Kết quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổng số giống đậu tƣơng Nâu Cao Bằng

III. Nội dung nghiên cƣ́u

3.1.1. Kết quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổng số giống đậu tƣơng Nâu Cao Bằng

Hiện nay, trên ngân hàng gen thế giới có hai trình tự gen DREB3 đã đƣợc công nhận với mã số DQ055133.1 và DQ208969.1, trong đó DQ208969.1 có liên quan đến stress lạnh ở cây đậu tƣơng [15]. Chúng tôi dựa vào cấu trúc gen DREB3 (mã số : DQ055133.1) có kích thƣớc 819 bp để thiết kế cặp mồi đặc hiệu có trình tƣ̣ tƣơng ƣ́ng sau đây:

Mồi DREB3 forward ATGGCAGCTTTGATGGATTTTTAC Mồi DREB3 reverse ATTCAAAGAGGAGGAGCAGCTT

Sau đó , chúng tôi tiến hành gây hạn nhân tạo và thu mẫu lá của cây đậu tƣơng giống Nâu Cao Bằng bị hạn . Mẫu lá đậu tƣơng đƣợc tiến hành tách RNA tổng số . Tƣ̀ lƣợng RNA tổng số , chúng tôi tiến hành tổng hợp cDNA theo phản ƣ́ng tổng hợp cDNA đƣợc đề cập ở mục 2.2.1.2. Tiến hành nhân gen DREB3 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu DREB3 F/R tƣ̀ thƣ viện cDNA, sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel ag arose

35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

0,8%. Kết quả hình 3.1 cho thấy đoạn gen thu đƣợc đúng kích thƣớc trình tƣ̣ gen

GmDREB3 mã số DQ055133.1.

Hình 3.1. Kết quả nhân gen DREB3 M: thang DNA chuẩn 1kb

3.1.2. Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng

Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α

Gen DREB3 đƣợc ligase vào vector tách dò ng pBT . Tiếp theo vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt . Sau đó, sản phẩm biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin, X-gal và IPTG. Cơ chất X-gal giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng . Trên môi trƣờ ng có chƣ́a kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG , phát triển hai loại khuẩn lạc : khuẩn lạc màu xanh v à khuẩn lạc màu trắng đƣợc thể hiện trong hình 3.2.

~ 820 bp

36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.2. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến DH5α

Tất cả các khuẩn lạc này là nhƣ̃ng khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp plasmid chƣ́a gen kháng kháng sinh carbenicillin, nhƣng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp. Vì vậy, các khuẩn lạc màu trắng đƣợc lựa chọn để thực hiện các bƣớc tiếp theo của quá trình tách dòng.

Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng colony-PCR

Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chƣ́a đoạn gen

DREB3 quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc khuẩn lạc bằng kỹ thuật colony -PCR. Vì số lƣợng khuẩn lạc là khá nhiều nên chúng tôi chọ n ngẫu nhiên 8 khuẩn lạc trắng để thƣ̣c hiện phản ƣ́ng colony-PCR sƣ̉ dụng cặp mồi pUC18 for/rev (hình 3.3). Sản phẩm colony- PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Nếu khuẩn có plasmid mang gen DREB3 thì sản p hẩm PCR sẽ xuất hiện một băng có kích thƣớc mong muốn khoảnggần 1000 bp.

37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩmcolony-PCR chọn lọc khuẩn lạc mang gen DREB3 M: thang DNA chuẩn 1kb, 1-8:các dòng khuẩn lạc đem chọn lọc

Hình ảnh điện di cho thấy, trong 8 dòng khuẩn lạc trắng kiểm tra có 7 dòng cho kết quả dƣơng tính với PCR , ngoại trừ dòng thứ 4 cho kết quả âm tính . Tƣ̀ kết quả colony - PCR, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 dòng khuẩn lạc (1, 2, 3, 5, 6) đem nuôi lỏng vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự.

Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng BamHI

Hình 3.4. Điện di sản phẩmcắt kiểm tra plamid bằng enzyme BamHI

M: thang DNA chuẩn 1kb; (1,2,3,5,6): các dòng khuẩn lạc dương tính với PCR

Chúng tôi tiến hành phản ứng cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme BamHI để khẳng định chắc chắn rằng plasmid mới tách chiết có mang đoạn gen DREB3 quan tâm . Sản

1 2 3 5 6 M

~ 820bp

~ 1000 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 M

38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phẩm cắt plasmid đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%, kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.4. Kết quả cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế BamHI cho các băng kích thƣớc đúng ở tất cả các dòng lƣ̣a chọn . Vì vậy, chúng tôi c họn ngẫu nhiên plamid tách đƣợc tƣ̀ 3 dòng là 3, 5, 6 đem đi đọc trình tƣ̣.

Kết quả đọc trình tự

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 atggcagctttgatggatttttacagcagcagcacagagtttcaacttcactcagatccattcaggggtgaactaatggaagttcttgaaccttttatga DREB3-CLONE3 .............................................C................................................. DREB3-CLONE5 ............................................................................................... DREB3-CLONE6 ............................................................................................... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

dreb3-DQ055133.1 aaagtcctttctcaaccccttctccttcaaattcttgttttctttctacctcttactctccttcccccaacaactactctccctccctatactcaaacgg DREB3-CLONE3 .............................................................................................. DREB3-CLONE5 .............................................................................................. DREB3-CLONE6 .............................................................................................. 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 gttatcatccatacccaacaccacccaaaacttaattggtttcgggcaagggcagcccacatctcttgtgggcctgaaccacctaaccccatctcagatc DREB3-CLONE3 ..............T............................................................................. DREB3-COLNE5 ............................................................................................ DREB3-CLONE6 ............................................................................................ 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 tctcagatccaggcccaaatccagatccagaatcacagcaacacgctgagcttcctggggccgaagcccatccctatgaagcacgtgggcatgcctccga DREB3-CLONE3 ................................................................................................ DREB3-CLONE5 ................................................................................................ DREB3-CLONE6 ................................................................................................ 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 agcccacgaagctatacagaggggttcgacagaggcactgggggaagtgggtggctgagattagactcccgaagaaccggaccaggctatggctgggaac DREB3-CLONE3 ......................................................................................... DREB3-CLONE5 ......................................................................................... DREB3-CLONE6 G........................................................................................ 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 cttcgacaccgccgaggaagccgctctggcgtacgacaaggccgcgtacaagctccgaggtgacttcgccaggctcaacttccccaacctccgacaccag DREB3-CLONE3 .................................................................................................... DREB3-CLONE5 ..................G................................................................................. DREB3-CLONE6 ..................................................G................................................. 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 ggttcctccgtcggtggtgacttcggggagtataagcctcttcattccgccgttgacgccaagcttcaggccatttgcgagggcctggctgagctgcaga DREB3-CLONE3 ................................................................................................ DREB3-CLONE5 .........................................................G...................................... DREB3-CLONE6 ................................................................................................ 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

dreb3-DQ055133.1 aacaggggaagaccgagaagcctccgaggaaaacgcgatccaaactcgcttctccgccagagaacgacaacaacaacgacaacaactcttgtaaggtcga

DREB3-CLONE3 .................................................................................................... DREB3-CLONE5 .................................................................................................... DREB3-CLONE6 .................................................................................................... 810 820 ....|....|....|....| dreb3-DQ055133.1 agctgctcctcctctttga DREB3-CLONE3 ................... DREB3-CLONE5 ................... DREB3-CLONE6 ...................

Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tƣ̣ nucleotide

Kết quả đọc trình tƣ̣ cho thấy gen DREB3 thu đƣợc có kích thƣớc 819 bp. Khi so sánh trình tự gen DREB3 và trình tự gen đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen, chúng tôi thu đƣợc một số kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.1.

39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.1. Sƣ̣ sai khác về trình tƣ̣ nucleotide và amino acid của 3 trình tự gen DREB3 thu đƣợc với gen GmDREB3 mã số DQ055133.1

Dòng Vị trí thay đổi Nucleotide trên trình tƣ̣ DQ055133.1 Nucleotide trên trình tƣ̣ phân lập Amino acid bị thay đổi Amino acid tạo thành Dòng 3 Vị trí 48 T C - -

Vị trí 215 C T Leucine Proline

Dòng 5 Vị trí 519 A G - -

Vị trí 662 A G Lysine Arginine

Dòng 6 Vị trí 401 A G Arginine Lysine

Vị trí 551 A G Arginine Lysine

Dƣ̣a vào kết quả đọc trình tƣ̣ nucletode có thể thấy sƣ̣ sai khác với gen DREB3 mã số DQ055133.1 chỉ là sai khác trên từng dòng khuẩn cụ thể do sai sót trong quá trình đọc trình tự hoặc do xuất hiện các bản copy khác nhau tron g hệ gen cây đậu tƣơng, nhƣng khi xem xét trình tƣ̣ chung cả 3 dòng thu đƣợc thì trình tự gen DREB3 thu đƣợc giống 100% với gen DREB3 trên ngân hàng gen. Thông qua kết quả đọc trình tự nucleotide và so sánh trình tự amino acid suy diễn, chúng tôi nhận thấy : ở dòng 6 có sự biến đổi của hai amino acid nên chúng tôi không lƣ̣a chọn . Còn hai dòng 3 và 5 đều thay đổi một vị trí amino acid và các amino acid mới đƣợc tạo ra đều có nhƣ̃ng đặc tính về cấu trúc và tính chất giống với amino acid cũ , nhƣ ở dòng 3 thì cả leucine và proline đều thuộc nhóm amino acid không phân cƣ̣c kị nƣớc ; trong khi đó arginine và lysine ở dòng 5 đều thuộc nhóm amino acid tích điện dƣơng . Từ đó, chúng tôi chọn ra dòng 5 đem tiến hành thiết kế vector chuyển gen, vì so về cấu trúc thì arginine và lysine có tính tƣơng đồng hơn về cấu trúc, đều là dạng mạch cacbon thẳng.

3.2.3. Phân tích và xếp nhóm protein DREB3 dƣ̣a vào vùng bảo thủ AP2

Khi nghiên cƣ́u về trình tƣ̣ amino acid của gen DREB3 thu đƣợc, chúng tôi nhận thấy vùng bảo thủ AP2, tƣ̀ vị trí amino acid 137 đến 197.

40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MAALMDFYSSSTEFQLHSDPFRGELMEVLEPFMKSPFSTPSPSNSCFLSTSYSPSPNNYSPS LYSNGLSSIPNTTQNLIGFGQGQPTSLVGLNHLTPSQISQIQAQIQIQNHSNTLSFLGPKPIP MKHVGMPPKPT KLYRGVRQRHWGKWVAEIRLPKNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDKAAYKLRGDFARLN FPN LRHQGSSVGGDFGEYKPLHSAVDAKLQAICEGLAELQKQGKTEKPPRKTRSKLASPPEN DNNNDNNSCKVEAAPPL

Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tƣ̣ amino acid của protein DREB3

Vùng AP2 của gen DREB3 thu đƣợc hoàn toàn trùng khớp với vùng AP 2 của gen

GmDREB3 trên ngân hàng gen quốc tế . Vùng AP2 có cấu trúc 3 dải β và một dải xoắn ốc α giống nhƣ vùng AP 2 của các gen khác thuộc họ AP 2/ERF. Trong vùng AP2 của gen

GmDREB3 có sự xuất hiện của valine ở vị trí 14 giống với tất cả các gen DREB3 khác, và vị trí thứ 19 là leucine thay vì là glutamic acid, vị trí 37 là amino acid loại A cũng khá bảo thủ. Các vị trí V 14, A37 có vai trò quan trọng trong quá trình gắn với trình tự DNA đặc trƣng trong quá trình phiên mã.

Dƣ̣a vào sƣ̣ phân nhóm các protein thuộc họ AP 2/ERF đƣợc đề cập trong các tài liệu [17], [26], [27], [28], [38]. Chúng tôi tiến hành phân tích và so sánh vùng AP 2 của protein DREB3 thu đƣợc với các vùng AP 2 của các protein thuộc họ AP 2/ERF, kết quả đƣợc trình bày cụ thể trong hình 3.7 và 3.8. Danh sách các trình tự protein sử dụng đƣợc nêu cụ thể trong ph ần phụ lục. Vì trình tự gen DREB3 thu đƣợc giống 100% với trình tƣ̣ gen GmDREB3 mã số DQ055133, nên chúng tôi sƣ̉ dụng kí hiệu gen là GmDREB3 mã số DQ055133 để phân biệt với trình tự gen gen GmDREB3 mã số DQ208969.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....

RAV2-Solanum ---SRYKGVVPQP-NGRWGAQIYEKHQR---VWLGTFNEENEAARAYDIAAQRFR---GRDAVTNFK--- RAV1-Arabidopsis ---SKYKGVVPQP-NGRWGAQIYEKHQR---VWLGTFNEEDEAARAYDVAVHRFR---RRDAVTNFKDV--- RAV2-Arabidopsis ---SKYKGVVPQP-NGRWGAQIYEKHQR---VWLGTFNEQEEAARSYDIAACRFR---GRDAVVNFKNV---

41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

RAV1-Solanum ---SKFKGVVPQP-NGRWGAQIYEKHQR---IWLGTFNGEEEAARAYDIAAQRFR---GRDAVTNFK--- GmDREBc ---CNYRGVRQRT-WGKWVAEIREP-NRG---NRLWLGTFPTAIGAALAYDEAAQAMY---GSCARL--- GmDREBa ---CNYRGVRQRT-WGKWVAEIREP-NRG---SRLWLGTFPTAISAALAYDEAAMAMY---GFCARLNFPNV--- TaDREB1 ---CAYRGVRQRT-WGKWVAEIREP-NRG---NRLWLGSFPTAVEAARAYDDAARAMY---GAKARVNFSEQ--- OsDREB2A ---CAYRGVRQRT-WGKWVAEIREP-NRG---RRLWLGSFPTALEAAHAYDEAARAMY---GPTARVNFADN--- GhDBP2 ---KLYRGVRQRH-WGKWVAEIRLP-RNR---TRLWLGTFDTAEEAALAYDKAAYKLR---GDFARLNFPNLRHHGSHVGDY

GmDREB3-DQ055133.1 ---KLYRGVRQRH-WGKWVAEIRLP-KNR---TRLWLGTFDTAEEAALAYDKAAYKLR---GDFARLNFPNL--- GmDERBb ---KLYRGVRQRH-WGKWVAEIRLP-KNR---TRLWLGTFDTAEEAALAYDNAAFKLR---GEFARLNFPHL--- ZmDBF1 ---KLYRGVRQRH-WGKWVAEIRLP-RNR---TRLWLGTFDTAEQAALAYDQAAYRLR---GDAARLNFPDN--- ORCA2 ---RYRGVRRRP-WGKFAAEIRDPKRKG---SRIWLGTYETAEDAALAFDQAAFQLR---GSRARLNFPNL--- ORCA3 ---KFAAEIRDPKKKG---SRIWLGTYETPEDAALAYDAAAFNMR---GAKARLNFPHL--- AtERF ---KHYRGVRQRP-WGKFAAEIRDPAKNG---ARVWLGTFETAEDAALAYDIAAFRMR---GSRALLNFP--- AtERF1 ---KSYRGVRRRP-WGKFAAEIRDSTRNG---IRVWLGTFESAEEAALAYDQAAFSMR---GSSAILNF--- AtERF5 ---KHYRGVRQRP-WGKFAAEIRDPNKRG---SRVWLGTFDTAIEAARAYDEAAFRLR---GSKAILNFP--- ZmABI4 ---RYRGVRQRS-WGKWVAEIREP-RKR---SRKWLGTFATAEDAARAYDRAALLLY---GPRAHLN--- GmSGR ---RYRGVRQRS-WGKWVAEIREP-RKR---TRKWLGTFATAEDAARAYDRAAIILY---GSRAQLNLQ--- GmDREB1 ---YRGIRMRK-WGKWVAEIREPNKR---SRIWLGSYTTPVAAARAYDTAVFYLR---GPTARLNFPEL--- GhDBP1 ---FRGIRMRK-WGKWVAEIREPNKR---SRIWLGSYTTPVAAARAYDTAVFYLR---GPSARLNFPDL---