PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III. Nội dung nghiên cƣ́u

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA

Quy trình tách chiết DNA tổng số: Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

1 Tris - HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M

2 NaCl 5 M 1,4 M

3 EDTA 0,5 M 0,02 M

4 CTAB 4%

5 H2O cất 5,2ml

Bổ sung thêm 700 µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ.

Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần).

Thêm 600 µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 4o

C, Trong 5 phút. Dùng pipette hút lấy 500µl dịch sang ống eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

Thêm 500 µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 4o

C, trong 10 phút.

Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dƣới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.

26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Thêm 50 µl nƣớc khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370

C trong 30 phút. Bảo quản DNA tổng số ở -200

C.

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Hạt đậu tƣơng đem trồng vào các chậu có giá thể TN1, đến khi cây đƣợc 4-5 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo, không tƣới nƣớc đến khi đất trong chậu khô thì bắt đầu tính ngày gây hạn . Mẫu thu để tách RNA là các mẫu lá đã bắt đầu bị héo trong quá trình gây hạn. Lá sau khi thu đƣợc bảo quản trong tủ - 800

C. Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều đƣợc khử DEPC 0,01%.

(1). Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng. (2). Bổ sung 1ml trizol regents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút.

(3). Bổ sug 500µl chloroform: isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút. (4). Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40

C.

(5). Lấy 600µl dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml.

(6). Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút. (7). Ly tâm 8000v/p trong 20 phút ở 40

C. (8). Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.

(9). Rửa RNA bằng cồn 700C (đã pha trong DEPC 0,01%). (10). Ly tâm 15 phút 7000-10000v/p trong 10 phút. Lặp lại 2 lần. (11). Làm khô 5 phút.

(12). Pha loãng RNA trong 40µl nƣớc khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 370C để RNA tan hết.

(13). Mẫu RNA thu đƣợc bảo quản trong tủ - 840C.

2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA

Tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo trình tƣ̣ [12]: (1). Thành phần phản ứng: RNA 5µl Mồi oligo dT 1µl H2O khƣ̉ DEPC 6µl Đảo đều nhẹ nhàng, sau đó ủ 650

C. Sau 5 phút, lấy ra cho vào đá. (2). Thành phần phản ƣ́ng: Đệm 5X 4µl

27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Ribolock RI 1µl dNTP 10mM 2µl Revert E 1µl Ủ 420 C trong 60 phút, 700C trong 5 phút. 2.2.1.3. Phản ứng PCR

Gen DREB3 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu DREB3

F/DREB3 R. Chu trình nhiệt: 940C/3 phút, 940C/30 giây, 550C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây, 720C/7 phút, 40C/∞, 25 chu kì, Tm = 580

C.

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

STT Thành phần Thể tích

1 Đệm Dream Taq 2,5 µl

2 dNTPs (10 mM) 2,5 µl

3 Dream Taq DNA polymerase (2 đơn vị/µl) 1 µl

4 DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) 0,5 µl

5 Nƣớc khử ion 16,5 µl

6 Mồi xuôi đặc hiệu (10 pmol/µl) 1 µl 7 Mồi ngƣợc đặc hiệu (10 pmol/µl) 1 µl

Tổng thể tích 25µl

2.2.1.4. Phương pháp tách dòng gen

Tinh sạch và gắn đoạn gen/promoter vào vector tách dòng pBT: Gen đƣợc làm sạch (thôi gel) theo quy trình QIAquick Gel Extraction Kit (Bioneer); sau đó đƣợc gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng

STT Thành phần Thể tích

1 DNA (10 - 20 ng/µl) 7,5 µl

28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3 Vector pBT (150 ng/ µl) 1µl

4 H2O 4 µl

5 T4 ligase (5 u/µl) 1 µl

Tổng 15 µl

Hỗn hợp trên đƣợc ủ ở 22oC trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến

E.coli chủng DH5α.

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α: Bổ sung 5µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc đặt trong đá 15 phút. Hỗn hợp đƣợc đặt vào bể ổn nhiệt ở 420C chính xác 1 phút 30 giây. Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp đƣợc đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút. Bổ sung 150 - 300 µl môi trƣờng LB lỏng. Hỗn hợp đƣợc nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 - 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (pBT: 100mg/l carbenicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM). Ủ đĩa petri ở 370

C qua đêm trong vòng 16 giờ.

Tách dòng các khuẩn lạc màu trắng bằng phương pháp Colony-PCR: Lấy tăm chấm vào khuẩn lạc, cho vào ống PCR đã có sẵn 5µl H2O. Bổ sung 15µl hỗn hợp phản ứng PCR.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony - PCR

STT Thành phần Thể tích

1 Đệm PCR 10X 2,5 µl

2 dNTPs (10 mM) 1,6 µl

3 Taq DNA polymerase (2 đơn vị/µl) 0,4 µl

4 DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) 5 µl

5 Nƣớc khử ion 8,9 µl

6 Mồi xuôi đặc hiệu (10 pmol/µl) 0,8 µl 7 Mồi ngƣợc đặc hiệu (10 pmol/µl) 0,8 µl

29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chu trình nhiệt phản ứng PCR: : 940

C/5 phút; 940C/1 phút, 530C/1 phút, 720C/1 phút 30 giây; 720C/10 phút, 40C/∞, 25 chu kì, Tm = 570

C.

Tách chiết plasmid tái tổ hợp đƣợc thực hiệntheo Sambrook và cs (2001) bằng sol 9 và tinh sạch bằng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen). Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8%. Plasmid kiểm tra đúng với kích thƣớc yêu cầu đƣợc đem đi đọc trình tƣ̣.

Bảng 2.5. Thành phần hoá chất tách plasmid

Ký hiệu Thành phần

Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 Sol II 0,2M NaOH, SDS 1%

Sol III 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20

Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 40 C

2.2.1.5. Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3

Trình tự mồi đặc hiệu tách dòng không chứa trình tự enzyme cắt , vì vậy, để phục vụ thiết kế vector c huyển gen chúng tôi sƣ̉ dụng thêm trình tƣ̣ cặp mồi có thêm trình tƣ̣ nhận biết điểm cắt của BamHI, SacI.

Trƣớc tiên , nuôi lỏng khuẩn chƣ́a vector pBT::DREB3, sau đó tiến hành PCR plasmid thu đƣợc với cặp mồi đặc hiệu DREB3-BamHI/DREB3-SacI. Chu trình nhiệt: 940C/5 phút; 940C/30 giây, 570C/30 giây, 720C/40 giây; 720C/10 phút, 40C/∞, 30 chu kì, Tm = 570C. Thành phần phản ứng tƣơng tự phản ứng colony-PCR.

Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành cắt BamHI, SacI.

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắtbằng enzyme BamHI, SacI

STT Thành phần Thể tích

1 H2O khƣ̉ ion 37,5µl

2 Đệm Tango 10X 10µl

30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

SacI (10 u/µl) 1,5µl

4 DNA 50µl

Tổng 100µl

Đồng thời, nuôi lỏng khuẩn chƣ́a vector pBI ::rd29A, sau đó tách plasmid. Plasmid thu đƣợc tiến hành phản ƣ́ng cắt BamHI, SacI ở 370

C trong 3 giờ.

Tiến hành ligase sản phẩm gen DREB3 cắt BamHI, SacI vào vector pBI ::rd29A

cũng đƣợc xử lý BamHI, SacI.

Sản phẩm ligase đƣợc biến nạp vào tế bào E .coli, cấy trải trên môi trƣờng có chƣ́a kháng sinh kanamycin 50 mg/l. Chọn lọc các dòng khuẩn lạc biến nạp thành công , sau đó nuôi lỏng và tách plasmid phục vụ biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens.

Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào A . tumefaciens bằng phương pháp biến nạp bằng xung điện : Tế bào khả biến A. Tumefaciens chủng C58 lấy tƣ̀ tủ -840C đặt vào trong đá 5 phút. Bổ sung 1µl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và mix nhẹ . Rửa Cuvette bằng cồn 1000

C, rửa lại bằng nƣớc khử ion rồi thấm khô , khử trùng bằng tia UV . Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vector tái tổ hợp vào Cuvette . Xung điện: 2,5kv, 25µF và điện trở 400. Sau đó bổ sung 700 µl LB lỏng và mix nhẹ. Đặt ngay vào đá. Chuyển dịch khuẩn tƣ̀ cuvette sang ống eppendorft 2ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. Chuyển 300µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh kanamycin 50mg/l, rifamycin 50mg/l và carbenicillin 50mg/l. Ủ ở 280C từ 24-48 giờ. Tiến hành colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn thu đƣợc. Cuối cùng, điện di kiểm tra sản phẩm.

2.2.2. Phƣơng pháp tái sinh cây và chuyển gen thông qua Agrobacterium

Các thí nghiệm của phần nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc thực hiện trong phòng nuôi cấy mô với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux.

2.2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua Agrobacterium

Phƣơng pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm đƣợc tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cs (2001) có cải tiến [2], [5], [9].

31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chủng vi khuẩn Agrobacterium có ch ứa gen quan tâm đƣợc bảo quản trong glycerol trong tủ - 800 đƣợc nuôi trong LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc , nuôi lắc 200v/p trong điều kiện 280C qua đêm , sau đó cấy vạch trên môi trƣờng LB đặc có chƣ́a kháng sinh thích hợp , nuôi tối ở 280

C trong 2 ngày. Chọn khuẩn lạc tròn đều , đƣ́ng độc lập nuôi lỏng phục vụ biến nạp, mƣ́c OD600nm phù hợp là từ 0,6-1. Sau đó đem ly tâm lạnh thu cặn khuẩn, cặn khuẩn đƣợc hòa tan với dung dịch CCMl tạo dịch huyền phù khuẩn.

Bảng 2.7. Môi trƣờng nuôi cấy đậu tƣơng

STT MÔI TRƢỜNG THÀNH PHẦN

1 LBl Bacto pepton10g/l + NaCl 10g/l + yeast extract 5g/l, pH 7 LBđ Tƣơng tƣ̣ LBl nhƣng thêm Agar 9g/l

2 GM 3,052 g/l muối B5 + sucrose 20g/l + Agar 6g/l pH 5,8 1mg/l vitamin B5

3 CCMl

0,3052g/l Muối B 5 + 3,9g/l MES + sucrose 30g/l, pH 5,4 1mg/l vitamin B5 + 1,0-3,0 mg/l BAP + 0,2mM Acetosrington (AS) + 400mg/l L-cystein + 158mg/l sodium thiosulfate + 154mg/l DTT + 0,25mg/l GA3

CCMđ Tƣơng tƣ̣ CCMl nhƣng có thêm agar 6g/l

4

SIMl 0,3052g/l Muối B 5 + 0,59g/l MES + sucrose 30g/l, pH 5,6 1mg/l vitamin B5 + 1,0-3,0 mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim SIM0 Giống SIMl nhƣng có thêm thạch agar 6g/l

SIMKana 100

Giống SIM0 nhƣng thành phần kháng sinh bao gồm: 500 mg/l cefotaxim + 100 mg/l kanamycin

5 SEM

4,3g/l MS + 0,59g/l MES + sucrose 30g/l, pH 5,6 1mg/l vitamin B5 + 50mg/l L-asparanine + 100mg/l L-pyron glutamic acid + 0,1-0,5 mg/l IAA + 0,5-1,5 mg/l GA3 + 500

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cefotaxim + 75 kanamycin

6 RM 1,58 g/l MS + 0,59g/l MES + sucrose 20g/l + Aga 6g/l, pH 5,6 0,1mg/l IBA, 1mg/l vitamin B5 + 250mg/l cefotaxim Hạt chín đƣợc loại bỏ tạp chất, các hạt kém chất lƣợng và tiến hành khử trùng bằng khí clo. Khí clo đƣợc tạo ra bằng cách bổ sung 3ml HCl đậm đặc vào 100ml javen. Việc khử trùng đƣợc thực hiện trong một bình kín và đặt trong tủ hút. Sau khi khử trùng, cho hạt nảy mầm trên môi trƣờng GM. Sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, hạt đậu tƣơng chín sau khi đƣợc khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm sẽ đƣợc gây tổn thƣơng bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm . Lá mầm đã bị tổn thƣơng đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium chƣ́a gen quan tâm trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy CCMđ. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.

Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp đƣợc lắc trong môi trƣờng cảm ƣ́ng tạo chồi (SIMl) có bổ sung 500mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng để rƣ̉a khuẩn . Cắt bỏ chồi chính trên các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trƣờng tạo cụm chồi có bổ sung 500mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng SIMkana100 đặc có bổ sung 500mg/l cefotaxim và kháng sinh kanamycin nồng độ 100mg/l.

Sau 2 tuần, các cụm chồi sống đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng phát triển chồi (SEM) có bổ sung 500mg/l cefotaxim và kháng sinh kanamycin 50mg/l. Khi các chồi phát triển đạt kích thƣớc từ 3-5cm sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng ra rễ (RM) có bổ sung 250mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh. Sau 2 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh sẵn sàng cho ra bầu trấu : cát (1:1). Cây phát triển với 4-5 lá thật thì chuyển ra trồng trong bầu chƣ́a giá thể TN1 dƣới điều kiện nhà kính.

2.2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium

Quy trình biến nạp thuốc lá tiến hành theo Topping và cs [4], [9]. Bƣớc chuẩn bị khuẩn biến nạp giống với biến nạp ở đậu tƣơng , cặn khuẩn đƣợc hòa tan với dung dịch ½ MS thu dịch huyền phù khuẩn.

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.8. Môi trƣờng nuôi cấy thuốc lá

STT MÔI TRƢỜNG THÀNH PHẦN

1 MS MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l, pH 5,8

2 GM MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + BAP 1mg/l, pH 5,8 3 RM MS + sucrose 30g/l + Aga 8g/l + IBA 0,1mg/l, pH 5,8

Cây con phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành biến nạp . Các mảnh lá đƣợc cắt với kích thƣớc khoảng 1cm2

và đặt lên môi trƣờng tái sinh GM. Sau hai ngày, mảnh lá sẽ đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 10 phút, các mảnh lá sẽ đƣợc đặt lên môi trƣờng đồng nuôi cấy GM (BAP 1mg/l) 2 ngày. Sau đó , các mảnh lá tiếp tục đƣợc chuyển lên môi trƣờng GM (BAP 1mg/l) có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, cefotaxim 500mg/l để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục đƣợc cắt chuyển sang môi trƣờng GM mới.

Sau 4-5 tuần các chồi phát triển cao khoảng 2-3cm thì đƣợc cắt và chuyển sang môi trƣờng ra rễ RM, bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, cefotaxim 500mg/l để tái sinh.

Sau 3 - 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh với 3-4 lá thật sẵn sàng cho ra bầu trấu : cát (1:1). Cây phát triển với 4-5 lá thật thì chuyển ra trồng trong bầu chƣ́a giá thể TN1 dƣới điều kiện nhà kính.

2.2.3. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen

2.2.3.1. Phương pháp PCR

Các cây chuyển gen đƣợc trồng ra đất sau một thời gian thu mẫu lá tách DNA . Tiến hành phản ƣ́ng PCR tƣ̀ DNA tổng số của cây chuy ển gen, nhằm xác định nhanh ban đầu các cây đƣợc chuyển gen thành công.

2.2.3.2. Phương pháp gây hạn nhân tạo

Phƣơng pháp gây hạn nhân tạo đƣợc tiến hành nhằm đánh giá tính chịu hạn của cây chuyển gen xem vector chuyển gen có hoạt động và tăng khả năng của cây chuyển gen so với cây đối chƣ́ng.

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Các số liệu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học trên máy vi tính bằng