Phương pháp tách dòng gen
Đoạn gen pelC sau khi nhân lên bằng PCR được tách dòng vào vector pJET1.2/blunt của hãng Fermentas.
Nguyên lý tách dòng của vector pJET 1.2/blunt.
pJET1.2/blunt là một vector nhân dòng đầu bằng đã mở vòng, có khả năng chèn một đoạn từ 6bp tới 10kb.
Những sản phẩm PCR đầu bằng được tạo ra bởi các DNA polymerase proofreading có thể được gắn trực tiếp chỉ trong 5phút với vector pJET1.2/blunt. Những sản phẩm PCR với Adenide gắn ở đầu 3’ được tạo ra bởi việc sử dụng Taq DNA polymerase hoặc những DNA polymerase non- proofreading khác được làm bằng đầu trong 5 phút với DNA blunting enzyme (đã có trong kit) trước khi gắn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vector pJET1.2/blunt khi khép vòng sẽ biểu hiện một protein độc gây chết tế bào chủ sau khi biến nạp. Kết quả là, chỉ có những dòng tái tổ hợp chứa đựng đoạn chèn xuất hiện trên đĩa nuôi cấy.
Các bước được tiến hành như sau:
Bƣớc 1. Làm tù đầu đoạn gen pelC, thành phần phản ứng như sau: - Đệm 2X: 5 µl
- Sản phẩm PCR (đoạn gen pelC): 2 µl
- Enzyme làm tù đầu (blunting enzyme): 0, 5 µl.
- Phản ứng được ủ ở 70oC trong 5 phút, sau đó làm nguội xuống 22o C.
Bƣớc 2. Gắn đoạn gen pelC vào vector:
- Bổ sung 0,5 µl vector pJET1.2/blunt vào dịch phản ứng ở bước 1. - Bổ sung 0,5 µl T4 ligase. Phản ứng gắn được thực hiện ở 16oC qua đêm.
Bƣớc 3. Biến nạp hỗn hợp phản ứng gắn vào tế bào khả biến E. coli DH5
bằng phương pháp xung điện. + Chuẩn bị tế bào khả biến
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5α trong môi trường LB lỏng trên máy lắc 200v/p ở 37oC qua đêm.
- Cấy chuyển 1% dịch tế bào vào 100ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp 220v/p ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,5 - 0,7, sau đó ủ đá trong 1 giờ.
- Thu dịch và ly tâm 4000v/p trong 10 phút ở 4oC. - Bổ sung nước cất để rửa và ly tâm tiếp 2 lần. - Hòa lại cặn trong 0,5 ml nước khử ion lạnh.
- Chia tế bào khả biến sang ống eppendoft, mỗi ống 100µl. + Biến nạp bằng xung điện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Hút 1µl sản phẩm ligate vào ống eppendoft chứa tế bào khả biến, trộn nhẹ, đưa vào cuvet xung điện.
- Xung điện ở điều kiện 2,5 KV, 250 F. - Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC. - Hút dịch từ cuvert ra ống eppendoft. - Lắc 220v/p, 37oC trong 1 giờ.
- Trải 100µl dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 100µg/ml, giữ trong tủ ấm 37oC qua đêm trước khi kiểm tra khuẩn lạc sau biến nạp.
Phương pháp tách DNA plasmid
Các khuẩn lạc E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp được nhân lên riêng rẽ trong môi trường LB lỏng với sự có mặt của ampicillin. Tế bào được thu ở cuối pha sinh trưởng để tách DNA plasmid.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị tế bào E. coli
- Chọn các khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi mọc riêng rẽ trên môi trường thạch, nuôi tăng sinh trong ống nuôi có chứa kháng sinh với tỉ lệ thích hợp trên máy lắc 220v/p ở 37oC qua đêm.
- Ly tâm 13000 vòng/1 phút trong 1 phút từ 1,5ml sinh khối vi khuẩn E. coli, bỏ dịch nổi, thu sinh khối.
Chuẩn bị dung dịch phân giải tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thêm 200 µl dung dịch Sol I đệm làm huyền phù lại (Resuspension Buffer) vào sinh khối vi khuẩn, votex cho đến khi cặn tan hoàn toàn.
- Thêm 200 µl dung dịch Sol II đệm dung giải (Lysis Buffer), đảo trực tiếp cẩn thận bằng tay 3-4 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thêm 200 µl dung dịch Sol III đệm trung hòa (Neutralization Buffer), tiếp tục đảobằng tay 3-4 lần.
- Bổ sung 500 µl Chloroform: Isoamin (24:1) dùng để hòa tan protein để chiết protein thu DNA.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút dịch trong ở pha trên (hút 500 µl) bổ sung 1 ml cồn 96oC để lạnh (- 20oC) trong 30 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút thu cặn. - Loại bỏ dịch, spin rồi hút hết nước.
- Làm khô trong box.
- Hòa vào 50 µl nước cất vô trùng và giữ mẫu ở -20oC. Tinh sạch DNA
- Làm sạch DNA từ agarose. - Cắt DNA mong muốn.
- Cân miếng gel chứa DNA, bổ sung thể tích dung dịch Buffer QG gấp 3 lần. - Ủ 60oC cho đến khi gel tan thành dịch lỏng (từ 15 phút đến 30 phút). - Hút dịch trên cho qua cột, ly tâm 13000v/phút (từ 30 giây đến 1 phút). - Loại bỏ dịch qua cột, thêm 700 µl dung dịch đệm rửa (Washing Buffer) vào và ly tâm như trên lặp lại lần thứ 2.
- Ly tâm 13000v/phút trong 2 phút để loại bỏ đệm.
- Chuyển cột sang eppendoft, bổ sung 30 µl nước cất vô trùng đợi 2 đến 5 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA Plasmid. - Cất mẫu ở -20o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn