III. Nội dung nghiên cƣ́u
2.2.1.4. Phương pháp tách dòng gen
Tinh sạch và gắn đoạn gen/promoter vào vector tách dòng pBT: Gen đƣợc làm sạch (thôi gel) theo quy trình QIAquick Gel Extraction Kit (Bioneer); sau đó đƣợc gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
STT Thành phần Thể tích
1 DNA (10 - 20 ng/µl) 7,5 µl
28
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3 Vector pBT (150 ng/ µl) 1µl
4 H2O 4 µl
5 T4 ligase (5 u/µl) 1 µl
Tổng 15 µl
Hỗn hợp trên đƣợc ủ ở 22oC trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli chủng DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α: Bổ sung 5µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc đặt trong đá 15 phút. Hỗn hợp đƣợc đặt vào bể ổn nhiệt ở 420C chính xác 1 phút 30 giây. Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp đƣợc đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút. Bổ sung 150 - 300 µl môi trƣờng LB lỏng. Hỗn hợp đƣợc nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 - 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (pBT: 100mg/l carbenicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM). Ủ đĩa petri ở 370
C qua đêm trong vòng 16 giờ.
Tách dòng các khuẩn lạc màu trắng bằng phương pháp Colony-PCR: Lấy tăm chấm vào khuẩn lạc, cho vào ống PCR đã có sẵn 5µl H2O. Bổ sung 15µl hỗn hợp phản ứng PCR.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony - PCR
STT Thành phần Thể tích
1 Đệm PCR 10X 2,5 µl
2 dNTPs (10 mM) 1,6 µl
3 Taq DNA polymerase (2 đơn vị/µl) 0,4 µl
4 DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) 5 µl
5 Nƣớc khử ion 8,9 µl
6 Mồi xuôi đặc hiệu (10 pmol/µl) 0,8 µl 7 Mồi ngƣợc đặc hiệu (10 pmol/µl) 0,8 µl
29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chu trình nhiệt phản ứng PCR: : 940
C/5 phút; 940C/1 phút, 530C/1 phút, 720C/1 phút 30 giây; 720C/10 phút, 40C/∞, 25 chu kì, Tm = 570
C.
Tách chiết plasmid tái tổ hợp đƣợc thực hiệntheo Sambrook và cs (2001) bằng sol 9 và tinh sạch bằng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen). Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8%. Plasmid kiểm tra đúng với kích thƣớc yêu cầu đƣợc đem đi đọc trình tƣ̣.
Bảng 2.5. Thành phần hoá chất tách plasmid
Ký hiệu Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 Sol II 0,2M NaOH, SDS 1%
Sol III 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20
Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 40 C