồng thời bằng hai enzyme là BamHI và

SacI. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di thôi gel thu đoạn gen DREB3 đƣợc tinh sạch. Đối với vector pBI::rd29A::gus tiến hành cắt bằng BamHI và SacI nhằm loại bỏ gen gus. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.11.

ĐC M 1 2

DREB3 M

~ 820 bp

45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt pBI::rd29A::gus bằng BamHI và SacI

ĐC (vector pBI::rd29A::gus)

1 (Sản phẩm cắt pBI::rd29A bằng BamHI và SacI loại gen gus) 2 (Sản phẩm pBI::rd29A loại bỏ gen gus sau khi được tinh sạch)

Kết quả hình 3.11 cho thấy sản phẩm cắt vector pBI ::rd29A bằng BamHI và SacI đã xuất hiện hai băng, trong đó có một băng có kích thƣớc hơn 1800 bp, phù hợp với kích thƣớc của gen gus, một băng có kích thƣớc khoảng hơn 10 kb (tƣơng ƣ́ng với kích thƣớc của vector pBI và promoter rd29A). Vector pBI::rd29A sau khi đƣợc cắt mở vòng và loại bỏ đƣợc gen gus thì tiến hành thôi gel thu sản phẩm tinh sạch.

Gen DREB3 cắt BamHI và SacI sẽ đƣợc ghép nối vào vị trí đã mở vòng của vector pBI::rd29A bằng T4 ligase. Và sản phẩm ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến

E.coli chủng DH5, cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh kanamycin nồng độ 50 mg/l và ủ ở 370C qua đêm. Chọn ngẫu nhiên 7 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng có kháng sinh chọn lọc, tiến hành phản ƣ́ng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen rd29A F/R và DREB3 F/Rnhằm tìm ra chính xác dòng khuẩn lạc mang plasmid pBI101::rd29A::DREB3 tái tổ hợp mong muốn. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.12.

1 2 3 4 5 6 7 M

46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu

A. Kết quả kiểm tra sự có mặt của promoter rd29A bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu rd29A for/rev

B. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen DREB3 bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu DREB3-BamHI/DREB3-SacI

M: thang DNA chuẩn 1 kb, 1-7: các khuẩn lạc đem chọn lọc

Kết quả trên hình 3.12 cho thấy xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 1300 bp (tƣơng ƣ́ng với kích thƣớc của promoter gen rd29A) và đoạn kích thƣớc khoảng 820bp (tƣơng ƣ́ng kích thƣớc gen DREB3) ở dòng 1 và dòng 3, chƣ́ng tỏ hai dòng này mang cấu

1 2 3 4 5 6 7 M

~ 1300 bp

~ 820 bp

A

47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trúc vector pBI101::rd29A::DREB3 tái tổ hợp. Nhƣ vậy, trong 7 dòng kiểm tra chúng tôi đã lƣ̣a chọn đƣợc 2 dòng dƣơng tính với PCR là dòng 1 và dòng 3, còn các dòng còn lại (2, 4, 5, 6, 7) cho kết quả âm tính với PCR.

Tiến hành cắt kiểm tra plasmid của hai dòng 1 và 3 bằng hai cặp enzyme (BamHI và SacI) và (HindIII và SacI). Kết quả cho thấy, sản phẩm cắt bằng BamHI và SacI của cả hai dòng cho ra một băng kích thƣớc khoảng 820 bp phù hợp kích thƣớc gen DREB3. Sản phẩm cắt bằng HindIII và SacI cho một băng kích thƣớc khoảng hơn 2100 bp (phù hợp với kích thƣớc promoter rd29A và gen DREB3). Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng dòng 1 và dòng 3 đã đƣợc biến nạp thành công.

Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid

1, 3. Sản phẩm cắt bằng BamHI và SacI 1’, 3’. Sản phẩm cắt bằng HindIII, SacI

3.2.2. Biến nạp cấu trúc vector pBI101::rd29A::DREB3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1 3 M 1’ 3’

~2100 bp

48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Các dòng khuẩn lạc sau khi đƣợc lựa chọn thì tiến hành nuôi lỏng tăng sinh khối để tách plasmid. Plasmid thu đƣợc sau đó đƣợc biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens

chủng CV58 bằng phƣ ơng pháp xung điện . Sản phẩm biến nạp đƣợc cấy trải t rên môi trƣờng chƣ́a kanamycin , rifamycin, carbenicilin nồng độ mỗi loại là 50 mg/l. Các dòng khuẩn lạc thu đƣợc đƣợc tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên bằng phƣơng pháp colony -PCR. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.14.

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu A. Kết quả colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu rd29A for/rev

B. Kết quả colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu DREB3-BamHI/DREB3-SacI

Kết quả colony -PCR cho thấy ở cả 8 dòng khuẩn kiểm tra khi nhân với cặp mồi đặc hiệu của rd29A F/R cho thấy xuất hiện một băng có kích thƣớc khoảng 1300 bp phù

1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1300 bp ~ 820 bp ~ 1500 bp 1000 bp 1000 bp A B

49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hợp với kích thƣớc của promoter gen rd29A. Và với cặp mồi DREB3 F/R cũng cho kết quả xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 820 bp phù hợp với kích thƣớc của gen DREB3.

Nhƣ vậy , 8 dòng khuẩn đều đƣợc biến nạp thành công . Chúng tôi đã thu đƣợc chủng

Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen pBI::rd29A::DREB3.