tách dòng và biểu hiện gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh pseudoalteromonas haloplanktis ant505 trong e. coli và nghiên cứu tính chất của chúng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Trƣờng Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Văn Trƣờng - phó trưởng phòng Di truyền vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị cán bộ phòng Di truyền vi sinh vật đã giúp đỡ, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Tác giả Đỗ Thị Thu Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện từ tháng 9 năm 2010 tới tháng 8 năm 2011. Thái Nguyên, ngày 24 tháng 09 năm 2011 Tác giả Đỗ Thị Thu Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cảm ơn Lời cam đoan MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Vi khuẩn ưa lạnh 3 1.2. Nơi sống của vi khuẩn ưa lạnh 4 1.3. Enzyme thích ứng lạnh 4 1.4. Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp 6 1.5. Pectin và pectinase 8 1.5.1. Pectin 8 1.5.2. Pectinase 9 1.5.2.1. Phân loại pectinase 9 1.5.2.2. Sự phân cắt cơ chất pectin bằng pectinase 11 1.6. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp 14 1.6.1. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây 14 1.6.2. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp dệt may 14 1.6.3. Ứng dụng pectinase trong công nghệ sinh học 14 1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15 1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15 1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 17 2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 17 2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị 17 2.2. Địa điểm nghiên cứu 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp tách DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 18 2.3.2. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 19 2.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen 20 2.3.4. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 21 2.3.5. Phương pháp giải trình tự gen 25 2.3.6. Phương pháp biểu hiện gen 25 2.3.7. Phương pháp thu enzyme ngoại bào, nội bào 25 2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính enzyme pectinase 26 2.3.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 29 3.2. Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 29 3.3. Kết quả tách dòng gen pelC trong E. Coli 30 3.4. Kết quả đọc trình tự gen pelC 31 3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC 33 3.5.1. Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC 33 3.5.2. Phản ứng gắn đoạn gen pelC vào pET43b và biến nạp vào chủng E. coli BL21 34 3.5.3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của các thể biến nạp trên môi trường thạch 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii 3.5.4. Kiểm tra sự có mặt pelC trong các thể biến nạp BL21/pET43pelC 35 3.6. Biểu hiện enzyme tái tổ hợp PelC (rPelC) trong môi trường lỏng 36 3.7. Nghiên cứu một số tính chất của rPelC 37 3.7.1. Hoạt tính pectate lyase của rPelC 37 3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme 38 3.7.3. Ảnh hưởng của ion Ca² + và Na + đến hoạt tính pectinase của rPelC 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 1. ARN Ribonucleic Acid 2. bp Base pair 3. Cs Cộng sự 4. CTAB Cetyl trimethylammonium bromide 5. dH 2 O Nước khử ion 6. DNA Deoxyribonucleic acid 7. dNTP Deoxyribonucleotide 8. E. coli Escherichia coli 9. EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit 10. EtBr Ethydium bromide 11. IPTG Isopropylthio--D-galactoside 12. Kb Kilobase 13. kDa Kilo Dalton 14. LB Luria and Bertani 15. PCR Polymerase Chain Reaction 16. SDS Sodium dodecyl sulfate 17. TAE Tris - acetate - EDTA 18. v/p Vòng / phút 19. VSV Vi sinh vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp (Ohgiya, 1999) 7 Bảng 1.2. Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990) 10 Bảng 2.1. Chu kỳ phản ứng PCR 20 Bảng 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%) 27 Bảng 2.4. Công thức pha gel cô (5%) 27 Bảng 3.1. Hoạt tính pectinase của rPelC khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau 36 Bảng 3.2. Phát hiện liên kết đôi trong sản phẩm sau phản ứng phân cắt pectin acid của rPelC 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV 5 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin 9 Hình 1.3. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases. 11 Hình 1.4. Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. 12 Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt 21 Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 29 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pelC 30 Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin 31 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC 31 Hình 3.5. Trình tự nucleotide và amino acid của gen pelC 32 Hình 3.6. Kết quả điện di plasmid pET43b sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 33 Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector biểu hiện pET43/pelC vào tế bào E. coli BL21(DE3) 34 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra khả năng tạo vòng thủy phân pectin của các thể biến nạp 35 Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự có mặt của pelC trong các chủng BL21/pET43pelC 35 Hình 3.10. Kết quả biểu hiện rPelC trong E. coli BL21(DE3) ở 30 o C 37 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rPelC 39 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme rPelC 39 Hình 3.13. Ảnh hưởng của ion Ca² + đến hoạt tính enzyme rPelC 40 Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion Na + đến hoạt tính enzyme rPelC 40 [...]... Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 và nghiên cứu được tính chất của pectinase tái tổ hợp Nội dung nghiên cứu: 1 Tách dòng gen pectinase (pelC) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 2 Thiết kế vector biểu hiện gen pelC trong E coli 3 Biểu hiện gen pelC trong chủng vi khuẩn E coli BL21 4 Nghiên cứu tính chất của PelC tái tổ hợp Ý nghĩa của đề tài: Ý nghĩa khoa học: Làm sáng tỏ tính chất. .. tài: Tách dòng và biểu hiện gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 trong E coli và nghiên cứu tính chất của chúng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Mục tiêu, nội dung nghiên cứu của đề tài Mục tiêu: - Biểu hiện được enzyme pectinase PelC tái tổ hợp hoạt động ở nhiệt độ thấp, phân lập từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas. .. nguồn gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 đã được TS Lê Văn Trường và cộng sự (Vi n Công nghệ Sinh học) tạo dòng và giải trình tự trong những nghiên cứu trước đây Tuy nhiên cho đến nay enzyme này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ tính chất cũng như khả năng xúc tác phân hủy cơ chất pectin Chính vì vậy, để hiểu rõ tính chất của enzyme này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề... chú ý của chính các vi khuẩn, nấm (đặc biệt là nấm men) và vi tảo Trong số các vi khuẩn đã được tìm thấy, thường gặp nhất là các vi khuẩn Gram âm α-, β-, γ-proteobacteria (Pseudomonas spp và Vibrio spp.) và ngành CytophagaFlavobacterium-Bacteriodes Các chủng vi khuẩn Gram dương thường được phát hiện là vi khuẩn họ Coryne (Arthrobacter sp và Micrococus sp.) [29] Hầu hết chúng được phân lập dễ dàng từ môi... cho hiệu suất cao và khả năng hòa tan trong nước lạnh tốt của TS Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự [2] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Chủng vi khuẩn và plasmid - Chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 được Weyland phân lập từ biển Nam cực [47],... phân lập từ biển Nam cực [47], do TS Lê Văn Trường (Vi n Công nghệ sinh học) cung cấp - Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α và BL21 được sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein PelC, vector pJET1.2/blunt sử dụng làm vector tách dòng và vector pET43b (Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện 2.1.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị - Hóa chất: Pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose,... enzym được bổ sung vào bánh mỳ, bánh cookie, bánh cracker [1] Nghiên cứu của ThS Lê Hồng Phú trường Đại học Bách khoa Thành Phố Hồ Chí Minh về tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ vi khuẩn Aspergillus niger và ứng dụng của 2 enzyme này trong vi c biến vỏ cà phê thành phân hữu cơ, khắc phục tình trạng ô nhiễm do vỏ cà phê không được xử lý ở nước ta [3] Nghiên cứu ứng dụng pectinase trong sản xuất bột... Phản ứng Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Hoàn tất kéo dài Kết thúc phản ứng Nhiệt độ (oC) 94oC 94oC 55oC 72oC 72oC 4oC Thời gian 2 phút 30 giây 30 giây 1 phút 10 phút  Chu kỳ 30 2.3.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen Phương pháp tách dòng gen Đoạn gen pelC sau khi nhân lên bằng PCR được tách dòng vào vector pJET1.2/blunt của hãng Fermentas Nguyên lý tách dòng của vector pJET... fructose-1,6-bisphosphate aldolase và gluco-6phosphate dehydrogenase của Vibrio marinus sẽ mất 100% hoạt tính sau 30 phút ở 35-36oC [21] Theo Morita, malic dehydregenase bán tinh sạch của chủng Vibrio marinus MP-1 sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 20oC, trong khi nhiệt độ hoạt động tối ưu là khoảng 15-20oC [27] Hay như lactate dehydrogenase của VSV ưa lạnh V marinus, có hoạt tính tối đa ở 10-15oC và mất hoạt tính ở 40oC... dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên Chính vì vậy mà vi c sử dụng enzyme pectinase thích ứng lạnh tác động loại bỏ thành tế bào thực vật để tạo ra tế bào trần (protoplast) có ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật [30] 1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng pectinase . Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 và nghiên cứu được tính chất của pectinase tái tổ hợp. Nội dung nghiên cứu: 1. Tách dòng gen pectinase (pelC) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis. ANT/505. 2. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC trong E. coli. 3. Biểu hiện gen pelC trong chủng vi khuẩn E. coli BL21. 4. Nghiên cứu tính chất của PelC tái tổ hợp. Ý nghĩa của đề tài: Ý nghĩa. 3.3. Kết quả tách dòng gen pelC trong E. Coli 30 3.4. Kết quả đọc trình tự gen pelC 31 3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC 33 3.5.1. Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC 33 3.5.2.