III. Nội dung nghiên cƣ́u
1.3.3. Promoter rd29A
Promoter là vùng DNA trong gen của sinh vật có chức năng khởi đầu quá trình phiên mã của gen. Tận dụng chức năng tự nhiên của promoter, các nhà khoa học có thể điều khiển hoạt động của các gen một cách có chủ đích ở các cá thể [9].
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sƣ̣ biểu hiện của gen rd29A (cor78 hay LTI78) là khác nhau dƣới các điều kiện hạn, mặn, lạnh, hay xƣ̉ lý ABA ngoại bào . Trong trình tƣ̣ đoạn promoter đầy đủ kích thƣớc khoảng 1300bp của gen rd29A có ít nhất hai loại nhân tố cis [9], [25], ABRE liên quan đến phản ƣ́ng lại stress kết hợp với ABA , và DRE phản ứng lại stress k hông phụ thuộc ABA . Sự biểu hiện gen rd29A là khác biệt với các gen rd khác, khi phân tích promoter của chúng đã xác định rằng nhân tố cis DRE (TACCGACAT) liên quan đến sƣ̣ biểu hiện nhanh đầu tiên của gen rd29A dƣới stress hạn , mặn, lạnh. Nhân tố cis ABRE liên quan đến sƣ̣ biểu hiện thƣ́ hai chậm hơn của gen rd29A dƣới các điều kiện stress này. Gen rd29A có thể gây ra bởi các stress khi nhân tố cis ABRE đƣợc loại bỏ khỏi vùng promoter.
DRE: Hai nhân tố hoạt động cis DRE tìm thấy trong vùng promoter rd29A [9], [16]. Vùng lặp 9bp chính xác là (TACCGACAT), với CCGAC là vùng trung tâm , nhóm lại thành nhân tố DRE , có chức năng phản ứng nhanh ban đầu của rd29A chống lại hạn , mặn, lạnh [16], [22], [36]. DRE là nhân tố cis cần thiết cho sƣ̣ điều tiết rd29A đƣợc gây ra bởi phản ƣ́ng lại sƣ̣ mất nƣớc không phụ thuộc ABA ở Arabidopsis. Các mô hình liên quan đến DRE đã đƣợc báo cáo trong promoter của vài gen điều tiết bởi stress thẩm thấu và nhiệt độ, bao gồm kin1, cor6.6/kin2, và rd17/cor47 ở Arabidopsis [22], [26], [36]. Một mô hình giống nhƣ vậy cũng đƣợc tìm thấy trong vùng promoter của gen gây ra bởi lạnh và sự mất nƣớc cor15A. Trong nghiên cƣ́u gần đây, 16 gen chƣ́a đƣ̣ng 5’-TACCGACAT- 3’ hay mô hình CCGAC đƣợc xác định trong vùng promoter của các gen gây ra bởi stress hạn ở Arabidopsis [21], [35]; giống các yếu tố phiên mã DREB1A và DREB2.
ABRE: Hầu hết , không phải tất cả các gen gây ra bởi sƣ̣ mất nƣớc đề u gắn với hoocmon thƣ̣c vật . Sƣ̣ khác biệt phần lớn dƣ̣a vào các nhân tố cis xuất hiện trong promoter của các gen gây ra bởi ABA . Các cách phụ thuộc ABA quan tâm đến gen biểu hiện trung gian thông qua nhân tố ABRE và yếu tố phiên mã b -ZIP, trong khi cách khác thông qua các nhân tố MYC và MYB và các yếu tố phiên mã [16], [22]. Nhiều nhân tố điều tiết cis đƣợc xác định nhƣ là nhân tố phản ƣ́ng lại ABA (ABRE). Trong số chúng , (C/T)ACGTG(G/T)C có chƣ́c năng giống ABRE ở nhiều gen . Nhân tố trung tâm của
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ABRE là CACGTG hay hộp G có chƣ́c năng điều tiết các gen thƣ̣c vật , làm cho chúng hoạt động bởi các dấu hiệu môi trƣờng đa dạng . Các nghiên cứu có hệ thống sự gắn DNA cho thấy rằng các nucleotide bên cạnh vùng trung tâm ACGT g ắn DNA đặc hiệu và theo sau hoạt hóa gen . Tuy nhiên, trong các promoter nhƣ là CDeT27-45 và CDeT6-19, phân lập tƣ̀ C.plantagineum, hộp G liên quan ABRE không xuất hiện để làm yếu tố chính quyết định phản ƣ́ng lại hạn hay ABA [16].
Hình 1.2. Sơ đồ về sƣ̣ trả lời các tác nhân stress môi trƣờng [26]
Hiện nay, promoter rd29A thƣờng đƣợc sƣ̉ dụng để thiết kế vector chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn , nhằm tăng cƣờng tính chống chịu của cây chuyển gen với c ác stress môi trƣờng . Promoter rd29A có vai trò điều hòa hoạt động của gen chuyển , nhằm mục đích tăng cƣờng hoạ t động của gen từ đó tăng cƣờng hoạt động chống lại stress của cây trồng [9].
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tác giả Trần Thị Cúc Hòa khi chuyể n cấu trúc vector pPNT ::rd29A::DREB1A
bằng phƣơng pháp biến nạp thông qua Agrobacterium vào giống đậu tƣơng Meverick , trong giai đoạn tạo chồi thì khoảng 50% chồi phát triển chậm, lá dày, thân chồi ngắn hơn so với cây đối chƣ́ng khô ng chuyển gen . Khi ra cây có 12 cây trong đó 3 cây dạng hình thấp, lá cứng và dày hơn cây đối chứng không chuyển gen [7]. Nhƣ vậy, trong điều kiện không xử lý stress , cấu trúc gen chuyển trong điều kiện bình thƣờng sẽ không hoạt động tuy nhiên có thể chèn lên các cấu trúc khác tƣ̀ đó đã ảnh hƣởng tới hình thái của cây đậu tƣơng chuyển gen.
Phân tích so sánh các dòng cây chuyển gen rd29A::GmDREB3 ở cây Arabidopsis
và thuốc lá với cây đối chứng trong đi ều kiện xử lý stress cho thấy : Khi xƣ̉ lý hạn , tất cả các cây đối chứng bị chết , trong khi đó 85% các dòng mang cấu trúc rd29A::GmDREB3
còn sống sót . Kết quả cho thấy sƣ̣ biểu hiện của GmDREB3 cải thiện tính chịu hạn của cây chuyển gen. Các phân tích tính chịu muối cho thấy sinh trƣởng của các cây đối chứng bị hạn chế, trong khi các cây chuyển gen duy trì sinh trƣởng bình thƣờng , chiều dài trung bình của rễ và các phần trên mặt đất của cây ch uyển gen đều lớn hơn so với cây đối chƣ́ng. Đánh giá về sƣ̣ biến đổi kiểu hình cho thấy , ở giai đoạn trƣởng thành và giai đoạn cây non, chiều cao trung bình của cây chuyển gen rd29A::GmDREB3 giống với cây đối chƣ́ng. Vì vậy, sƣ̣ biểu hiện chủ yếu của GmDREB3 trong Arabidopsis gây ra hiện tƣợng cây lùn không mong muốn , trong khi đó sƣ̣ biểu hiện của GmDREB3 điều khiển bởi promoter gây ra bởi stress rd29A hạn chế tối thiểu tác động tiêu cực đến sinh trƣởng bình thƣờng của cây chuyển gen trong điều kiện bình thƣờng . Đánh giá sƣ̣ biến đổi sinh lý của cây chuyển gen cho thấy: khối lƣợng tƣơi, hoạt động thấm thấu, hàm lƣợng chlorophyll trong lá cây của cây đối chứng và cây chuyển gen trong điều kiện bình thƣờng là giống nhau; còn trong điều kiện xƣ̉ lý hạn, mặn, lạnh thì cây chuyển gen cao hơn nhiều so cây đối chứng. Khi xem xét đến hàm lƣợng proline tƣ̣ do, cây chuyển thuốc lá chuyển gen tích lũy mƣ́c cao hơn so với cây đối chƣ́ng dƣới điều kiện hạn . Các kết quả trên cho thấy cây chuyển gen
GmDREB3 tăng cƣờng tính chống chịu của cây thuốc lá trong điều kiện hạn và mặn [15].