Sau khi được nhân lên bằng PCR từ mẫu DNA vi khuẩn ANT/505, pelC
được phân tách trên gel agarose. Băng DNA 1,2 kb được cắt ra, làm sạch, làm tù đầu và gắn vào vector pJET1.2/blunt (hình 2.2) và biến nạp vào E. coli
DH5α. như đã mô tả trong phần phương pháp (2.3.4). Các thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường thạch đĩa LB chứa ampicilin 100 µg/ml. Những tế bào có chứa vectơ nhưng không mang đoạn gen chèn sẽ không thể sinh trưởng được do gen gây chết (lethal gene) có trong vùng đa điểm nối (multiple cloning site) của vector gây ra. Ngược lại những tế bào mang vector có đoạn gen chèn sẽ làm hỏng gen gây chết (knock out) trong vector làm cho gen này không biểu hiện được do đó tế bào sẽ sống được và phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Kết quả biến nạp chúng tôi thu được các thể biến nạp trên mỗi đĩa môi trường chọn lọc, không có khuẩn lạc nào mọc trên đĩa đối chứng điều này chứng tỏ phản ứng gắn và phương pháp biến nạp đã thành công (hình 3.3).
Băng 1,2 kb
1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin
Các khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc được nhân lên riêng rẽ trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin 100µg/ml để tách plasmid. Plasmid sau khi tách sạch bằng kit tách plasmid được cắt bằng enzyme giới hạn XbaI để kiểm tra đoạn gen được chèn vào hay không.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC
1-4: pET43- pelC được cắt bằng XbaI; 5: Marker 12kb (Fermentas); 6: plasmid không cắt.
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid trên gel agarose cho thấy mẫu plasmid được phân tích đều xuất hiện một băng DNA plasmid mở vòng với kích thước khoảng 4,2 kb. Kích thước này chính là tổng của chiều dài vector pJET1.2/blunt (3kb) và gen pelC (1,2kb). Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,2kb nhân lên từ chủng Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 đã được chèn vào vector pJET1.2/blunt và được nhân lên trong tế bào E. coli.