III. Nội dung nghiên cƣ́u
3.3.2. Kết quả phân tích và đánh giá các dòng thuốc lá thu đƣợc
Tƣ̀ các cây th u đƣợc, chọn ngẫu nhiê n 40 dòng đem phân tích PCR với cặp mồi
rd29A F/DREB3 R thu đƣợc 21 dòng cho kết quả dƣơng tính với PCR, kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.1 nhân đƣợc một băng có kích thƣớc khoảng 2100 bp phù hợp với kí ch thƣớc với của đoạn promoter rd29A và gen DREB3.
Hình 3.16. Kết quả điện di các sản phẩm PCR các dòng thuốc lá thu đƣợc
(-) sản phẩm PCR DNA tổng số của cây thuốc lá không chuyển gen ; M: thang chuẩn DNA 1 kb , (+) sản p hẩm PCR plasmid pBI ::rd29A; 1-27: sản phẩm PCR DNA tổng số các dòng thuốc lá thu được.
Gen ngoại lai khi đƣợc biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở ba trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Tồn tại lâu dài dƣới dạng một thể plasmid độc lập tƣ̣ nhân; (3) Tồn tại ổn định nhƣ một đoạn DNA của một hệ gen trong tế bào chủ và đƣợc nhân lên theo dạng tƣơng hợp hay không tƣơng hợp . Kết quả dƣơng tính với PCR chỉ là kết quả bƣớc đầu giúp kiểm tra xem gen đƣợc chuyển vào cây hay không . Tuy nhiên, PCR dƣơng tính nhƣng chƣa thể khẳng định xem gen đó có hoạt động và tồn tại đƣợc qua nhiều thế hệ hay không [1], [11]; do có nhiều cách giải thích sƣ̣ tồn tại của DNA trong mẫu phân tích : ( i) vi khuẩn Agrobacterium mang gen tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tƣợng này xuất hiện ở nhiều đối tƣợng. Nếu là
(-) M (+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
~2100 bp 2000bp
52
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mẫu phân tích của thƣ̣c vật đã qua nhân giốn g hƣ̃u tính , tƣ́c là qua các thế hệ T 1, T2… dƣới dạng hạt rồi thì hoàn toàn loại trƣ̀ khả năng này . (ii) Gen chuyển tồn tại tƣ̣ do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính . (iii) Gen chuyển không hoạt động , tƣ́c là không đƣợc biểu hiện thành protein có chức năng sinh học [1].
A. Sau 10 ngày gây hạn
B. Sau 15 ngày gây hạn
62 9 57 21 13 5 ĐC ĐC 5 62 57 9 ĐC 9 57 21 13 5 62
53
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
C. Sau tưới nước phục hồi 10 ngày
Hình 3.17. Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen
Chúng tôi tiến hành xử lý hạn các dòng thuốc lá chuyển gen dƣơng tính với PCR nhằm đánh giá bƣớc đầu sƣ̣ hoạt động của gen chuyển dƣới sƣ̣ điều khiển của promoter
rd29A, có làm tăng cƣờng hoạt động của gen DREB3 trong cây thuốc lá chuyển gen tƣ̀ đó có tăng cƣờng khả năng chịu hạn hay không . Ở giai đoạn gây hạn 10 ngày, trong khi hầu hết các dòng cây chuyển gen lá còn xanh , thì cây đối chứng đã héo . Kết quả nhận thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen đƣợc tăng cƣờng hơn nhiều so với cây đối chƣ́ng . Trong đó dòng 9 có khả năng chịu hạn tốt nhất . Tuy nhiên, ở các dòng thuốc lá chuyển gen thì mƣ́c độ chịu hạn cũng khác nh au, nên mƣ́c độ héo lá ở các giai đoạn cũ ng khác nhau. Điều này là do có thể vị trí gen đƣợc chuyển vào các vị trí khác nhau trong tế bào nên có dòng đƣợc tăng cƣờng hoạt động , một số dòng bị ƣ́c chế hoạt động . Ngoài ra, một nguyên nhân nƣ̃a cũng có thể dẫn tớ i hiện tƣợng các dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn khác nhau là những dòng cây chỉ có duy nhất một bản copy của gen thì sẽ hoạt động mạnh hơn những dòng có nhiều bản copy , vì số lƣợng bản copy càng nhiều thì càng bị ức chế hoạt động. Sau khi tiến hành tƣới nƣớc trở lại 10 ngày, hầu hết các dòng thuốc lá đều tƣơi trở lại, trong khi cây đối chƣ́ng thì cũng có khả năng phục hồi tuy nhiên rất yếu.