NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB

III. Nội dung nghiên cƣ́u

1.4.NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Protein liên kết với yếu tố phản ứng lại sự mất nƣớc (DREB) là những yếu tố phiên mã quan trọng liên quan đến stress môi trƣờng và khả năng chịu đựng stress của cây trồng. Nghiên cứu cấu trúc các protein họ DREB đã chỉ ra rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất để gắn với trình tƣ̣ DNA đặc hiệu là AP2/ ERF, cho phép chúng tƣơng tác với một loạt các gen phía sau theo hình thƣ́c không phụ thuộc ABA . Các miền AP2/ERF khá bảo thủ và các yếu tố phiên mã có chứa nó đƣợc tìm thấy ở nhiều loài thực vật [32], [38]. Vùng bảo thủ AP2/ERF của protein DREB có khoảng 60 amino acid. Thông qua đặc điểm cấu trúc của các yếu tố phiên mã DREB, có thể chia chúng thành 6 nhóm nhỏ từ A1 đến A6 [15], [20]. Các protein DREB của các nhóm khác nhau giữ nhiều vai trò ở thƣ̣c vật.

Khi so sánh trình tƣ̣ amino acid của các protein DREB tƣ̀ nhiều loài khác nhau cho thấy trình tƣ̣ giống nhau cao trong vùng AP2/ERF. Tuy nhiên, trình tự giống nhau ít hơn ở vùng đ ầu N và đầu C của các protein DREB. Các nhóm protein DREB, ngoại trừ các thành viên nhóm A4 và A5, đều có một mô hình bảo thủ cao ở vùng cuối của các trình tự protein, lần lƣợt là LWSY (A1), GDDGFSLFxY (A2), GSIWDxxDPFF (A3) và KYPSxEIDW (A6) [ 40]. Vùng giữa các yếu tố phiên mã DREB có vùng bảo thủ giàu Ser/thr gần kề vùng AP 2/ERF, gắn với DNA chịu trách nhiệm phosphoryl hóa protein

DREB dƣới các điều kiện khƣ̉ nƣớc [32], [40].

Các yếu tố phiên mã DREB có thể xác định và gắn nhân tố hoạt động cis

CRT/DRE (A/GCCGAC) trong các promoter và điều tiết sƣ̣ biểu hiện của các gen liên quan đến stress môi trƣờng ở thƣ̣c vật bậc cao . Bảy vị trí quan trọng liên quan tới sự tƣơng tác đặc trƣng cao với nhân tố CRT /DRE trong vùng AP2/EREBP lần lƣợt là 4 Arg (R), 2 Trp (W) và 1 Val (V) [40]. Hai nhân tố quan trọng YRG và RAYD định vị trong vùng AP2/EREBP có thể gắn với trình tƣ̣ promoter hoặc các protein tƣơng tác khác. Nhân tố YRG là vùng có thể hút nƣớc trong khu đầu N của vùng AP 2/EREBP, chƣ́a đƣ̣ng 19 đến 22 amino acid [40].

Phân tích protein cho thấy rằng cấu trúc vùng AP 2/EREBP chƣ́a đƣ̣ng 3 dải chuẩn không tƣơng đƣơng β và dải xoắn ốc α chạy song song với dải β [18], [40]. Hai dải β đầu tiên thuộc vào nhân tố YRG , V14 và E19 trong dải β thƣ́ hai giƣ̃ vai trò quan trọng trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

việc gắn các nhân tố cis DRE [18], [40]. Kết quả các đột biến thƣ̣c nghiệm phát hiện ra rằng các đột biến E19 không tác động đến việc gắn giƣ̃a yếu tố phiên mã DREB1A và nhân tố cis DRE, nhƣng vị trí đột biến tại vị trí V 14 hầu nhƣ điều khiển sƣ̣ mất hoạt động của protein DREB1A gắn với nhân tố cis DRE. Trong khi đó, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng E19 không bảo thủ trong DREB1 tƣ̀ lúa và lúa mạch và thay vào đó bởi valine . Trong hầu hết các loại protein OsDREB1, valine đƣợc tìm thấy ở cả vị trí 14 và 19, ngoại trừ

DREB1C. Các protein loại protein DREB1 khác trong phân lớp một lá mầm (lúa mạch , lúa mỳ và lúa mạch đen ) đều có một valine ở vị trí 19. Hơn nƣ̃a, qua so sánh các trình tƣ̣ protein DREB trong nguồn dƣ̃ liệu Arabidopsis thaliana với các loài khác tìm thấy ở tất cả các loài có valine ở vị trí 14 trong khi không thƣờng xuyên có glutamate ở vị trí 19, tƣ̀ đó đƣa ra đề xuất rằng V14 giƣ̃ vai trò quan trọng trong việc gắn các yếu tố phiên mã với nhân tố hoạt động cis DRE hơn E19 [14], [27], [32], [37], [38]. Nhân tố RAYD khác trong đầu C của vùng AP2/EREBP có chiều dài 42 đến 43 amino acid. Vùng 18 amino acid trung tâm bảo thủ cao của RAYD đƣợc dƣ̣ đoán là dạng xoắn α có hai đầu phân cực trong vùng AP2. Nghiên cƣ́u cho thấy rằng, A37 bảo thủ trong xoắn α của vùng AP2/EREBP có thể giƣ̃ vai trò quyết định trong việc gắn DNA hoặc sƣ̣ ổn định của vùng AP2/EREBP. Một dải β thƣ́ 3 trong vùng AP2/EREBP chƣ́a đƣ̣ng mô hình WLG , thuộc vào RAYD. Chƣ́c năng chính của nhân tố RAYD là để điều tiết hoạt động gắn đặc trƣng của các yếu tố phiên mã DREB

bằng cách tác động thể cấu tạo của nhân tố YRG hay tƣơng tác với các protein khác [40]. Sƣ̣ biểu hiện ra ngoài chủ yếu của DREB1A trong cây chuyển gen Arabidopsis gây ra biểu hiện mạnh của các gen phản ƣ́ng lại stress theo chiều thuận dƣới điều kiện không có stress, tăng cƣờng khả năng chịu lạnh và sƣ̣ khƣ̉ nƣớc. Tuy nhiên, sƣ̣ biểu hiện ra ngoài chủ yếu của DREB2A trong cây chuyển gen Arabidopsis không đủ để gây ra sƣ̣ cảm ƣ́ng các gen gây ra bởi stress. Phân tích các vùng của gen DREB2A của Arabidopsis khám phá ra rằng sƣ̣ hiện diện của khu vƣ̣c điều tiết âm trong vùng trung tâm (136 đến 165 aa); loại bỏ vùng điều tiết âm kích hoạt DREB2A thành dạng hoạt động DREB2A-AC. Sakuma và cs báo cáo rằng sƣ̣ hiện diện của trình tƣ̣ peptide (RSDASEVTSTSSQSEV CTVETPGCV) trong vùng điều tiết âm chƣ́a đƣ̣ng nhiều vị trí mục tiêu p hosphoryl hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cho protein kinase nhƣ là PKC và CK 2 [40]. Trình tự peptide này hoạt động nhƣ peptide dấu hiệu cho sƣ̣ suy biến protein và nó thay đổi khi có stress hạn, mặn.

Mỗi yếu tố phiên mã DREB có một vùng AP 2 bên trong các tr ình tự protein khác nhau, và nó có khoảng 60 amino acid cho thấy sƣ̣ giống nhau cao về trình tƣ̣ giƣ̃a các loài khác nhau. Trong một số nghiên cƣ́u mở rộng gần đây , vùng AP2 đã bất ngờ đƣợc tìm thấy trong các protein bên ngoài g iới thƣ̣c vật , ví dụ , trong vi khuẩn , bacteriophage và trùng lông mao thƣờng mã hóa vị trí đặc trƣng endonuclease [17], [40]. Các hiện tƣợng này cho thấy rằng vùng AP 2 ở thực vật có thể bắt nguồn từ vi khuẩn hay virus trong gen chuyển thông qua quá trình chuyển đoạn hay xác định vị trí . Phân tích trình tƣ̣ của tất cả các gen DREB1 cho thấy rằng chúng là các gen không có intron và sƣ̣ sao chép của chúng có thể gây ra bởi một họ đa gen trong quá trình tiến hóa của loài [40].

Hiện nay có hơn 10 thành viên thuộc họ gen mã hóa các yếu tố phiên mã dreb

đƣợc phát hiện trong hệ gen đậu tƣơng DREB1-AF514908, DREB2-DQ208968, DREB3- DQ208969, DREB3-DQ055133, DREB5-EF583447, DREB6-EF5 51166, DREB7- EF551167, DREBa-AY542886, DREBb-AY296651, DREBc- AY244760 trong đó 7 gen

GmDREB đƣợc gây ra bởi ABA, mặn, hạn và lạnh [30].

Nghiên cứu trên cây đậu tƣơng trong điều kiện vị stress, Li Xue – Ping và cs đã phân lập đƣợc 3 trình tự gen DREB từ hệ gen là GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc; lần lƣợt mã hóa cho các mạch polypeptide có 211, 312 và 198 amino acid với khối lƣợng phân tử dự đoán là 23, 35 và 21 kDa. Khi so sánh trình tự amino acid của 3 gen GmDREB

với các protein DREB đã đƣợc công nhận; cho thấy giữa 3 protein GmDREBa, GmDREBb

và GmDREBc quan hệ gần , với 91% xác định trong đoạn AP 2 của mỗi protein với 64 amino acid . Phân tích khả năng điều tiết phiên mã của các protein này trong nấm men thấy rằng là GmDREBa và GmDREBb có thể kích hoạt sự biểu hiện của gen truyền đạt thông tin, trong khi GmDREBc không có chức năng này . Sự sao chép của GmDREBa và

GmDREBb xuất hiện khi xử lý stress bởi hạn, mặn và lạnh trong lá cây đậu tƣơng non. Sự biểu hiện của GmDREBc không tác động đến lá nhƣng xuất hiện trong rễ khi xử lý mặn,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hạn và ABA. Các kết quả này đề xuất rằng chức năng của ba gen DREB đặc trƣng trong phản ứng lại với stress môi trƣờng của cây đậu tƣơng [24].

Khi nghiên cứu gây ra sự biểu hiện của nhân tố điều khiển phiên mã DREB và tác động của nó đến khả năng chịu hạn của cây lúa mỳ chuyển gen, Wang Jun Wei và cs đã thiết kế vector pBAC128F, mang gen DREB đƣợc điều khiển bởi promoter rd29B gây ra bởi hạn và gen bar đƣợc điều khiển bởi promoter CaMV 35s và gen Adhl intron ở ngô, đã đƣợc chuyển vào mô nuôi cấy của cụm hoa và phôi còn non của cây lúa mỳ đông lục bội CV.8901, 5-8, 99-92 và 104 bằng cách bắn gen trƣ̣c tiếp. Hơn 70 dòng cây chuyển gen đã đƣợc thu nhận. Phân tích PCR hệ gen và RNA điểm đã cho thấy rằng gen DREB đã xuất hiện trong hệ gen lúa mỳ của cây chuyển gen ở T0 và T1, và cũng đã đƣợc biểu hiện trong hạt giống thế hệ con cháu của các dòng chuyển gen khác. Lƣợng proline ở lá và hạt của các dòng chuyển gen T2 đã đƣợc phân tích. Trong 16 dòng chuyển gen kiểm tra, 10 dòng thu đƣợc lƣợng proline ở lá lớn gấp hai lần so với cây đối chứng. Dƣới điều kiện hạn, sau khi dừng tƣới nƣớc 15 ngày thì lá của các dòng chuyển gen vẫn xanh, trong khi cây đối chứng đã héo. Sau khi tƣới phục hồi 10 ngày, lá của dòng cây chuyển gen vẫn duy trì màu xanh của chúng, trong khi tất cả cây đối chứng đã chết. Nghiên cứu kết luận rằng một lƣợng mới yếu tố phiên mã DREB đƣợc tạo trong cây lúa mỳ đã gây ra tác động làm tăng khả năng chịu hạn [37].

Phân tích mức biểu hiện của yếu tố phiên mã DREB1 (GmDREB1) có kích thƣớc 604 bp trong giống đậu tƣơng chịu hạn (MG/BR46-conquista) và giống không chịu hạn (BR16) trong quá trình hạn nhân tạo. Khi so sánh với trình tƣ̣ trên GenBank có mã số AF514908.1 cho thấy hoàn toàn giống nhau. Phân tích biểu hiện trong điều kiện hạn cho thấy: GmDREB1 tăng cƣờng biểu hiện ở lá và rễ của cả hai giống và mức độ biểu hiện thay đổi tƣơng quan thuận với độ dài của khoảng thời gian thiếu nƣớc . Tuy nhiên, sƣ̣ gia tăng không giống nhau ở hai giống , MG/BR46 gia tăng ở mƣ́c sau xƣ̉ lý 1 giờ gần giống với BR16; ở mức 3 giờ và 5 giờ thì giống MG /BR46 giảm tập trung biểu hiện ở lá , mà tăng cƣờng tập trung biểu hiện ở rễ ; trong khi đó ở giống BR 16 thì sự biểu hiện ở lá vẫn tăng chậm trong khi sƣ̣ biểu hiện ở rễ giảm mạnh so với mƣ́c 1giờ [33].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Trong nghiên cƣ́u của mình , Nguyễn Hiệp Hòa và cs đã tách dòng và đọc trình tƣ̣ thành công gen DREB5 tƣ̀ RNA tổng số của giống đậu tƣơng địa phƣơng Xanh Tiên Đài . Khi so sánh trình tƣ̣ nucleotide 924 bp thu đƣợc với gen DREB5 mã số EF 583447 trên Genbank cho thấy chỉ số giống nhau đạt 90,4%. Tiến hành phân tích trình tƣ̣ amino acid suy diễn của gen DREB5 của giống Xanh Tiên Đài với EF583447 bằng phần mềm Bioedit cho thấy sƣ̣ tƣơng đồng đạt 87,8% [6].

Chen và cs đã nghiên cƣ́u một gen DREB, GmDREB3 (mã số DQ208969.1), thuộc nhóm A5, đƣợc phân lập tƣ̀ hệ gen đậu tƣơng có kích thƣớc đầy đủ là 597 bp, mã hóa cho 199 amino acid. Phân tích trình tƣ̣ chuỗi protein suy diễn cho thấy protein này chƣ́a đƣ̣ng một vùng bảo thủ AP2 có 58 amino acid và một vùng NSL. Phân tích vùng AP2 trong các protein AP 2/EREBP phân lập đƣợc tƣ̀ đậu tƣơng , Arabidopsis, ngô, lúa, cà ch ua, lúa mạch, bông và thuốc lá ; cho thấy rằng gen GmDREB3 đƣợc xếp vào nhóm A 5 của họ

DREB. Protein GmDREB3 cũng có valine ở vị trí 14, nhƣng ở vị trí 19 là leucine thay cho glutamic acid [15]. Trình tự promoter của GmDREB3 có chiều dài 1587 bp đƣợc phân lập tƣ̀ hệ gen đậu tƣơng . Vài nhân tố cis liên quan tới sƣ̣ điều tiết phiên mã ; giƣ̃a chúng là một hộp TATA đặc trƣng định vị ở -35 bp ngƣợc chiều với điểm khởi đầu phiên mã, 10 vị trí yếu tố phiên mã MYC đƣợc thƣ̀a nhận thuộc vào 7 nhóm (MC-1 đến MC-7), và 7 vị trí yếu tố phiên mã MYB đƣợc thƣ̀a nhận thuộc 5 nhóm (MB-1 đến MB-5). Giƣ̃a các vị trí MYC đƣợc thƣ̀a nhận , MC-1, MC-4 và MC-7 chia sẻ cùng một trình tƣ̣ bảo thủ l ần lƣợt với MC-2, MC-3 và MC-4 trong promoter của DREB1A/CBF3. Phân tích loại bỏ đầu cuối 5’ của promoter cho thấy rằng promoter GmDREB3 phản ứng lại với stress lạnh, và không thấy trong điều kiện bình thƣờng, mặn hay xƣ̉ lý ABA. Vùng từ -1403 đến -1058 làm suy giảm phản ứng lại lạnh của promoter GmDREB3 và vùng này có thể chứa đựng các nhân tố kìm hãm sƣ̣ phiên mã phản ƣ́ng lại với lạnh [15].

Dựa trên các nghiên cứu khác nhau cho thấy các protein DREB là những yếu tố phiên mã quan trọng trong việc điều chỉnh gen liên quan đến stress môi trƣờng và giữ vai trò quyết định trong truyền đạt sức chịu đựng stress cho thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

Nguyên liệu thực vật

Giống đậu tƣơng địa phƣơng Nâu Cao Bằng , giống DT 84 do trung tâm thƣ̣c nghiệm đậu đỗ cung cấp.

Chủng vi khuẩn và các nguyên liệu DNA

Vector pBI 101 do Đại học Tổng hợp Nebraska , Hoa Kỳ cung cấp . Vector tách dòng pBT, các chủng vi khuẩn E. coli (DH5α) và A. tumefaciens CV58C1, mồi pUC18, vector pBI101::rd29A::gus (Nguyễn Thị Thúy Hƣờng và cs ) do phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Hóa chất

Kit tinh sạch DNA (AccuPrep®

Gel Purification Kit ), kit tinh sạch plasmid (Plasmid Extraction Kit ) của hãng Bioneer (Hàn Quốc ). Các loại enzyme hạn chế của Fermentas (Hàn Quốc).

Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, Nƣớc khử ion. Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime, carberiline và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose,...) của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech…

Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior , Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech , Thụy Điển ), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA

Quy trình tách chiết DNA tổng số: Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

1 Tris - HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M

2 NaCl 5 M 1,4 M

3 EDTA 0,5 M 0,02 M

4 CTAB 4% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

5 H2O cất 5,2ml

Bổ sung thêm 700 µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ.

Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần).

Thêm 600 µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 4o

C, Trong 5 phút. Dùng pipette hút lấy 500µl dịch sang ống eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

Thêm 500 µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 4o

C, trong 10 phút.

Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dƣới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Thêm 50 µl nƣớc khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370

C trong 30 phút. Bảo quản DNA tổng số ở -200

NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp tổng hợp cDNA