Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide chuẩn bị với thành phần như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%)
Thành phần Nồng độ cuối các Thành phần trong gel 12 % 10ml dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamid 12 % 4,0 Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375 M 2,5 10% SDS 0,1 % 0,1 10% APS 0,1 % 0,1 TEMED 0,002% 0,004
Bảng 2.4. Công thức pha gel cô (5%)
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 5 % 3ml dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamid 5 % 0,5 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38 10% SDS 0,1 % 0,03 10% APS 0,1 % 0,03 TEMED 0,001% 0,003
Chuẩn bị mẫu điện di protein ngoại bào
0,5 ml dịch enzyme ngoại bào thu được bằng ly tâm ở phần trên được tủa với 1ml cồn lạnh ở - 20oC qua đêm, sau đó được ly tâm 14.000v/ph trong 10 phút, 4oC. Loại dịch nổi, phần protein lắng phía dưới được làm khô và hòa trở lại trong 30μl Tris 10mM pH6.8, bổ sung 30μl đệm mẫu 2x, biến tính nhiệt ở 95oC trong 5 phút. Làm lạnh trong đá tan sau đó tra mẫu vào điện di. Tra 30 μl vào mỗi giếng điện di.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chuẩn bị mẫu điện di protein nội bào
Hút 10 μl đệm mẫu 2x cho vào 10 μl dịch nội bào (được thu ở mục 2.3.7 ), trộn đều và biến tính như chuẩn bị mẫu điện di dịch ngoại bào. Tra 20 μl mẫu vào mỗi giếng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Để nhân gen pelC từ chủng vi khuẩn ANT/505, trước hết DNA tổng số được tách chiết từ tế bào chủng ANT/505 như mô tả trong phần phương pháp. DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Kết quả điện di cho thấy băng DNA có kích thước lớn, đậm, gọn và không chứa ARN. Điều này chứng tỏ DNA tổng số đảm bảo nồng độ, độ tinh sạch, không bị đứt gãy, là nguyên liệu tốt cho phân tích PCR sau này (hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas
haloplanktis ANT/505 1: DNA Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505,
2: DNA marker (Fermentas).
3.2. Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn
Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505
Trình tự cặp mồi được lựa chọn như sau: PelC-F1/NdeI: ata cat atg caa aaa cat cct cgc a PelC-R1/XhoI: gat ctc gag ttt taa gtc atc aaa gctt
DNA tổng số của vi khuẩn Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 sau khi tách chiết được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen pelC 1193 bp sử dụng mồi xuôi (PelC-F1/NdeI) và mồi ngược
Kb - 10 - 8 - 6 - 5 - 4 - 3 - 2.5 - 2 - 1.5 - 1 - 0.75 - 0.50 - 0.25 1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(PelC-R1/XhoI). Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 1X. Kết quả trên điện di đồ cho thấy trong mẫu DNA được sử dụng làm khuôn mẫu đã khuếch đại một đoạn gen khoảng 1,2 kb đúng như kích thước của gen pelC đã được tính toán từ trước. Điều này chứng tỏ cặp mồi chúng tôi thiết kế rất đặc hiệu và điều kiện phản ứng PCR là phù hợp.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pelC
1: sản phẩm PCR, 2: DNA marker 12kb (Fermentas).
3.3. Kết quả tách dòng gen pelC trong E. Coli
Sau khi được nhân lên bằng PCR từ mẫu DNA vi khuẩn ANT/505, pelC
được phân tách trên gel agarose. Băng DNA 1,2 kb được cắt ra, làm sạch, làm tù đầu và gắn vào vector pJET1.2/blunt (hình 2.2) và biến nạp vào E. coli
DH5α. như đã mô tả trong phần phương pháp (2.3.4). Các thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường thạch đĩa LB chứa ampicilin 100 µg/ml. Những tế bào có chứa vectơ nhưng không mang đoạn gen chèn sẽ không thể sinh trưởng được do gen gây chết (lethal gene) có trong vùng đa điểm nối (multiple cloning site) của vector gây ra. Ngược lại những tế bào mang vector có đoạn gen chèn sẽ làm hỏng gen gây chết (knock out) trong vector làm cho gen này không biểu hiện được do đó tế bào sẽ sống được và phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Kết quả biến nạp chúng tôi thu được các thể biến nạp trên mỗi đĩa môi trường chọn lọc, không có khuẩn lạc nào mọc trên đĩa đối chứng điều này chứng tỏ phản ứng gắn và phương pháp biến nạp đã thành công (hình 3.3). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Băng 1,2 kb
1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin
Các khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc được nhân lên riêng rẽ trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin 100µg/ml để tách plasmid. Plasmid sau khi tách sạch bằng kit tách plasmid được cắt bằng enzyme giới hạn XbaI để kiểm tra đoạn gen được chèn vào hay không.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC
1-4: pET43- pelC được cắt bằng XbaI; 5: Marker 12kb (Fermentas); 6: plasmid không cắt.
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid trên gel agarose cho thấy mẫu plasmid được phân tích đều xuất hiện một băng DNA plasmid mở vòng với kích thước khoảng 4,2 kb. Kích thước này chính là tổng của chiều dài vector pJET1.2/blunt (3kb) và gen pelC (1,2kb). Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,2kb nhân lên từ chủng Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 đã được chèn vào vector pJET1.2/blunt và được nhân lên trong tế bào E. coli.
3.4. Kết quả đọc trình tự gen pelC
Để biết chính xác đoạn gen đã được tách dòng có phải là pelC hay không,
Băng plasmid mở vòng 4,2kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
một plasmid mang đoạn gen khoảng 1,2 kb được chọn để đọc trình tự trên máy đọc trình tự tự động của Viện Công nghệ sinh học. Kết quả đọc trình tự gen cho thấy plasmid pJET 1.2/blunt mang đoạn gen có độ dài 1193 bp đúng như kích thước của gen pelC được công bố trên ngân hàng gen. Khi dịch mã sang protein trình tự này chứa một khung đọc mở cho một protein (hình 3.5). Điều này chứng tỏ gen pelC đã được tách dòng thành công vào E. coli.
gtgcaaaaacatcctcgcactgtcgtatttgcggtatcgggtgtgatcaaattg M Q K H P R T V V F A V S G V I K L gaaggggaacttaaaatatctcatggtaatataacaatcgcggggcaaagttcgccaggt E G E L K I S H G N I T I A G Q S S P G gggattgccattgttggtgctcctgtgacggtctcatccgcagataatgtgattatccgc G I A I V G A P V T V S S A D N V I I R tatatgcgctttcgcttaggcacatttggctatgctgatgattcattaacggtgcgtaat Y M R F R L G T F G Y A D D S L T V R N agtgagaatgtcattattgatcattgttcattgagttggtcggtggatgaaagcgcgagc S E N V I I D H C S L S W S V D E S A S ttttataataaccataactttacgttacaagattcaattatttcacatagtttaagccat F Y N N H N F T L Q D S I I S H S L S H tcaattcaccctaaaggcgatcatggttatggtggcatttggggcggggtaaatgcgagc S I H P K G D H G Y G G I W G G V N A S tttattaataatataattgccaatcatgccagtagaactcctaggctcaatggtcatagg F I N N I I A N H A S R T P R L N G H R ctaaaatcaccgtattcacaaaatgaagagtttgttgagcttatcaataatattattttt L K S P Y S Q N E E F V E L I N N I I F aactggggacataataatgtttatggatcagaaaatggtcgctttaacttgattaataat N W G H N N V Y G S E N G R F N L I N N tactataagccgggtaaagcaagtaagatcatgcagttttgcttatatttggtattcccc Y Y K P G K A S K I M Q F C L Y L V F P cagagatcaaaagaaaatcaggcatatattatgggtaatgtactggagaataacccacaa Q R S K E N Q A Y I M G N V L E N N P Q ctgactgagcataattatttaggtgtaaattatcgcaaagcggttaaagcaaaacgcact L T E H N Y L G V N Y R K A V K A K R T attagtgatgaaaatagccagtggttaagtgatcaagcaatcattacatcacccatgcaa I S D E N S Q W L S D Q A I I T S P M Q acaacgatggtttatgttaatgcaaagcaagcatttagtgatgccattaaggggcaacat T T M V Y V N A K Q A F S D A I K G Q H ataggtgcaagtcgtaatgcacatggctatttccatgacagtattgatacgcttgtttat I G A S R N A H G Y F H D S I D T L V Y caacagctcactgatagtgtcacgataaagaaaaatggtttgattgatcatgagtttgag Q Q L T D S V T I K K N G L I D H E F E ctaattggtaattgggatgcatataaacaggaatttacaggggctcccgcaatcgttgat L I G N W D A Y K Q E F T G A P A I V D gctaatgaagatggtgttgcggatgactggttcaaacagcatcagccgcaattaaaaaat A N E D G V A D D W F K Q H Q P Q L K N gcaactacagcacaggttttgcagcagtacttaaattcacttagcaacaaagaaagtaaa A T T A Q V L Q Q Y L N S L S N K E S K agctttgatgacttaaaataa S F D D L K -
Hình 3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide và amino acid của gen pelC
Trình tự tín hiệu tiết (signal peptide) phỏng đoán bằng phần mềm SinalP được đánh dấu bằng các ký tự gạch chân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC
3.5.1. Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC
Vector pET43b là vector biểu hiện mạnh có kích thước 7275bp, mang một trình tự Nus-tag ở đầu N’ tại vị trí 833 đến 2317, và trình tự His-tag ở đầu C’ tại vị trí 800 đến 817. Vector pET43b chứa promoter T7 có nhiệm vụ khởi đầu quá trình phiên mã. Trình tự Nus-tag của vector được tạo sẵn là một đoạn gen mã hóa cho Nus-tag protein với mục đích làm tăng khả năng biểu hiện của gen ngoại lai. Tuy nhiên mục đích của chúng tôi cần biểu hiện một protein PelC không dung hợp với bất kỳ protein nào cho nên chúng tôi đã thiết kế chèn trình tự pelC vào vị trí NdeI và XhoI để loại bỏ Nus-tag đi. Sau khi cắt pET43b bằng hai enzym XhoI và NdeI trong 2 giờ ở 37oC, sản phẩm cắt được tách trên điện di agarose 0,8%. Kết quả trên hình cho thấy, vector sau khi cắt bằng hai enzym có 2 băng xuất hiện, một băng có kích thước nhỏ (khoảng 2,2kb) là đoạn Nus-tag, một băng có kích thước lớn khoảng hơn 5kb là vector pET43b đã được mở vòng và loại bỏ Nus-tag. Băng vector (kích thước 5kb) được cắt ra và thôi gel để tinh sạch chuẩn bị cho ligation (hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di plasmid pET43b sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 1: pET43b cắt bằng NdeI-XhoI; 2: pET43b không cắt; 3: Thang DNA
chuẩn 12 kb (Fermentas).
Gen biểu hiện pelC được cắt ra từ pJET1.2/pelC đã được tách dòng trong phần 3.3 bằng 2 enzyme NdeI và XhoI. Sản phẩm cắt được phân tách trên điện di agarose sau đó thu băng kích thước 1,2kb để gắn vào vector biểu hiện.
Vector (5kb)
Nus-tag (2,2kb)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.5.2. Phản ứng gắn đoạn gen pelC vào pET43b và biến nạp vào chủng E. coli BL21 coli BL21
Vector pET43b sau khi xử lý với 2 enzyme NdeI-XhoI được ghép nối với gen pelC nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 bằng phương pháp xung điện, sau đó chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trường có chứa kháng sinh ampicillin. Kết quả biến nạp thu được khoảng 200 khuẩn lạc trên một đĩa (hình 3.7), điều này chứng tỏ hiệu quả phản ứng lai ghép khá tốt.
Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector biểu hiện pET43/pelC vào tế bào E. coli BL21(DE3)
3.5.3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của các thể biến nạp trên môi trường thạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thể biến nạp E. coli BL21 mang pET43/pelC (được gọi là BL21/pET43pelC) thu được ở phần trên có đầy đủ yếu tố để biểu hiện được enzyme, tuy nhiên không phải dòng tế bào nào cũng có khả năng biểu hiện được do có thể trong phản ứng lai một số vector tự đóng vòng nên pelC không được gắn vào. Để chọn được các dòng có khả năng biểu hiện PelC, chúng tôi cấy chuyển các khuẩn lạc riêng rẽ sang môi trường LB thạch có chứa 0,2% pectin và 1mM IPTG. Đĩa vi khuẩn được nuôi ở 37oC qua đêm sau đó nuôi tiếp 1 ngày ở 25oC để enzyme ưa lạnh thể hiện hoạt tính enzyme. Hoạt tính pectinase được phát hiện bằng việc nhuộm đĩa thạch với dung dịch Hecxadecyl trimethyl ammonium bromide (HTAB) 0,5%. Kết quả cho thấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
một số thể biến nạp có tạo vòng thủy phân với pectin (hình 3.8), điều này chứng tỏ các dòng này có khả năng biểu hiện pectinase.
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra khả năng tạo vòng thủy phân pectin của các thể biến nạp
3.5.4. Kiểm tra sự có mặt pelC trong các thể biến nạp BL21/pET43pelC
Để kiểm tra xem pelC có mặt trong các thể biến nạp dương tính với pectin hay không, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid của một số thể biến nạp dương tính với pectin và kiểm tra bằng PCR. Kết quả cho thấy tất cả các thể biến nạp dương tính với pectin đều có mặt pelC (hình 3.9), do đó có thể kết luận rằng vector biểu hiện pET43pelC đã được thiết kế thành công.
.
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự có mặt của pelC trong các chủng BL21/pET43pelC
1- 4: Gen pelC được nhân lên bằng PCR từ các dòng khuẩn lạc khác nhau; 5: Đối chứng dương; 6: Thang DNA chuẩn 12kb (Fermentas).
Băng1,2kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.6. Biểu hiện enzyme tái tổ hợp PelC (rPelC) trong môi trƣờng lỏng
Biểu hiện rPelC trong E. coli BL21 ở các nhiệt độ khác nhau
Hệ biểu hiện pRET-T7 và E. coli BL21 (DE3) được thiết kế tối ưu cho biểu hiện gen ngoại lai ở 370C. Tuy nhiên, tùy thuộc vào tính chất của mỗi protein mà các gen mã hóa cho protein sẽ được biểu hiện ở một nhiệt độ tối ưu nào đó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ biểu hiện: 37o
C, 30oC, 25oC. Dòng tế bào BL21/pET43pelC dương tính với pectin trên môi trường thạch được sử dụng để biểu hiện pectinase trong môi trường lỏng. Các bước biểu hiện đã được mô tả trong phần phương pháp. Sau 4 giờ cảm ứng với 1mM IPTG, dịch nuôi được ly tâm 10000 v/ph trong 5 phút, phần dịch nổi (chứa protein ngoại bào) và phần tế bào (chứa protein nội bào và khoang chu chất) được thu nhận riêng rẽ để kiểm tra hoạt tính pectinase và chạy điện di SDS-PAGE. Kết quả cho thấy khi biểu hiện BL21/pET43pelC ở 25oC cho hoạt tính pectinase tương đối cao (30,2 U), và cao nhất ở 30oC (84,5 U). Không thấy hoạt tính pectinase khi biểu hiện ở nhiệt độ 37oC (bảng 3.1). Điều này chứng tỏ nhiệt độ 37oC không phù hợp cho sự biểu hiện enzyme này. Lý do có thể nhiệt độ 37oC làm biến tính enzyme hoặc ảnh hưởng bất lợi trong quá trình đóng gói (folding) của enzyme. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với PelA và PelB của chủng ANT/505 khi biểu hiện trong E. coli trong thông báo trước đây [44].
Bảng 3.1. Hoạt tính pectinase của rPelC khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ biểu hiện Hoạt tính pectinase (U)
Dịch ngoại bào Trong tế bào
25 (oC) 30,2 3.0
30 (oC) 84,5 16,5
37 (oC) 0.0 0.0
Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả điện di protein SDS-PAGE (hình 3.10). Trên bản điện di cho thấy chỉ xuất hiện một băng protein ngoại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bào kích thước khoảng 50 kDa tương đương với chiều dài protein PelC theo tính toán ở mẫu biểu hiện 30oC (hình 3.10A ). Trên điện di protein nội bào hầu như không thấy sự sai khác giữa mẫu đối chứng và mẫu biểu hiện (hình 3.10 B). Điều này chứng tỏ rPelC được tiết ra bên ngoài tế bào và là enzyme ngoại bào. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích trình tự tín hiệu tiết (signal peptide) của PelC bằng phần mềm signalP đã chỉ ra rằng PelC có một trình tự signal peptide dài 51 amino acid (hình 3.5).
A B
Hình 3.10. Kết quả biểu hiện rPelC trong E. coli BL21(DE3) ở 30oC
Điện di protein ngoại bào (A) và nội bào của BL21/pET43pelC (B). 1: mẫu đối chứng âm (BL21/pET43pelC không cảm ứng IPTG); 2: mẫu biểu hiện
(BL21/pET43pelC cảm ứng IPTG sau 4h); 3: Marker chuẩn 200kDa (Fermentas).
3.7. Nghiên cứu một số tính chất của rPelC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.7.1. Hoạt tính pectate lyase của rPelC
Pectinase là một nhóm enzyme phức tạp được phân loại thành 12 enzyme khác nhau. Pectate lyase là một pectinase phân cắt cơ chất pectin acid theo cơ chế chuyển liên kết, sản phẩm tạo thành một liên kết đôi trong phân tử
- 200 kDa - 119 - 66 - 50 - 43 - 29 1 2 3 - 200 kDa - 119 - 66 - 43 - 29 1 2 3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đường galacturonate, do đó chúng có thể dễ dàng được nhận diện thông qua việc phát hiện liên kết đôi ở bước sóng 235 nm bằng máy đo quang phổ. Để khẳng định rPelC có phải là một enzyme pectate lyase hay không, dịch enzyme ngoại bào của BL21/pET43pelC được sử dụng làm phản ứng enzyme với cơ chất pectin acid (90% demethylation). Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp phản ứng được đo trực tiếp trên máy đo quang phổ ở bước sóng 232nm. Kết quả cho thấy giá trị OD ở 232nm khá cao ở mẫu thí nghiệm (OD = 2,6) so với mẫu đối chứng (OD = 0,02) và tỉ lệ thuận với phương pháp đường khử (bảng 3.2). Điều này chứng tỏ rPelC là enzyme pectinase thuộc nhóm pectate lyase.
Bảng 3.2. Phát hiện liên kết đôi trong sản phẩm sau phản ứng phân cắt pectin acid của rPelC
Mẫu thí nghiệm
Phƣơng pháp xác định hoạt tính pectinase
Đường khử (OD 530nm)
Phát hiện nối đôi (OD 232nm)
Dịch enzyme rPelC 2.2 2.6
Dịch lên men BL21 0.01 0.02
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme
Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Mỗi một enzyme đều có một vùng nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu cho phản ứng xúc tác enzyme. Để phát hiện nhiệt độ tối ưu cho phản ứng, dịch