Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505
+ Chuẩn bị đệm CTAB buffer: Total: 100ml - CTAB 2% - Tris HCl 100mM (pH = 8) - EDTA 20mM - NaCl 1,4M (M = 58,4g) + Dung dịch β- mercaptoethanol 2% + Proteinase K 0,1mg/ml + Phương pháp tách DNA tổng số:
- Vi khuẩn Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 từ đĩa thạch môi trường Zobell, đem cấy chuyển sang 2ml môi trường LB nuôi lắc trong tủ lạnh, 200 vòng, qua đêm.
- Dịch nuôi được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút thu tế bào. - Cho 500 µl CTAB buffer, dung dịch β- mercaptoethanol 2%, proteinase K 0,1mg/ml vào ống effpendort chứa tế bào vi khuẩn ANT/505.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Bổ sung 500 µl Chloroform/ isoaminalcohol, lắc mạnh bằng tay hoặc máy voltex trong 2 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút (làm bước này 2 lần), sau khi ly tâm hút 500 µl dịch trong ở lớp trên.
- Cho 1ml ethanol 96% vào 500 µl dịch trong vừa thu được để tủa khoảng 20 phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút.
- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ dịch thu cặn ( làm bước này 2 lần cho sạch).
- Làm khô trong box và bổ sung 50µl nước khử ion. - Bảo quản ở -20oC.
2.3.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
Phương pháp này được dùng để phân tích định tính và định lượng trong việc thu nhận mẫu acid nucleic; nguyên tắc là dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic. Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường các phân tử này sẽ chuyển động về phía điện cực dương. Tính linh động của các phân tử acid nucleic này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng phân tử (số lượng nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel.
Cách tiến hành:
+ Chuẩn bị gel agarose
- Để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số nồng độ gel 0.8% được khuyến cáo sử dụng. Cân 0,8g agarose cho vào lọ thủy tinh với 100 ml TAE 1X.
- Gel được đun kĩ đến khi các hạt gel được tan hoàn toàn.
- Chờ cho gel giảm nhiệt độ xuống khoảng 60oC. Đổ gel nhẹ nhàng vào hộp gel đã chuẩn bị sẵn khuôn và lược. Sau khoảng 30 phút có thể rút lược ra để điện di.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Điện di DNA.
- Chuẩn bị bể điện di, đổ đệm TAE 1X và đặt khuôn gel đã chuẩn bị vào. - Dùng pipet trộn 6 µl dung dịch DNA và 3 µl loading dye 6X để tra vào các giếng. Hút 7 µl marker chuẩn 12kb tra vào một giếng để so sánh.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 100V- 150V trong khoảng 35 phút hoặc vạch màu xanh chạy khoảng 2/3 bản gel thì dừng.
+ Nhuộm gel và phân tích kết quả.
- Gel được lấy ra khỏi khuôn gel và nhuộm trong Ethilium bromide, lắc nhẹ để gel nhuộm đều.
- Kết quả điện di được phát hiện trên máy đo UV ở bước sóng 260nm.
2.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen
Phản ứng PCR được thực hiện theo nguyên tắc của Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Mạch DNA mới được tổng hợp từ mạch khuôn với mồi đặc hiệu nhờ enzyme Taq polymerase với sự có mặt của các dNTP và ion Mg2+ và được thực hiện trên các máy chu trình nhiệt (máy PCR).
Thành phần cho phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.1. Chu kỳ phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) dH2O vô trùng 32 Buffer 2X 5 dNTP 2mM 5 PelC F 50 mM/µl 2 PelC R 50 mM/ µl 2
Taq polymerase 1u/ µl 2
DNA khuôn mẫu 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94oC 2 phút
2 Biến tính 94oC 30 giây
30
3 Gắn mồi 55oC 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72oC 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72oC 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 4oC
2.3.4. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen Phương pháp tách dòng gen Phương pháp tách dòng gen
Đoạn gen pelC sau khi nhân lên bằng PCR được tách dòng vào vector pJET1.2/blunt của hãng Fermentas.
Nguyên lý tách dòng của vector pJET 1.2/blunt.
pJET1.2/blunt là một vector nhân dòng đầu bằng đã mở vòng, có khả năng chèn một đoạn từ 6bp tới 10kb.
Những sản phẩm PCR đầu bằng được tạo ra bởi các DNA polymerase proofreading có thể được gắn trực tiếp chỉ trong 5phút với vector pJET1.2/blunt. Những sản phẩm PCR với Adenide gắn ở đầu 3’ được tạo ra bởi việc sử dụng Taq DNA polymerase hoặc những DNA polymerase non- proofreading khác được làm bằng đầu trong 5 phút với DNA blunting enzyme (đã có trong kit) trước khi gắn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vector pJET1.2/blunt khi khép vòng sẽ biểu hiện một protein độc gây chết tế bào chủ sau khi biến nạp. Kết quả là, chỉ có những dòng tái tổ hợp chứa đựng đoạn chèn xuất hiện trên đĩa nuôi cấy.
Các bước được tiến hành như sau:
Bƣớc 1. Làm tù đầu đoạn gen pelC, thành phần phản ứng như sau: - Đệm 2X: 5 µl
- Sản phẩm PCR (đoạn gen pelC): 2 µl
- Enzyme làm tù đầu (blunting enzyme): 0, 5 µl.
- Phản ứng được ủ ở 70oC trong 5 phút, sau đó làm nguội xuống 22o C.
Bƣớc 2. Gắn đoạn gen pelC vào vector:
- Bổ sung 0,5 µl vector pJET1.2/blunt vào dịch phản ứng ở bước 1. - Bổ sung 0,5 µl T4 ligase. Phản ứng gắn được thực hiện ở 16oC qua đêm.
Bƣớc 3. Biến nạp hỗn hợp phản ứng gắn vào tế bào khả biến E. coli DH5
bằng phương pháp xung điện. + Chuẩn bị tế bào khả biến
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5α trong môi trường LB lỏng trên máy lắc 200v/p ở 37oC qua đêm.
- Cấy chuyển 1% dịch tế bào vào 100ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp 220v/p ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,5 - 0,7, sau đó ủ đá trong 1 giờ.
- Thu dịch và ly tâm 4000v/p trong 10 phút ở 4oC. - Bổ sung nước cất để rửa và ly tâm tiếp 2 lần. - Hòa lại cặn trong 0,5 ml nước khử ion lạnh.
- Chia tế bào khả biến sang ống eppendoft, mỗi ống 100µl. + Biến nạp bằng xung điện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hút 1µl sản phẩm ligate vào ống eppendoft chứa tế bào khả biến, trộn nhẹ, đưa vào cuvet xung điện.
- Xung điện ở điều kiện 2,5 KV, 250 F. - Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC. - Hút dịch từ cuvert ra ống eppendoft. - Lắc 220v/p, 37oC trong 1 giờ.
- Trải 100µl dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 100µg/ml, giữ trong tủ ấm 37oC qua đêm trước khi kiểm tra khuẩn lạc sau biến nạp.
Phương pháp tách DNA plasmid
Các khuẩn lạc E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp được nhân lên riêng rẽ trong môi trường LB lỏng với sự có mặt của ampicillin. Tế bào được thu ở cuối pha sinh trưởng để tách DNA plasmid.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị tế bào E. coli
- Chọn các khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi mọc riêng rẽ trên môi trường thạch, nuôi tăng sinh trong ống nuôi có chứa kháng sinh với tỉ lệ thích hợp trên máy lắc 220v/p ở 37oC qua đêm.
- Ly tâm 13000 vòng/1 phút trong 1 phút từ 1,5ml sinh khối vi khuẩn E. coli, bỏ dịch nổi, thu sinh khối.
Chuẩn bị dung dịch phân giải tế bào
- Thêm 200 µl dung dịch Sol I đệm làm huyền phù lại (Resuspension Buffer) vào sinh khối vi khuẩn, votex cho đến khi cặn tan hoàn toàn.
- Thêm 200 µl dung dịch Sol II đệm dung giải (Lysis Buffer), đảo trực tiếp cẩn thận bằng tay 3-4 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thêm 200 µl dung dịch Sol III đệm trung hòa (Neutralization Buffer), tiếp tục đảobằng tay 3-4 lần.
- Bổ sung 500 µl Chloroform: Isoamin (24:1) dùng để hòa tan protein để chiết protein thu DNA.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút dịch trong ở pha trên (hút 500 µl) bổ sung 1 ml cồn 96oC để lạnh (- 20oC) trong 30 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút thu cặn. - Loại bỏ dịch, spin rồi hút hết nước.
- Làm khô trong box.
- Hòa vào 50 µl nước cất vô trùng và giữ mẫu ở -20oC. Tinh sạch DNA
- Làm sạch DNA từ agarose. - Cắt DNA mong muốn.
- Cân miếng gel chứa DNA, bổ sung thể tích dung dịch Buffer QG gấp 3 lần. - Ủ 60oC cho đến khi gel tan thành dịch lỏng (từ 15 phút đến 30 phút). - Hút dịch trên cho qua cột, ly tâm 13000v/phút (từ 30 giây đến 1 phút). - Loại bỏ dịch qua cột, thêm 700 µl dung dịch đệm rửa (Washing Buffer) vào và ly tâm như trên lặp lại lần thứ 2.
- Ly tâm 13000v/phút trong 2 phút để loại bỏ đệm.
- Chuyển cột sang eppendoft, bổ sung 30 µl nước cất vô trùng đợi 2 đến 5 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA Plasmid. - Cất mẫu ở -20o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.5. Phương pháp giải trình tự gen
Plasmid mang đoạn gen kích thước như mong muốn được chọn để xác định trình tự gen. Quá trình giải trình tự được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm, viện Công nghệ Sinh học bằng máy đọc trình tự tự động ABI 3100 với phần mềm Sequencing Analysis.
2.3.6. Phương pháp biểu hiện gen
+ Cấy hoạt hóa 1 khuẩn lạc trong môi trường LB có bổ sung ampicilline với nồng độ cuối là 50µg/ml nuôi lắc ở 37oC, 200v/ph qua đêm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Cấy chuyển 2% vào 20ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin nồng độ 50µg/ml tiếp tục nuôi lắc ở 37oC để OD đạt 0,3 - 0,5.
+ Cảm ứng IPTG tới nồng độ cuối 1mM, tiếp tục nuôi lắc ở 30oC trong 4 giờ.
+ Thu mẫu sau cảm ứng, ly tâm 10.000v/p trong 5 phút, thu dịch nổi và thu tế bào, bảo quản - 20o
C.
+ Kiểm tra hoạt tính enzyme bằng phương pháp đường khử.
+ Protein thu được từ phần dịch nổi và cặn được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE).
2.3.7. Phương pháp thu enzyme ngoại bào, nội bào
Sau khi biểu hiện enzyme kết thúc, dịch nuôi cấy được ly tâm 10.000v/ph trong 5 phút ở 4oC, dịch nổi được thu lại chính là dịch chứa enzyme ngoại bào. Phần tế bào lắng ở đáy ống chứa enzyme nội bào được hòa lại trong đệm Tris 10nM pH 7,5 trong 1/10 thể tích ban đầu. Dịch tế bào được phá bằng siêu âm trong đá lạnh sau đó được ly tâm 10.000 v/ph trong 10 phút, phần dịch nổi chứa enzyme nội bào được thu nhận và bảo quản - 20o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính enzyme pectinase
Phương pháp phát hiện đầu đường khử của Bernfeld
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào phản ứng màu của nhóm C=O với 3,5 dinitrosalicillic axit (DNSA), giá trị OD đo ở bước sóng 530nm phản ánh lượng đường tạo thành từ quá trình phân cắt phân tử pectinase của enzyme pectinase.
Tiến hành:
Chuẩn bị:
+ Đệm phản ứng: Tris 50mM, NaCl 20 mM, CaCl2 0,1mM (pH 8,8). + 0,2% pectin trong đệm phản ứng.
Phản ứng enzyme:
+ Hút 50µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch 0,2% pectin trong đệm Tris 50 mM, ủ 30oC trong 1 giờ.
+ Bổ sung 400 µl DNSA, đun sôi trong 5 phút, làm nguội ở nhiệt độ phòng. + Đo OD ở bước sóng 530 nm.
Đơn vị hoạt tính enzyme (unit) được định nghĩa là lượng enzyme pectinase phân cắt cơ chất pectin tạo ra 1 nM galactose trong 1 phút.
Phương pháp phát hiện liên kết đôi
Phản ứng enzyme được chuẩn bị và thực hiện như phương pháp đường khử. Sau khi phản ứng enzyme kết thúc, dịch phản ứng được ly tâm 10000 v/ph trong 5 ph sau đó đo trực tiếp trên máy quang phổ ở bước sóng 232nm.
2.3.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide chuẩn bị với thành phần như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%)
Thành phần Nồng độ cuối các Thành phần trong gel 12 % 10ml dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamid 12 % 4,0 Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375 M 2,5 10% SDS 0,1 % 0,1 10% APS 0,1 % 0,1 TEMED 0,002% 0,004
Bảng 2.4. Công thức pha gel cô (5%)
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 5 % 3ml dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamid 5 % 0,5 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38 10% SDS 0,1 % 0,03 10% APS 0,1 % 0,03 TEMED 0,001% 0,003
Chuẩn bị mẫu điện di protein ngoại bào
0,5 ml dịch enzyme ngoại bào thu được bằng ly tâm ở phần trên được tủa với 1ml cồn lạnh ở - 20oC qua đêm, sau đó được ly tâm 14.000v/ph trong 10 phút, 4oC. Loại dịch nổi, phần protein lắng phía dưới được làm khô và hòa trở lại trong 30μl Tris 10mM pH6.8, bổ sung 30μl đệm mẫu 2x, biến tính nhiệt ở 95oC trong 5 phút. Làm lạnh trong đá tan sau đó tra mẫu vào điện di. Tra 30 μl vào mỗi giếng điện di. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chuẩn bị mẫu điện di protein nội bào
Hút 10 μl đệm mẫu 2x cho vào 10 μl dịch nội bào (được thu ở mục 2.3.7 ), trộn đều và biến tính như chuẩn bị mẫu điện di dịch ngoại bào. Tra 20 μl mẫu vào mỗi giếng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Để nhân gen pelC từ chủng vi khuẩn ANT/505, trước hết DNA tổng số được tách chiết từ tế bào chủng ANT/505 như mô tả trong phần phương pháp. DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Kết quả điện di cho thấy băng DNA có kích thước lớn, đậm, gọn và không chứa ARN. Điều này chứng tỏ DNA tổng số đảm bảo nồng độ, độ tinh sạch, không bị đứt gãy, là nguyên liệu tốt cho phân tích PCR sau này (hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas
haloplanktis ANT/505 1: DNA Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505,
2: DNA marker (Fermentas).
3.2. Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn
Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505
Trình tự cặp mồi được lựa chọn như sau: PelC-F1/NdeI: ata cat atg caa aaa cat cct cgc a PelC-R1/XhoI: gat ctc gag ttt taa gtc atc aaa gctt
DNA tổng số của vi khuẩn Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 sau khi tách chiết được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen pelC 1193 bp sử dụng mồi xuôi (PelC-F1/NdeI) và mồi ngược
Kb - 10 - 8 - 6 - 5 - 4 - 3 - 2.5 - 2 - 1.5 - 1 - 0.75 - 0.50 - 0.25 1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(PelC-R1/XhoI). Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 1X. Kết quả trên điện di đồ cho thấy trong mẫu DNA được sử dụng làm khuôn mẫu đã khuếch